Phương Pháp Chẩn Đoán Bệnh Ký Sinh Trùng Ở Gia Súc, Gia Cầm

PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH KÝ SINH TRÙNG Ở GIA SÚC, GIA CẦM Như biết, bệnh ký sinh trùng gia súc, gia cầm chia làm nhóm lớn: nhóm bệnh giun sán, nhóm bệnh động vật tiết túc ký sinh nhóm bệnh động vật đơn bào ký sinh Trong phạm vi giáo trình này, đề cập chủ yếu đến phương pháp chẩn đoán bệnh giun sán bệnh đơn bào ký sinh gia súc, gia cầm phổ biến vai trò gây bệnh quan trọng giun sán động vật đơn bào ký sinh PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN CÁC BỆNH GIUN, SÁN Có hai cách chẩn đoán bệnh giun, sán: chẩn đoán vật sống chẩn đoán vật chết 1.1 Phương pháp chẩn đoán vật sống Chẩn đoán bệnh giun sán vật sống bao gồm phương pháp: chẩn đoán lâm sàng, chẩn đoán phòng thí nghiệm chẩn đoán miễn dịch 1.1.1 Chẩn đoán lâm sàng Một số bệnh giun, sán có biểu lâm sàng đặc trưng dễ nhận biết như: rối loạn hoạt động thần kinh (đi vòng quanh, co giật bệnh ấu sán não dê, cừu ); ỉa phân trắng bệnh giun đũa bê, nghé Tuy nhiên, đa số bệnh giun sán thường biểu đặc trưng khó phân biệt như: rối loạn tiêu hoá, ăn uống kém, thể trạng gầy, da khô, lông xù Vì vậy, dựa vào triệu chứng lâm sàng để chẩn đoán xác mà cần phải có phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm 1.1.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm Mục đích phương pháp tìm giun, sán trưởng thành, trứng ấu trùng giun, sán phân nghiên cứu định tính định lượng * Kỹ thuật lấy phân để xét nghiệm: Trong đất chuồng có chứa số lượng lớn trứng ấu trùng giun tròn sông tự Khi gia súc, gia cầm thải phân, trứng ấu trùng giun tròn sống tự dính vào phân, gây khó khăn cho việc xét nghiệm chẩn đoán Vì vậy, cần lấy phân trực tiếp qua hậu môn vật Phân vật để riêng vào túi ngon sạch, mẫu khoảng 20 - 30 gam, có nhãn ghi số thứ tự mẫu, tuổi, tính biệt, khối lượng vật, địa điểm thu thập mẫu Mẫu phân phải đưa phòng thí nghiệm sở nghiên cứu để xét nghiệm (vì trứng nhiều loài giun tròn nhiệt độ 20 - 30 0C cao hơn, sau 16 - 18 nở ấu trùng nên việc xét nghiệm chẩn đoán khó khăn Mặt khác, thời gian này, ấu trùng giun phổi Dictyocaulus lột xác lần thứ trở nên hoạt động hơn, nên gặp khó khăn phân ly ấu trùng phương pháp Baerman) Nếu mẫu phân chưa xét nghiệm cần bảo quản nhiệt độ 10 C, thời gian bảo quản không ngày 1.1.2.1 Nghiên cứu định tính Là phương pháp xác định có loài giun sán ký sinh gia súc, gia cầm, tức tìm giun sán trưởng thành đất sán dây, trứng ấu trùng giun sán phân Đây phương pháp thông dụng để đánh giá tình hình nhiễm giun sán đàn gia súc, gia cầm * Phương pháp tìm giun sán trưởng thành Để tìm giun sán trưởng thành đốt sán dây thải theo phân (đặc biệt tẩy giun sán thăm dò), dùng que bới phân quan sát mắt thường quan sát kỹ hậu môn vật (có thể phát đoạn sán dây lủng lẳng hậu môn dê, chó, gà) Thường thu gom toàn phân vật vào chậu hoà tan nước, để lắng, gạn nhiều lần cặn lắng gạn nước để tìm giun sán cặn * Phương pháp tìm trứng giun sán Có nhiều phương pháp tìm trứng giun sán, đạt hiệu cao đơn giản, dễ làm là: phương pháp phù Fullebom (1927), phương pháp Darling, phương pháp Cherbovick phương pháp gạn rửa sa lắng Benedek (1943) - Phương pháp Fullebom: phương pháp phù dễ làm rẻ tiền Nguyên tắc phương pháp lợi dụng dung dịch muối ăn (Nacl) bão hoà có tỷ trọng d = 1,18, lớn tỷ trọng trứng giun sán, làm cho trứng giun sán lên bề mặt dung dịch Phương pháp Fullebom phát tốt trứng giun tròn, trứng sán quan sinh sản gia cầm Oocyst cầu trùng Dung dịch nước muối bão hoà pha cách: cho tinh thể muối ăn (Nacl) vào chậu nồi nước sôi, vừa cho vào vừa khuấy muối không hoà tan (thường dùng 380 - 400 gam muối tinh thể không ngậm nước, 450 gam muối tinh thể ngậm nước) Để nguội, dung dịch muối bão hoà dùng để xét nghiệm trứng giun sán - Phương pháp Darling: phương pháp phù có độ xác cao, dụng cụ thao tác có phức tạp so với phương pháp Fullebom Trong phương pháp Darling, dung dịch nước muối bão hoà (Nacl) sử dụng làm dung dịch xét nghiệm chẩn đoán, song cần có máy ly tâm để thực phương pháp Sau hai lần ly tâm, trứng giun sán, Oocyst cầu trùng dễ dàng lên bề mặt dung dịch nước muối bão hoà Đồng thời, tiêu làm từ phương pháp Darling loại bỏ cặn tốt nên "sạch" hơn, dễ phát trứng giun sán hơn, đặc biệt dễ phát Oocyst cầu trùng so với tiêu làm từ phương pháp Fullebom - Phương pháp Cherbovick: phương pháp có độ xác cao xét nghiệm trứng giun sán Cách tiến hành phương pháp Cherbovick gồm hai lần ly tâm phương pháp Darling, song tuỳ mục đích chẩn đoán mà dùng dung dịch bão hoà khác (dung dịch ma giê sunfat bão hoà, dung dịch nam hyposunfit bão hoà) Phương pháp gạn rửa sa lắng (còn gọi phương pháp lắng cặn trứng giun sán): nguyên tắc phương pháp dùng nước lã tách trứng giun sán khỏi phân Trứng giun sán có tỷ trọng lớn tỷ trọng nước lã chìm xuống, thu nhận để quan sát chẩn đoán kính hiển vi Phương pháp gạn rửa sa lắng phát tốt trứng sán gan, trứng sán cỏ, trứng sán ruột lợn, đốt sán dây Nếu để lắng cặn 30 - 60 phút phát trứng giun đũa số trứng giun tròn có kích thước lớn khác Chú ý, xét nghiệm phân cần phân biệt trứng giun sán với cặn thức ăn, bào tử nang nấm, trứng loài tiết túc có phân, phải phân biệt đặc điểm hình thái loại trứng (hình 36, 37, 38, 39, 40) Trứng giun sán thường có lớp vỏ, nhẵn lồi lõm, trứng có phôi bào ấu trùng Hình 36 Những vật trứng giun sán Tế bào thực vật; Lông thực vật Xơ thực vật; Tế bào xoắn thực vật Bào tử nấm; Hạt phấn hoa Giọt mỡ Fasciola hepatica ParBmphistomum cervi Thysaniezia ovilla Moniezia expansa M benedeni Dicrocoelium Strongyloides papillosus Gongylonema pulchrum Tnchuns globulosa 10 Fascio/a gigantica 11 Nematodirus spathiger 12 Gaigeria pachyscelis 13 Tnchostrongylus sp 14 Skrjabinema ovis 15 AvitellinB centnpunctata 16 Chbertia ovina 17 Haemochus contortus 18 Bunostomum trigonocephalum 19 Oesophagostomum columbianum 20 Cotylophoron cotylophorum 21 Fascioloides magna 22 Ostertagia circumcinata 23 Cooperia sp 24 Neoascaris vitulorum Hình 37 Trứng giun sán ký sinh gia súc nhai lại Parascans equorum Strongylus spp Trichonema spp Triodontophorus tenuicollis Anoplocephala spp Gastrodiscus aegyptiacus Strongyloides westen Dictyocaulus amneldi Oxyuris equi 10 Paranoplocephala mamillana 11 Habronema spp 12 Fasciola hepatica Hình 38 Trứng giun sán ký sinh ngựa Ascaris suum Fasciola hepatica Paragonimus sp Ascarops strongylina Stephanurus dentatus Trichocephalus suis Metastrongylus sp Oesophagostomum detatum Hyostrongylus rubidus 10 Physocephalus sexalatus 11 Brachylaemus sp 12 Macracanthor hynchus birundi neceus 13 Globocephalus sp 14 Schistosoma suis Hình 39 Trứng giun sán ký sinh lợn Ascandia gam Heterakis gallinarum Subulura brumpti Prosthogonimus sp Strongyloides avium Tetrameres ameriacana Acuaria spiralis Acuaria bamulosa Gongylonema ingluvicola 10 Syngamus trachea 11 Hartertia gallinarum 12 Oxyspirura mansoni 13 Capillana annulata 14 Capillaria retusa Capillaria columbae 16 Capillaria 1ongico1lis Hình 40 Trứng giun sán ký sinh gia cầm * Phương pháp tìm ấu trùng giun sán Một số loài giun tròn (ví dụ, loài thuộc giống giun tròn Dictyocaulus), sản phẩm thải theo phân ký chủ trứng mà ấu trùng Hoặc, giun tròn thuộc họ Trychostrongylidae đẻ trứng có hình thái kích thước tương đối giống nhau, vào trứng việc chẩn đoán phân biệt giống loài khó khăn Trứng giun tròn lại có đặc điểm nở thành ấu trùng tồn phát tán ngoại cảnh Lợi dụng đặc điểm mà ta nuôi để trứng nở thành ấu trùng, vào hình thái ấu trùng cảm nhiễm để chẩn đoán bệnh Có phương pháp phân ly ấu trùng sau: - Phương pháp Baerman Phương pháp Baerman chủ yếu dựa nguyên tắc là, ấu trùng di chuyển khỏi phân vào nước lắng xuống đáy Dùng phễu có đường kính - 10 cm, cuối phễu lắp ống cao su dài 10 - 15 cm, cuối ống cao su lắp ống nghiệm Đặt lưới thép vải lên miệng phễu, cho đầy nước ấm 37 - 380C, lưới thép đặt 10 - 15 gam phân (nếu phân viên dê, cừu - 12 viên) Để yên 30 phút - giờ, lấy cặn ống nghiệm quan sát kính hiển vi để tìm ấu trùng Cần ý rằng, nhiệt độ 20 - 30 0C, Sau 18 - 24 giờ, trứng số giun tròn thuộc Strongylata (như Oesophagostomum) nở ấu trùng, khó phân biệt với ấu trùng Dictyocaulus Vì vậy, tốt xét nghiệm ngay, không để phân qua đêm Hiện nay, Việt Nam thay phương pháp Baemlan phương pháp Essen Donalson có cải tiến - phương pháp Thanh - Châu, dựa theo nguyên tắc phương pháp Baerman, phương pháp đơn giản, nhanh có hiệu cao (Nguyễn Vũ Thanh Nguyễn Ngọc Châu, 1993) - Phương pháp Vaida Phương pháp Vaida đơn giản so với phương pháp Baemlan, thường dùng để tìm ấu trùng phân gia súc có dạng viên phân dê, cừu Đặt - viên phân vào đĩa petri cho vào nước ấm Sau 15 - 30 phút vớt viên phân bỏ đi, nước hộp lồng đem quan sát kính lúp kính hiển vi tìm ấu trùng Phương pháp áp dụng dễ dê, cừu hiệu thấp phương pháp Baerman Trong đường tiêu hoá gia súc nhai lại có nhiều loài giun tròn thuộc Strongylida ký sinh, trứng chúng có hình thái gần giống nhau, nở thành ấu trùng khó phân biệt loài với loài khác Tuy nhiên, dạng ấu trùng cảm nhiễm thuộc Strongylida khác số lượng hình dạng tế bào ruột, kích thước ấu trùng phần mút đuôi chúng Ví dụ, phân biệt số ấu trùng cảm nhiễm thuộc Strongylida sau (hình 42) Ấu trùng giun tròn Dictyocaulus: mút đuôi hình nón, ruột chứa đầy hạt màu sáng Ấu trùng giun tròn Haemonchus: mút đuôi gai, thực quản dài khoảng 1/5 chiều dài thể Ấu trùng giun tròn Trichostrongylus: mút đuôi có gai, thực quản dài khoảng 1/4 chiều dài thể Ấu trùng giun tròn Oesophagostomum: có 20 - 32 tế bào ruột, mút đuôi vuốt dài Ấu trùng giun tròn Bunostomum: ruột ống dài không phân chia thành tế bào riêng biệt Hình 42 Các dạng ấu trùng cảm nhiễm Strongylida - Haemonchus contortus; - Cooperia; - Trichostrongylus; - Ostertagia; - Chabertia; - Oesophagostomum columbianum; - O venulosum; - Bunostomum; - Nematodirus (theo Poliakov, 1953) 1.1 2.2 Nghiên cứu định lượng Để đếm số lượng trứng ấu trùng giun sán phân, dùng phương pháp sau: * Phương pháp đếm trứng Stoll Cho gam phân vào ống có vạch đo, cho dung dịch NaOH 0,1N tới vạch 75 ml Khuấy đũa thuỷ tinh cho tan phân dừng lại đột ngột, dùng pipet lấy 0,05 ml nước phân loãng cho lên phiến kính, đậy kính quan sát kính hiển vi Số trứng đếm nhân với 32 cho biết số trứng gam phân Tốt nên làm vài lần để lấy số trung bình Có thể dùng phương pháp phù gạn rửa sa lắng để đánh giá hiệu thuốc sau tẩy giun sán mà không thiết phải dùng phương pháp Stoll Trong trường hợp phải lấy số lượng phân nhau, dụng cụ phải kích thước, dung dịch dùng xét nghiệm phải So sánh số trứng giọt váng bề mặt thị trường kính hiển vi (Nguyễn Thị Lê cs, 1996) * Phương pháp đếm trứng Mc Master (hình 43) Phương pháp dùng để xác định số lượng trứng giun tròn, trứng sán dây Oocyst cầu trùng gam phân buồng đếm Mc Master Cân gam phân vào cốc thuỷ tinh, thêm 56 ml dung dịch nước muối bão hoà, khuấy cho tan phân Lọc qua lưới thép vào cốc khác khuấy Trong khuấy, lấy công tơ hút hút dung dịch phân nhỏ đầy hai buồng đếm Mc Master (mỗi buồng đếm có dung tích 0,5 ml) Để yên phút kiểm tra kính hiển vi (độ phóng đại 10 x l0) Trong thực tế, để dễ phát dễ đếm trứng, cải tiến sau: + Bước l: cân gam phân vào cốc thuỷ tinh, thêm nước lã (khoảng 100 150 ml), khuấy tan phân, lọc bỏ cặn bã thô Nước lọc để lắng - giờ, gạn bỏ nước, giữ lại cặn + Bước 2: cho 56 mi dung dịch nước muối bão hoà, khuấy cho tan cặn Trong khuấy, lấy công tơ hút hút mi dung dịch phân nhỏ đầy buồng đếm Mc Master Để yên phút kiểm tra kính hiển vi (độ phóng đại 10 x l0) Đếm toàn số trứng ô hai buồng đếm, tính theo công thức sau: (Tổng số trứng hai buồng đếm số trứng có lưu dung dịch phân) Theo Jorgen Han sen Buôn Peny (1994), mức độ nhiễm số loài giun tròn vào số trứng/1 gam phân dê sau: Giun tròn Nhiễm hỗn hợp có Haemonchus Nhiễm hỗn hợp không Haemonchus có Haemonchus Trichostrongylus oesophagostomum Mức độ nhiễm (số trứng/gam phân) Nhẹ 80 - 800 Trung bình 800 - 200 Nặng Trên 1.200 300 - 800 800 - 000 Trên 000 100 - 2.000 2.000 - 7.000 Trên 7.000 00 - 500 500 - 2.000 Trên 2.000 00 - 800 800 - 600 Trên 1.600 1 Phương pháp chẩn đoán bệnh giun sán miễn dịch Các bệnh giun sán thể mức độ miễn dịch nhiều khác giống nguyên lý miễn dịch bệnh truyền nhiễm Vì vậy, chẩn đoán bệnh giun sán miễn dịch Hiện có nhiều phương pháp như: phương pháp miễn dịch huỳnh quang, phương pháp miễn dịch men ELISA Tuy nhiên, khó khăn phương tiện việc chế kháng nguyên chuẩn, nên phương pháp sử dụng thú y nước ta 1.2 Phương pháp chẩn đoán vật chết 1.2.1 Các phương pháp mổ khám giun sán Những phương pháp chủ yếu tìm giun sán ấu trùng giun sán quan nội tạng mổ khám xác vật chết ưu điểm phương pháp mổ khám 10 biết xác thành phần loài giun sán ký sinh mức độ nhiễm nặng hay nhẹ Tuỳ theo mục đích mổ khám mà có ba phương pháp: phương pháp mổ khám toàn diện, phương pháp mổ khám giun sán quan, phương pháp mổ khám không toàn diện Skrjabin K I (1928) Mổ khám toàn diện phương pháp mổ khám giun sán tất quan, tổ chức thể gia súc, gia cầm (phát giun, sán xoang mắt, xoang miệng, xoang mũi, xoang ngực, xoang bụng, mô não; toàn hệ tiêu hoá, kể gan, tuỵ; hệ hô hấp; hệ tiết; hệ sinh dục; tổ chức da) Mổ khám không toàn diện phương pháp mổ khám loài giun sán thể gia súc, gia cầm Ví dụ, để phát sán cỏ phải mổ khám túi dày loài nhai lại, ruột non, ruột già, gan, mật, xoang bụng, thận (bởi sán cỏ non có mặt nhiều nơi khác thể) Mổ khám giun sán quan phương pháp phát tất loài giun, sán ký sinh quan thể Ví dụ, mổ khám giun, sán quan tiêu hoá 1.2.2 Phương pháp kiểm tra thịt nội tạng để phát giun sán Trong thịt gia súc có giun sán ký sinh, ví dụ: Cysticercus sp (ấu trùng sán dây Taenia sp.), ấu trùng giun bao (Trichinella spiralis) * Kiểm tra tươi Mục đích: tìm Cysticercus sp tổ chức Để tìm dạng ký sinh trùng này, dùng dao sắc cắt ngang bắp thịt vai, mông, đùi, lưỡi, vừa cắt vừa quan sát bề mặt nhát cắt Ấu trùng Cysticercus sp sán dây Taenia sp có dạng hạt gạo, dài khoảng 0,5 mm hơn, màu trắng đục Các dạng ấu trùng nói phát mắt thường cách dễ dàng xem tươi tổ chức * Kiểm tra tổ chức phương pháp ép cơ, tiêu Mục đích: tìm ấu trùng giun bao Trichinetla spiralis Thường lấy chân hoành cách mô để làm phương pháp: ép tiêu (vì vị trí thường có nhiều ấu trùng giun bao) Thực phương pháp ép dụng cụ ép chuyên dụng Còn phương pháp tiêu thực với dung dịch tiêu Kết là: tiêu ép cơ, có thấy ấu trùng giun bao kén có hình xoắn ốc Trong dung dịch tiêu cơ, bị tiêu hết, nang kén chứa ấu trùng giun bao * Kiểm tra nội tạng 11 Chủ yếu kiểm tra tươi để phát ấu trùng Cysticercl/s tenllicollis ký sinh bề mặt gan, lách, màng treo ruột, màng mỡ chài gia súc Ấu trùng Cysticercus tenuicollis có dạng bọc to nhỏ không đều, bọc có nhiều nước đầu sán dây dính màng bọc Có thể phát Cys tenuicollis dễ dàng xem tươi mắt thường PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐƠN BÀO KÝ SINH Đơn bào (Protozoa) ký sinh gồm nhiều giống loài khác nhau, ký sinh vị trí khác thể: amip, cầu trùng, trùng lông, trùng roi ký sinh đường ruột; nhục bào tử trùng ký sinh cơ; đơn bào ký sinh máu Có nhiều biện pháp chẩn đoán bệnh đơn bào ký sinh Các phương pháp thường dùng gồm: 2.1 Phương pháp xét nghiệm phân Đối với động vật lớn trâu, bò, ngựa trực tiếp dùng tay lấy phân từ trực tràng vật Đối với dê, cừu, chó dùng tay kích thích vào hậu môn dùng Syringne (không có kim) bơm vào hậu môn - mm glyxerin để kích thích thải phân Lấy khay hứng phân cho vào lọ thuỷ tinh hộp nhựa có nắp đậy kín, đưa phòng thí nghiệm để xét nghiệm ngày 2.1.1 Phương pháp xét nghiệm cầu trùng ký sinh (Eimeria sp., Isospora sp ) Các loài cầu trùng giống Eimeria, Isospora, Criptosporidia ký sinh đường tiêu hoá trâu, bò, dê, cừu, lợn, gà Sản phẩm trình sinh sản vô tính hữu tính xen kẽ tế bào biểu mô ruột gia súc, gia cầm xuất theo phân, gọi nang trứng hay noãn nang (Oocyst) Số lượng Oocyst phân lên tới hàng trăm nghìn/1 gam phân Để chẩn đoán bệnh cầu trùng, cần dựa vào triệu chứng lâm sàng vật bệnh đặc điểm dịch tễ học Nhưng thiết phải tìm thấy bệnh có kết luận xác Có thể tìm cầu trùng phương pháp xem tươi (phương pháp trực tiếp) Phương pháp dễ làm dụng cụ đơn giản độ xác thấp, phải làm - 10 tiêu bản/mẫu phân thấy Oocyst cầu trùng Oocyst cầu trùng có tỷ trọng nhỏ (d < ) nên dễ lên bề mặt dung dịch có tỷ trọng lớn Trên sở mà dùng phương pháp làm phong phú đơn bào danh bày mục sau) để phát Oocyst cầu trùng Phương pháp thường dùng phương pháp Fullebom với dung dịch muối NaCl bão hoà Tuy nhiên, qua thực tế nghiên cứu cầu trùng bệnh cầu trùng gà lợn, thấy phương pháp vừa lắng cặn, vừa làm Darling phát cầu trùng tốt so với phương pháp Fullebom (thời gian nhanh hơn, tiêu hơn, Oocyst dễ dàng hơn) 12 Muốn xác định cường độ nhiễm cầu trùng gia súc, gia cầm ứng dụng phương pháp đếm trứng giun sán Stoll đếm số lượng Oocystlgam phân buồng đếm Mc Master 2.1.2 Phương pháp xét nghiệm Amip (Entamoeba sp.) Amip gây bệnh lỵ đơn bào ký sinh ruột già (đại tràng), thuộc giống Entamoeba, họ Amoebidae, Amoebida, lớp giả túc trùng Rhizopoda Von Siebold, 1845 Chúng đơn bào mà thể khối chất nhầy, tạo giả túc (chân giả) để di động sinh sản hình thức phân đôi Trong phân, amip dạng amip lớn hoạt động, dạng amip nhỏ hoạt động chuyển thành bào nang (kén) Vì vậy, để phát chúng cần phải có phương pháp khác * Phương pháp xét nghiệm amip lớn amip nhỏ hoạt động Dạng thấy bệnh lỵ tiến triển Phải xét nghiệm phân mới, không lẫn nước tiểu thấy amip vận động Nếu để điều kiện lạnh amip chết nên khó phát kính hiển vi Trường hợp xét nghiệm xa nên mang kính hiển vi đến xem chỗ, lấy phân cho vào lọ kín, bên quấn vải thấm nước nóng 37(lc đưa xét nghiệm phòng thí nghiệm Lấy chỗ phân có lẫn chất nhầy, lẫn máu để xét nghiệm trước dùng thuốc điều trị cho gia súc Dùng tăm lấy chất nhầy phân, phết lên phiến kính, soi kính hiển vi Có thể xem tươi trực tiếp nhỏ giọt Biểu metylen 1% nhuộm màu xem vận động amip Bằng phương pháp thấy hai loài amip ký sinh ruột: Entamoeba histolytica, Entamoeba coli Trong đó, loài E histolytica nguyên nhân gây bệnh lỵ amip Khi bệnh lỵ tiến triển thấy loài hai dạng: - Dạng amip lớn hoạt động: kích thước khoảng 20 - 40 μm, thể màng nguyên sinh chất (vỏ) nên hình thái thay đổi (trong giây di chuyển đoạn dài 50 em) Nguyên sinh chất chia làm hai lớp: lớp lớp Lớp nguyên sinh chất bên có cấu trúc hạt không bào, không bào có 40 hồng cầu Nhân có kích thước - μm, tổ chức hình lưới có trung thể hạt nhiễm sắc bên nối tiếp thành chuỗi, tạo thành hình dáng tương tự hình bánh xe - Dạng amip nhỏ hoạt động: kích thước khoảng 15 - 25 μm nhỏ hơn, hoạt động yếu loại amip trên, lớp nguyên sinh chất không phân biệt rõ, không bào hồng cầu, nhân có nhiễm sắc vùng ngoại vi dày đặc hơn, tạo hình thể vành Trong giai đoạn chưa gây bệnh, amip từ dạng hào nang chuyển sang dạng amip nhỏ hoạt động sinh sản ngược lại Chu kỳ tiếp tục mãi người súc vật mang amip hoàn toàn không phát bệnh, xảy sau đợt bệnh 13 phát thể cấp tính Khi gặp điều kiện đặc biệt, amip dạng nhỏ hoạt động, ăn hồng cầu trở thành amip dạng lớn hoạt động gây bệnh, chu kỳ trở thành chu kỳ gây bệnh Khi điều kiện sống thay đổi, amip dạng lớn hoạt động không nua hồng cầu chuyển thành amip dạng nhỏ hoạt động, chuyển thành bào nang (kén amip) (Nguyễn Thế Khánh, Nguyễn Tử Dương, 2001) * Phương pháp xét nghiệm thể bào nang (kén amip) Trong thời kỳ xen kẽ hai đợt tiến triển bệnh, phân amip mà bào nang (kén) Trong thời kỳ bệnh tiến triển, bào nang lẫn với amip Thể bào nang sống dai dẳng, tồn lâu đại tràng, lẫn với phân Thể bào nang có phân số người chó khoẻ chưa mắc bệnh Thể bào nang xuất phân thất thường, cần xét nghiệm lại nhiều lần Phân xét nghiệm phải chọn chỗ có lẫn chất nhầy Trường hợp chưa xét nghiệm cho phân vào lọ, cho vào ml formol 5% để bảo tồn bào nang Có thể xét nghiệm phân trực tiếp (xem tươi) nhuộm lugol Cần phân biệt kén loài Entamoeba histolytica với loài Entamoeba coli theo bảng sau: Bảng Phân biệt kén loài Entamoeba histolytica với loài Entamoeba coli Phân biệt Kích thước Entamoeba histolytica Dạng lớn Dạng nhỏ Entamoeba coli Lớp NSC 20 - 40 μm Rõ 15 - 20 μm Không rõ 15 - 20 μm Không rõ Lớp NSC Thường có hầu cầu Không có hồng cầu Chân giả Nhiều Ít Không có hồng Ít Hoạt động Mạnh Yếu Yếu Xem tươi khó thấy Xem tươi dễ thấy Xem tươi dễ thấy Nhân Ghi chú: NSC - nguyên sinh chất Đôi xét nghiệm không thấy kén, người ta thụt thuốc tẩy nhẹ để xuất nhiều kén phân Tuy nhiên, cần thận trọng để tránh gây nên tiến triển cF~p tính bệnh, làm cho thể bị yếu tạo thay đổi đại tràng, làm cho kén trở lại dạng amip gây bệnh * Phương pháp truyền amip cho động vật thí nghiệm Nếu xét nghiệm cho kết nghi ngờ, người ta truyền vào hậu môn mèo khoảng 10 mi phân có dịch nhầy vào máu súc vật bệnh Nếu mèo mắc bệnh lỵ amip, phân có amip loài Entamoeba histolytica, mổ khám thấy đại tràng mèo có thương tổn amip gây kết luận chắn súc vật bị 14 bệnh lỵ amip * Phương pháp miễn dịch huỳnh quang Goldman (1953 - 1954) dùng kháng thể huỳnh quang để phân biệt hai loài amip Phương pháp miễn dịch huỳnh quang sử dụng nhiều để đánh dấu kháng thể Khi hiệu giá kháng thể đạt từ 1/100 trở lên coi dương tính (Nguyễn Thế Khánh Nguyễn Tử Dương, 2001) 2.1.3 Phương pháp xét nghiệm trùng roi (Tnchomonas sp.) Trùng roi động vật đơn bào có roi đầu đuôi di chuyển Các ký sinh trùng di chuyển nhanh nên xem tươi trực tiếp cần cố định chúng formol hay nhuộm Luôm, thấy thể bào nang trùng roi Các loài trùng roi thường thấy đường ruột gia súc là: - Trichomonas intestinalis: dài 10 - 15 cm, rộng - 10 cm, có - roi, có roi phía sau tạo thành vòng vây rõ Ít thấy thể bào nang loại Loài trùng roi thường không gây bệnh, gây viêm ruột, ỉa chảy súc vật non - Giardia intestinalis: dài 10 - 20 cm, rộng - 10 μm, hình đối xứng, có nhân trông mắt kính roi phía sau Chúng ký sinh tá tràng, manh tràng túi mật Thể bào nang theo phân nguồn lây nhiễm cho súc vật Bào nang có hình bầu dục, dài 10 - 13 cm, rộng - cm, thường có hai nhân Ký sinh trùng gây viêm ruột mãn tính, gây viêm túi mật, viêm gan 2.1.4 Phương pháp làm phong phú đơn bào xác định cường cảm nhiễm đơn bào (dùng để phát cầu trùng, trùng roi, trùng lông, kén amip phân) * Phương pháp làm phong phú đơn bào Các phương pháp dựa nguyên lý: dùng dung dịch có tỷ trọng lớn tỷ trọng đơn bào để làm cho đơn bào lên bề mặt dung dịch, gọi phương pháp làm phong phú đơn bào Phương pháp làm phong phú đơn bào gồm có: phương pháp Fullebom; phương pháp vừa lắng cặn, vừa làm Darling; phương pháp vừa lắng cặn, vừa làm Cherbovick; phương pháp Theater… Dung dịch dùng làm phong phú đơn bào, dung dịch NaCl bão hoà, dùng dung dịch MgSO4 bão hoà, dung dịch nam hyposunfit bão hoà, dung dịch glyxerin 50%, dung dịch đường saccaroza 50% Các dung dịch làm phong phú trứng dùng để phát đơn bào phân như: cầu trùng (Eimeria sp., Isospora sp., Cryptosporidia sp.), trùng roi (Trichomonas 15 sp) kén amip * Phương pháp xác định cường độ cảm nhiễm đơn bào Xác định cường độ cảm nhiễm đơn bào cách đếm số lượng đơn bào theo phương pháp đếm trung giun sán Stoll đếm buồng đếm Mc Master, từ tính số lượng đơn bào gam phân 2.2 Phương pháp kiểm tra thịt Trong thịt gia súc có ký sinh trùng đơn bào ký sinh, ví dụ: Sarcocystis sp (bào tử trùng thịt) * Kiểm tra tươi Để tìm Sarcocystis sp., dùng dao sắc cắt ngang bắp thịt vai, mông, đùi, lưỡi, vừa cắt vừa quan sát bề mặt nhát cắt Sarcocystis sp trưởng thành nang kén có kích thước tương đối lớn, dài khoảng chí Thể ký sinh trùng non có hình dạng đám nguyên sinh chất nhỏ, có nhân, dầy 10 - 20 μm, có vân, nằm tế bào bắp Đám lớn dần lên, kéo dài theo chiều thớ thịt trở thành dạng trưởng thành Các dạng ký sinh trùng nói phát mắt thường cách dễ dàng xem tươi tổ chức 2.3 Phương pháp kiểm tra máu Kiểm tra máu nhằm phát ký sinh trùng đường máu như: Trypanosoma sp., Piroplasma sp (Babesia sp.) * Lấy máu để kiểm tra Đối với gia súc (trâu, bò, dê, ngựa, lợn), dùng kẻo vô trùng cắt nhẹ đầu tai dùng kim tiêm vô trùng chọc ngang mạch máu nhỏ đầu tai sau cắt lông sát trùng Đối với động vật thí nghiệm (chuột bạch, chuột lang) cố định đầu nắm đuôi kẻo mạnh cắt chóp đuôi Đối với gia cầm chim dùng kim đâm vào tĩnh mạch cánh để lấy máu * Kiểm tra máu tươi Cho giọt máu vào phiến kính khô, sạch, đặt kính lên giọt máu cho giọt máu dàn mỏng (có thể nhỏ vào cạnh kính giọt dung dịch natri citrat 2% để máu chậm đông, dễ kiểm tra hơn) Kiểm tra kính hiển vi, độ phóng đại 10 x 20 10 x 40 Phương pháp kiểm tra máu tươi phát loài tiên mao trùng sống (Trypanosoma sp.) * Kiểm tra tiêu máu nhuộm màu Phương pháp kiểm tra tiêu máu nhuộm màu phương pháp thường dùng để 16 phát hầu hết loài ký sinh trùng ký sinh máu (kể ký sinh trùng ký sinh huyết tương hồng cầu) Kỹ thuật dàn máu phiến kính: chuẩn bị phiến kính tẩy mỡ cách rửa xà phòng thật sạch, ngâm vào cồn 960, trước dùng lưu khô khăn mềm xơ Chọn kính kích thước x cm, mỏng tốt, rìa thật phẳng nhẵn Đặt giọt máu nhỏ lên đầu phiến kính, cách bờ phiến kính khoảng lem Đặt cạnh kính lên giọt máu, nghiêng 450 với phiến kính Khi giọt máu tràn khắp cạnh kính đẩy kính phía trước, làm cho máu dàn thành lớp mỏng phiến kính (máu dàn theo kính bị kính đẩy đi) Cố định tiêu cồn methanol Để khô tiêu nhuộm Giemsa từ 30 - 60 phút (dung dịch Giemsa pha theo tỷ lệ: dung dịch Giemsa phần, nước cất trung tính phần) Rửa tiêu vòi nước chảy nhẹ, vẩy để khô Kiểm tra tiêu kính hiển vi vật kính dầu, độ phóng đại 10 x 90 10 x 100 (có dầu Cedre - dầu bạch dương) Phương pháp phát ký sinh trùng đường máu: Trypanosoma sp., Theileria sp., Babesia sp (Piroplasma sp., Anaplasma sp.) 2.4 Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm Khi gia súc nhiễm ký sinh trùng đường máu, số lượng ký sinh trùng ít, xét nghiệm máu chưa tìm thấy ký sinh trùng lấy máu vật nghi mắc bệnh tiêm truyền cho động vật mẫn cảm với loài ký sinh trùng Trong thể động vật thí nghiệm, ký sinh trùng sinh sản nhanh, làm cho động vật thí nghiệm có biểu lâm sàng, kiểm tra máu động vật thí nghiệm dễ tìm thấy ký sinh trùng Tuỳ theo loài ký sinh trùng mà động vật thí nghiệm chuột bạch, chuột lang, thỏ (đối với tiên mao trùng T evansi), bê (đối với lê dạng trùng Piroplasma bigeminum) Các bước cần tiến hành gồm: chuẩn bị động vật mẫn cảm với ký sinh trùng định tiêm truyền, lấy máu vật nghi mắc bệnh (sử dụng dung dịch nam citrat 2% để chống đông máu), tiêm truyền máu vật nghi mắc bệnh cho động vật thí nghiệm, truyền vào phúc mạc tĩnh mạch, theo dõi động vật thí nghiệm sau tiêm truyền (triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm máu động vật thí nghiệm tìm ký sinh trùng đường máu) 2.5 Các phương pháp chẩn đoán miễn dịch bệnh đơn bào đường máu * Phương pháp miễn dịch ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay) Phương pháp ELISA dùng để phát kháng nguyên (còn gọi ELISA kháng nguyên) Nantulya Lindquist mô tả năm 1989 Các báo cáo kết sử dụng phương pháp cho thấy, kỹ thuật ELISA nhậy so với phương pháp giám định khác đặc hiệu với loài Trypanosoma sp 17 Phương pháp ELISA gián tiếp sử dụng đĩa nhựa gắn kháng nguyên biết Kháng thể nghi có huyết vật nghi mắc bệnh kết hợp với kháng nguyên gắn vào địa Sau đó, kháng thể kháng lại IgG bò gắn với men Peroxydase nhỏ vào kết hợp với kháng thể có huyết cần xét nghiệm Sự có mặt men Peroxydase phát nhờ chất (Substrate) với xuất mầu Tuỳ theo chất làm mầu (Chromogene) mà đọc kết sử dụng kính đọc khác Phương pháp EusA gồm bước sau: Bước : gắn kháng nguyên vào đĩa nhựa, ủ đĩa 37 0C ủ qua đêm 40C Bước 2: rửa đĩa lần dung dịch PBS (Phosphat Buffered Saline) Bước : nhỏ huyết nghi Ủ đĩa 370C Bước 4: rửa đĩa lần dung dịch PBS Bước 5: nhỏ IgG thỏ dê kháng IgG bò gắn với men Peroxydase Ủ đĩa 37 C Bước 6: rửa đĩa lần dung dịch PBS Bước 7: nhỏ chất Bước 8: đọc kết quang phổ kế (Spectrophotometer) Độ nhậy phương pháp ELISA phát kháng thể đạt đến 90 - 95% hầu hết tác giả thừa nhận * Các phương pháp huyết học Một vài kỹ thuật phát kháng thể khảo nghiệm để chẩn đoán bệnh ký sinh trùng đường máu gây động vật, bao gồm: phương pháp ELISA địa nhựa (Luckins, 1977) phương pháp ngưng kết cam (thường gọi phương pháp CARD TEST) Nhìn chung, phương pháp có độ nhậy cao tính đặc hiệu thấp Đôi phương pháp có phản ứng chéo nên phân biệt loài với Ngoài ra, phương pháp huyết học xác định vật mắc bệnh chưa xác định tình trạng bệnh lúc chẩn đoán (vì lúc chẩn đoán vật khỏi bệnh kháng thể huyết thanh) Trong phương pháp huyết để chẩn đoán bệnh đơn bào đường máu gây phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFAT: Indirect Fluorescent Antibody Test) coi phương pháp thích hợp để phát kháng thể đặc hiệu loài (species/specific antibodyl Phương pháp Wilson (1969) Katende cs (1987) cải tiến bước chuẩn bị kháng nguyên, cố định đơn bào tươi lên tiêu hỗn hợp Aceton lạnh 80% Fonnalin 0,25% 18 Theo Plant cs (1976), Well cs (1982), bước tiến hành sau: Bước : chuẩn bị tiêu dàn máu vật mắc bệnh ký sinh trùng đường máu nặng (hoặc tiêu từ huyễn dịch chứa ký sinh trùng) Để khô điều kiện nhiệt độ môi trường cố định cồn Aceton (hoặc hỗn hợp Aceton lạnh 80% Formalin 0,25%), để phút Bước 2: dùng bút chì mỡ vẽ vòng tròn có đường kính mm vùng khác vùng dàn tiêu Bước 3: dùng pipet hút huyết nghi pha loãng 1/40 nhỏ riêng rẽ vào vòng tròn vừa khoanh tiêu Chú ý vòng tròn phủ kín huyết Bước 4: ủ hỗn hợp kháng nguyên - huyết nghỉ 30 phút tủ ấm 370C Bước 5: rửa tiêu lần dung dịch PBS, lần phút 0C Có lắc nhẹ Để khô tiêu nhiệt độ phòng Bước 6: nhỏ kháng thể IgG thỏ dê kháng IgG bò gắn với thuốc.nhuộm huỳnh quang - nuorescent isothiocyanate Bước 7: ủ rửa tiêu trên, tráng nước cất Để khô tiêu nhiệt độ phòng Bước 8: gắn lamen với dung dịch PBS Glycerin kiểm tra kính hiển vi huỳnh quang * Phương pháp phát ADN đơn bào phản ứng PCR (Polymerase Châm Reaction) PCR phương pháp đại nhất, đưa vào ứng dụng để chẩn đoán vài bệnh ký sinh trùng đường máu Nguyên lý phản ứng PCR dựa vào phản ứng chuỗi Polymerase để xác định có mặt ADN ký sinh trùng đường máu động vật Phương pháp PCR có độ nhậy độ xác cao, song phương pháp đòi hỏi phải có trang thiết bị dại kỹ thuật cao Hiện nay, phương pháp PCR thử nghiệm số phòng thí nghiệm đại 19 TÀI LIỆU THAM KHẢO * Tiếng Việt Drozdz J Malczewski ( 1971) , Nội ký sinh vật bệnh ký sinh vật gia súc Việt Nam, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội, Tr 10 - 19 Lương Văn Huấn Lê Hữu Khuông (1997), Ký sinh bệnh ký sinh gia súc, gia cầm Nhà xuất nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh, Tr 168, 187 - 189 Phạm Văn Khuê Phan Lục (1996), Ký sinh trùng thú y, Nhà xuất nông nghiệp, Hà Nội, Tr 39 - 46, 289 - 290 Phạm Sỹ Lăng, Tô Long Thành (2006), Bệnh đơn bào ký sinh vật nuôi, Nhà xuất nông nghiệp, Hà Nội, Tr 12 - 33 Phan Địch Lân, Nguyễn Thị Kim Lan, Nguyễn Văn Quang (20021, Bệnh ký sinh trùng đàn dê Việt Nam, Nhà xuất nông nghiệp, Hà Nội, Tr - 21 Nguyễn Thị Lê, Phạm Văn Lực, Hà Duy Ngọ, Nguyễn Văn Đức, Nguyễn Thị Minh (1996), Giun sán ký sinh gia súc Việt Nam, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội, Tr 13 - Trịnh Văn Thịnh (1963), Ký sinh trùng thú y, Nhà xuất nông thôn, Hà Nội, Tr 69 - 71, 86 - 90, 119 - 147 * Tiếng Anh Johannes Kaufmann, (1996), Parasitic infections ofdomestic animals Birkhauser Verlag, Basel, Boston, Berlin P - 22 Jorgen Han sen and Brijan Pery (1994), The epidemiology, diagnosis and control of Helminth parasites of Ruminants Hang book, P 32 - 33 20 MỤC LỤC Trang PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH KÝ SINH TRÙNG Ở GIA SÚC, GIA CẦM … 1 PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN CÁC BỆNH GIUN, SÁN 1.1 Phương pháp chẩn đoán vật sống …1 1.2 Phương pháp chẩn đoán vật chết …10 PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐƠN BÀO KÝ SINH 12 2.1 Phương pháp xét nghiệm phân 12 2.2 Phương pháp kiểm tra thịt .….16 2.3 Phương pháp kiểm tra máu …16 2.4 Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm 17 2.5 Các phương pháp chẩn đoán miễn dịch bệnh đơn bào đường máu .17 TÀI LIỆU THAM KHẢO 20 ... Essen Donalson có cải tiến - phương pháp Thanh - Châu, dựa theo nguyên tắc phương pháp Baerman, phương pháp đơn giản, nhanh có hiệu cao (Nguyễn Vũ Thanh Nguyễn Ngọc Châu, 1993) - Phương pháp... phương pháp vừa lắng cặn, vừa làm Darling phát cầu trùng tốt so với phương pháp Fullebom (thời gian nhanh hơn, tiêu hơn, Oocyst dễ dàng hơn) 12 Muốn xác định cường độ nhiễm cầu trùng gia súc, gia cầm... (Tnchomonas sp.) Trùng roi động vật đơn bào có roi đầu đuôi di chuyển Các ký sinh trùng di chuyển nhanh nên xem tươi trực tiếp cần cố định chúng formol hay nhuộm Luôm, thấy thể bào nang trùng roi