CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN KHÁC NHAU TRONG XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN TIỀN CẤY PHÔI

CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN KHÁC NHAU TRONG XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN TIỀN CẤY PHƠI Sofiva Genomics Giám đốc phòng xét nghiệm/ Tổng giám đốc Double Hong, Ph.D www.sofiva.com.tw Nội dung Thụ tinh ống nghiệm(IVF) Sàng lọc di truyền tiền cấy phôi (PGS) Xét nghiệm di truyền tiền cấy phơi (PGT) Chẩn đốn di truyền tiền cấy phơi (PGD) Phương pháp (PCR, FISH, CGH, SNP, NGS) Thảo luận www.sofiva.com.tw Quy trình thụ tinh ống nghiệm (IVF) Quy trình 1、Giai đoạn kích thích 2、Thu hồi trứng 3、Thu thập tinh trùng 4、Thụ tinh ống nghiệm (IVF) 5、Phôi chuyển hóa 6、Cấy phơi http://ib.bioninja.com.au/standard-level/topic-6-human-physiology/66-hormones-homeostasis-and/in-vitro-fertilisation.html www.sofiva.com.tw Thụ tinh ống nghiệm (IVF) + Xét nghiệm di truyền Quy trình 1、Giai đoạn kích thích 2、Thu hồi trứng 3、Thu thập tinh trùng 4、Thụ tinh ống nghiệm (IVF) (Xét nghiệm di truyền) 5、Phơi chuyển hóa 6、Cấy phơi Xét nghiệm di truyền trước cấy: xét nghiệm di truyền tiền cấy phơi (PGT) www.sofiva.com.tw Quy trình sinh thiết Blastocyst(Trophectoderm biopsy) Blastomere Polar body ICM TE cell Polar body Ưu điểm • • Hạn chế • Khơng xâm lấn Số lượng tế bào lớn để kiểm tra Chỉ phát lỗi người mẹ 8-10 cells Blastocyst Blastomere • • Phát lỗi mẹ bố Q trình sinh thiết thực tốt • • Xâm lấn Dạng thể khảm làm lỗi kết www.sofiva.com.tw • • • Khơng xâm lấn Phát lỗi mẹ bố Dạng thê khảm phát • • Kỹ sinh thiết Quá trình cấy blastomere Hai phương pháp xét nghiệm di truyền tiền cấy phôi Sàng lọc di truyền tiền cấy phơi (PGS) • Xét nghiệm di truyền tiền cấy phôi cho số lượng nhiễm sắc thể chép bất thường nhiễm sắc thể (Viết tắt PGT-A) Chẩn đốn di truyền tiền cấy phơi (PGD) • Xét nghiệm di truyền tiền cấy phôi cho rối loạn đơn (Viết tắt PGT-M) www.sofiva.com.tw PGS vs PGD Sàng lọc di truyền tiền cấy phơi PGS Chẩn đốn di truyền tiền cấy phôi PGD Mục Số lượng bất thường nhiễm sắc thể Rối loạn gen đơn Công nghệ FISH Array-CGH NGS Specific probe (primer) PCR Sanger sequencing STR marker Chỉ định     Phụ nữ lớn tuổi Tiền sử xảy thai nhiều lần Thất bại IVF lặp lặp lại Hiếm muộn www.sofiva.com.tw  Rối loạn đơn gen biết  Xác định HLA Sàng lọc di truyền tiền cấy phôi, PGS PGT-A (còn gọi sàng lọc dị bội) PGS phát lệch bội phôi IVF Đột biến lệch bội xuất lứa tuổi tăng theo tuổi người mẹ Nhiễm sắc thể lệch bội cho biết nguyên nhân gây thất bại IVF Chỉ định làm PGS Phụ nữ lớn tuối (>34 tuổi) Tiền sử sẩy thai nhiều lần Thất bại IVF lặp lặp lại Vơ sinh nam nặng Lựa chọn giới tính www.sofiva.com.tw Trước kia…… Sinh thiết phôi Nhiễm sắc thể bất thường Polar body Single blastomere Blastocyst FISH Xét nghiệm di truyền cho vùng cụ thể có vài nhiễm sắc thể phát đồng thời FISH www.sofiva.com.tw Array-based PGS NGS-based PGS Sinh thiết phôi day or day Phơi thai(s) Khuếch đại tồn bộ gen (WGA) OR phương pháp lai gen có so sánh (array-CGH) Trình tự di truyền hệ sau (NGS) Quan sát tất 23 cặp nhiễm sắc10thể www.sofiva.com.tw Trước kia…… Rối loạn gen đơn Sinh thiết phôi PCR Gel electrophoresis Sequencing PGD cho vùng cụ thể rối loạn di truyền cụ thể - dị tật gen đơn defects lựa chọn phơi bình thường để chuyển 22 Modified PCR-based research Optimized PGD-PCR protocols Nested PCR Multiplex PCR Fluorescent PCR Multiple genes Cải thiện để nhắm mục tiêu nhiều vùng Vẫn giới hạn vùng cụ thể 23 Sự khuếch đại tồn bộ gen (WGA) Phơi thai đơn Khuếch đại toàn bộ gen từ tế bào đơn Phân tích thêm cho nhiều loci Chẩn đốn trực tiếp gián tiếp Hiện multi-loci 25  to monitor contamination Những ưu điểm STR  to monitor WGA experiment  to monitor Allele drop-out (ADO) www.sofiva.com.tw 26 Ví dụ kết PGD Direct genotyping WT genotype Abnormal genotype Linkage analysis Abnormal embryo Not transfer www.sofiva.com.tw Wile type embryo Can transfer 27 Kiểm tra trực tiếp PCR+Sanger sequencing ADO www.sofiva.com.tw 28 Kiểm tra gián tiếp Phân tích liên kết www.sofiva.com.tw 29 Kết PGD cho trường hợp Tổng : 11 phôi thai Major: embryo Wild Type : embryos Carrier: embryos No signal : embryo Embryo transfer pregnancy Father AF Mother 16wks Confirmed by AF30 Trường hợp lâm sàng Đài Loan – Mất thính lục www.sofiva.com.tw www.sofiva.com.tw 31 31 Trường hợp lâm sàng – Xác định HLA beta thalassemia HLA typing HBB genotyping www.sofiva.com.tw 32 PGD cho rối loạn gen đơn phòng thí nghiệm Sofiva www.sofiva.com.tw 33 Genome-wide karyomapping for PGD SNP-array based haplotype analysis Scientific Reports volume6, Article number: 25488 (2016) www.sofiva.com.tw 34 PGD truyền thống vs SNP-based PGD PGD truyền thống SNP-based PGD Công nghệ Specific probe (primer) PCR Sanger sequencing STR marker SNP array Vùng đột biến Cần phải biết trước  Không cần biết trước Coverage Specific gene / locus  Any sites coverage by SNP probes Bất lợi Mất thời gian để thiết kế đầu dò Thiết kế riêng biệt nhiều loci ~ 90 độ xác Tỷ lệ sai ~ 10% tùy thuộc vào bệnh khác www.sofiva.com.tw 35 Chân thành cảm ơn! www.sofiva.com.tw 36