Nghiên cứu đặc điểm một số gen điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin liên quan đến tính chịu hạn của cây ngô nếp địa phương

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN –––––––––––––––––– PHẠM THỊ THANH NHÀN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ GEN ĐIỀU HÒA SINH TỔNG HỢP ANTHOCYANIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY NGƠ NẾP ĐỊA PHƢƠNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN –––––––––––––––––– PHẠM THỊ THANH NHÀN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ GEN ĐIỀU HÒA SINH TỔNG HỢP ANTHOCYANIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY NGƠ NẾP ĐỊA PHƢƠNG Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TS LÊ TRẦN BÌNH THÁI NGUYÊN - 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với tác giả khác Các số liệu, kết nghiên cứu luận án trung thực, phần đƣợc đăng Tạp chí khoa học chuyên ngành, Kỷ yếu hội nghị Công nghệ sinh học GenBank, với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần kết cịn lại chƣa đƣợc cơng bố Tác giả NCS Phạm Thị Thanh Nhàn LỜI CẢM ƠN Tơi xin đƣợc bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Lê Trần Bình tận tình hƣớng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ động viên suốt q trình nghiên cứu hồn thiện luận án Tôi xin đƣợc trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ, đặc biệt PGS.TS Chu Hoàng Hà, TS Lê Văn Sơn, ThS Hoàng Hà ThS Lê Hoàng Đức thuộc Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng, Phịng Thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện tốt nhất, hƣớng dẫn kỹ thuật thí nghiệm góp ý chun mơn để tơi hồn thành đƣợc đề tài Tôi xin cảm ơn giúp đỡ đồng tác giả Tôi xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh- Kỹ thuật nông nghiệp, Trƣờng Đại học Sƣ phạm- Đại học Thái Nguyên, cán khoa tạo điều kiện, động viên tơi học tập hồn thiện luận án, đặc biệt giúp đỡ Thầy, Cô Bộ mơn Di truyền- SHHĐ nhƣ GS.TS Chu Hồng Mậu, PGS.TS Nguyễn Thị Tâm, CN Nguyễn Thị Hồng Chuyên (Phịng thí nghiệm Hóa Sinh), CN Nguyễn Ích Chiến (Phịng thí nghiệm Di truyền & Cơng nghệ gen) Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trƣờng, Phòng Quản lý đào tạo Sau Đại học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành đề tài Tơi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo cán Viện Nghiên cứu Ngô Đan Phƣợng- Hà Nội tạo điều kiện cung cấp giống ngô nếp địa phƣơng thông tin giống Cuối cùng, xin đƣợc gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đồng hành, chia sẻ tơi, khuyến khích tơi hoàn thành luận án Tiến sĩ Thái Nguyên, tháng 10 năm 2014 Nghiên cứu sinh Phạm Thị Thanh Nhàn i MỤC LỤC Trang Mục lục i Danh mục kí hiệu chữ viết tắt iv Danh mục bảng vii Danh mục hình ix MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu Những đóng góp luận án Ý nghĩa khoa học thực tiễn Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây ngô 1.1.1 Sơ lƣợc ngô 1.1.2 Giá trị dinh dƣỡng kinh tế ngô 1.1.3 Tình hình sản xuất ngô giới Việt Nam …… 1.2 Phản ứng ngô trƣớc tác động hạn 10 1.2.1 Mối liên quan tác động hạn tính chống chịu stress ơxy hóa 10 1.2.1.1 Mối liên quan hạn stress oxy hóa 10 1.2.1.2 Các dạng oxy hoạt hóa 12 1.2.1.3 Hệ thống bảo vệ trồng khỏi tác động oxy hóa 13 1.2.2 Cơ sở sinh lý, sinh hoá sinh học phân tử tính chịu hạn ngơ 14 1.2.2.1 Cơ sở hình thái, sinh lý, hóa sinh tính chịu hạn 14 1.2.2.2 Cơ sở sinh học phân tử tính chịu hạn ngô 17 1.3 Anthocyanin vai trị chuyển hóa dạng oxy hoạt hóa 20 1.3.1 Vai trò anthocyanin thực vật bị hạn 20 1.3.2 Gen điều hồ tổng hợp anthocyanin ngơ … 27 1.3.2.1 Nhân tố phiên mã điều hòa biểu gen 27 1.3.2.2 Nhân tố phiên mã tham gia trình tổng hợp anthocyanin 30 ii 1.4 Ứng dụng real- time PCR nghiên cứu mức độ biểu gen tham gia sinh tổng hợp anthocyanin 34 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1 Vật liệu nghiên cứu 40 2.2 Địa điểm nghiên cứu, hoá chất thiết bị 40 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 41 2.3.1 Nhóm phƣơng pháp hố sinh 41 2.3.2 Đánh giá nhanh khả chịu hạn số giống ngơ địa phƣơng 45 2.3.3 Nhóm phƣơng pháp sinh học phân tử ……………………………… 47 2.3.3.1 Phƣơng pháp tách RNA tổng số theo kit Trizol (Invitrogen) 47 2.3.3.2 Phƣơng pháp RT- PCR ……………………………………… 47 2.3.3.3 Tạo vector tái tổ hơp ………………………………………… 49 2.3.3.4 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5 49 2.3.3.5 Kiểm tra sản phẩm chọn dòng ………………………………… 49 2.3.3.6 Tách plasmid …………………………………… 49 2.3.3.7 Xác định trình tự gen …………………………………… 51 2.3.3.8 Phƣơng pháp real- time PCR 51 2.3.4 Phƣơng pháp xử lý kết tính tốn số liệu 53 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………………………… 54 3.1 Đánh giá khả chịu hạn 10 giống ngô nếp địa phƣơng 54 3.1.1 Khả chịu hạn 10 giống ngô nếp địa phƣơng giai đoạn hạt nảy mầm 54 3.1.1.1 Ảnh hƣởng hạn đến hàm lƣợng đƣờng hoạt độ - amylase 54 3.1.1.2 Ảnh hƣởng hạn đến biến đổi hoạt độ protease 57 3.1.2 Đánh giá khả chịu hạn 10 giống ngô giai đoạn non 58 3.1.2.1 Tỷ lệ thiệt hại 10 giống ngô bị hạn ……………………… 58 3.1.2.2 Chỉ số chịu hạn tƣơng đối kiểu gen 10 giống ngô điều kiện hạn nhân tạo 61 3.1.3 Phân nhóm 10 giống ngơ nếp nghiên cứu theo mức độ chịu hạn 63 3.2 Ảnh hƣởng hạn nhân tạo đến lƣợng anthocyanin ngô nếp iii địa phƣơng 65 3.2.1 Sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin rễ 10 giống ngô qua ngƣỡng xử lý hạn nhân tạo 65 3.2.2 Sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin 10 giống ngô qua ngƣỡng xử lý hạn nhân tạo 67 3.2.3 Sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin thân mầm bẹ 10 giống ngô qua ngƣỡng xử lý hạn nhân tạo 70 3.2.4 Sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin thân bẹ ngô qua ngƣỡng xử lý hạn nhân tạo so với đối chứng 73 3.3 Phân tích trình tự đoạn gen B, Lc giống NH BS1 78 3.3.1 Đặc điểm trình tự đoạn gen B giống NH BS1 78 3.3.2 Đặc điểm trình tự đoạn gen Lc giống NH BS1 85 3.3.3 Đặc điểm cấu trúc protein thuộc họ bHLH ngô 91 3.4 Định lƣợng mức độ biểu gen B Lc phản ứng realtime PCR 93 3.4.1 Định lƣợng mức độ biểu gen B giai đoạn 93 3.4.2 Định lƣợng mức độ biểu gen Lc giai đoạn 97 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 103 Kết luận ………………………………………………………… 103 Đề nghị………………………………………………… 103 CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN LUẬN ÁN 104 TÀI LIỆU THAM KHẢO ……………………………………………… 105 PHỤ LỤC 127 PHỤ LỤC 128 PHỤ LỤC 131 PHỤ LỤC 132 iv NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt ABA Abscisic acid Axit abscisic ANR Anthocyanidin reductase Enzyme chuyển hóa flavan-3-ol ANS Anthocyanidin synthase Enzyme chuyển hóa tạo anthocyanidin APX Ascorbate peroxidase Enzyme chuyển hố H2O2 thành H2 O bHLH Binding helix- loop- helix Protein họ bHLH Bp Base pair Cặp bazơ nitơ C1 Colored aleurone Gen C1 cDNA Complementary DNA DNA sợi đôi đƣợc tổng hợp từ mRNA nhờ enzyme phiên mã ngƣợc CHI Chalcon isomerase Enzyme chuyển hóa chalcon CHP CHS Cây hồi phục Chalcone synthase Enzyme xúc tác tổng hợp chalcon CSCHTĐ Chỉ số chịu hạn tƣơng đối CKH Cây không héo DEPC Diethyl pyrocarbonate Chấ t ức chế enzyme phân hủy RNA DFR Dihydroflavonol reductase Enzyme chuyển hóa tạo leucoanthocyanidin DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic (ADN) DNase Deoxyribonuclease Enzyme thủy phân liên photphodieste phân tử DNA DRE Dehydration responsive Yếu tố đáp ứng với hydrat hóa element ĐC Đối chứng kết v % so với đối chứng %ĐC F3‟H Flavonoid 3‟ hydroxylase Enzyme chuyển hóa naringenin F3‟5‟H Flavonoid 3‟,5‟ hydroxylase Enzyme chuyển hóa naringenin HBV Hepatitis B virus Virus viêm gan B HCV Hepatitis C virus Virus viêm gan C HP Hồi phục KLK Khối lƣợng khô KLT Khối lƣợng tƣơi KNGN Khả giữ nƣớc LAR LEA Leucoanthocyanidin Enzyme xúc tác tổng hợp flavan-3- reductase ols Late embryo abundant protein giai đoạn muộn trình hình thành phơi Lc (LC) Leaf colour Gen Lc mRNA Messenger RNA ARN thông tin MGPT chaperon Môi giới phân tử MW Molecular weight Khối lƣợng phân tử NADP Nicotinamide adenine Coenzym đƣợc sử dụng phản dinucleotide phosphate ứng đồng hóa Nicotinamide adenine Chất đƣợc tạo nên khƣ̉ NADP NADPH dinucleotide phosphate-oxidase PAL Phenylalanine ammonialyase Enzyme chuyển hóa L-phenylalanine Pl Purple Gen Pl Pr1 Red aleurone Protein chuyên trách tổng hợp pelargonidin tạo Aleurone màu đỏ PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic (ARN) vi Reverse transcription- Phản ứng khuếch đại cDNA từ polymerase chain reaction mRNA nhờ enzyme phiên mã ngƣợc ROS Reactive oxygen species Các dạng oxy hoạt hóa SOD Superoxide dismutase Enzyme xúc tác phản ứng loại bỏ RT- PCR superoxide SNP Single nucleotide Đa hình nucleotit đơn polymorphism TFs Transcription factors Các nhân tố phiên mã, hay yếu tố phiên mã 3GT UFGT Flavonoid 3‟ Enzyme xúc tác phản ứng tạo glucosyltransferase flavonol 3-O-beta-D-glucoside flavonoid 3-O- Enzyme xúc tác phản ứng O- glucosyltransferase glycosyl hóa 118 enzymes revealed by the crystal structure of Arabidopsis aspartate kinase”, Plant Cell, 18(7), 1681- 1692 114 Merzlyak M N., Chivkunova O B., Solovchenko A E., Naqvi K R (2008), “Light absorption by anthocyanins in juvenile, stressed, and senescing leaves”, J Exp Bot., 59(14), 3903- 3911 115 Miller G., Shulaev V., Mittler R (2008), “Reactive oxygen signaling and biotic stress”, Physiol Plant, 133(3), 481- 489 116 Moeini Alishah H., Heidari R R., Hassani A., Asadi Dizaji A (2006), “Effect of water stress on some morphological and biochemical characteristics of purple basil (Ocimam basili cam)”, J Biol Sci., (4), 763- 767 117 Mol J.N., Grotewald E., Koes R (1998), “How genes paint plants and seeds”, Trends in Plant Science, 3, 212– 217 118 Morgenstern B., Atchley W R (1999), “Evolution of bHLH transcription factors: Modula evolution by domain shuffling?”, Mol Biol Evol., 16(12), 1654- 1663 119 Moscou M J., Bogdanove A J (2009), “A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors”, Science, 326 (5959), 1501- 1506 120 Moumeni A., Satoh K., Kondoh H., Asano T., Hosaka A., Venuprasad R., Serraj R., Kumar A., Leung H., Kikuchi S (2011), “Comparative analysis of root transcriptome profiles of two pairs of drought-tolerant and susceptible rice near-isogenic lines under different drought stress, BMC Plant Biology, 11, 174, doi 10.1186/1471-2229-11-174 121 Muir S R., Collins G J., Robinson S., Hughes S G., Bovy A., Ric De Vos C H., van Tunen A J., Verhoeyen M E (2001), “Overexpression of petunia chalcone isomerase in tomato results in fruit containing 119 dramatically increased levels of flavonols”, Nat Biotechnol., 19(5), 470474 122 Murakami P F., Schaberg P G., Shane J B (2008), “Stem girdling manipulates leaf sugar concentrations and anthocyanin expression in sugar maple trees during autumn”, Tree Physiology, 28(10), 1467– 1473 123 Neill S O., Gould K S., Kilmartin P A., Mitchell K A., Markham K R (2002), “Antioxidant capacities of green and cyanic leaves in the sun species, Quintinia serrata”, Functional Plant Biology, 29, 1437– 1443 124 Neill S O., Gould K S (2003), “Anthocyanins in leaves: light attenuators or antioxidants?”, Functional Plant Biology, 30, 865– 873 125 Noda Y., Kneyuki T., Igarashi K., Mori A., Packer L (2000), “Antioxidant activity of nasunin, an anthocyanin in eggplant peels”, Toxicology, 148(2-3), 119- 123 126 Nogva H K., Rudi K., Naterstad K., Holck A., Lillehaug D (2000), “Application of 5‟- nuclease PCR for quantitative detection of Listeria monocytogenes in pure cultures, water, skim milk, and unpasteurized whole milk”, Appl Environ Microbiol., 66(10), 4266- 4271 127 Olsen O –A (2007), Endosperm: Developmental and Molecular Biology, ISBN 978- 3- 540- 71234- Springer Berlin Heidelberg New York, 129- 136 128 Owen J B., Butterfield D A (2010), “Measurement of oxidized/reduced glutathione ratio”, Methods Mol Biol., 648, 269- 277 129 Palmer S., Wiegand A P., Maldarelli F., Bazmi H., Mican J M., Polis M., Dewar R L., Planta A., Liu S., Metcalf J A., Mellors J W., Coffin J M (2003), “New real-time reverse transcriptase initiated PCR assay with single sensitivity for human immunodeficiency virus type RNA in plasma”, J Clin Microbiol., 41(10), 4531- 4536 120 130 Paolocci F., Robbins M P., Madeo L., Arcioni S., Martens S., Damiani F (2007), “Ectopic expression of a basic helix-loop-helix gene transactivates parallel pathways of proanthocyanidin biosynthesis Structure, expression analysis, and genetic control of leucoanthocyanidin 4-reductase and anthocyanidin reductase genes in Lotus corniculatus”, Plant Physiol., 143(1), 504- 516 131 Pattanaik S., Xie C H., Kong Q., Shen K A., Yuan L (2006), “Directed evolution of plant basic helix-loop-helix transcription factors for the improvement of transactivational properties”, Biochim Biophys Acta., 1759(6), 308- 318 132 Pattanaik S., Xie C H., Yuan L (2008), “The interaction domains of the plant MYC-like bHLH transcription factors can regulate the transactivation strength”, Planta, 227(3), 707- 715 133 Pattanaik S., Kong Q., Zaitlin D., Werkman J R., Xie C H., Patra B., Yuan L (2010), “Isolation and functional characterization of a floral tissue-specific R2R3 MYB regulator from tobacco”, Planta, 231(5), 1061– 1076 134 Pérez-Rodríguez P., Rio-Pachón D M., Guedes Corrêa L G., Rensing S A., Kersten B., Mueller-Roeber B (2010), “PlnTFSDB: updated content and new features of the plant transcription factor database”, Nucleic Acids Res., 38, 822– 827 135 Peter Thompson (2005), “Speciality corns: Waxy, High Amylose, High Oil, and High Lysine Corn”, http ://o hio line.osuu.edu/agf-fact/0112.html 136 Piskacek S., Gregor M., Nemethova M., Grabner M., Kovarik P., Piskacek M (2007), “Nine amino acid transactivation establishment and prediction utilities”, Genomics, 89(6), 756- 768 domain: 121 137 Polle A (2001), “Dissecting the superoxide dismutase-ascorbate peroxidase-glutathione pathway in chloroplasts by metabolic modelling Computer simulations as a step towards flux analysis”, Plant Physiol., 126(1), 445– 462 138 Postollec F., Falentin H., Pavan S., Combrisson J., Sohier D (2011), “Recent advances in quantitative PCR (qPCR) applications in food microbiology”, Food Microbiol., 28(5), 848- 861 139 Poustka F., Irani N G., Feller A., Lu Y., Pourcel L., Frame K., Grotewold E (2007), “Trafficking pathway for anthocyanins overlaps with the endoplasmic reticulum to vacuole protein sorting route in Arabidopsis and contributes to the formation of vacuolar inclusions”, Plant Physiol., 145(4), 1323– 1335 140 Radicella J P., Turks D., Chandler V L (2005), “Cloning and nucleotit sequence of a cDNA encoding B-Peru, a regulatory protein of the anthocyanin pathway in maize”, Plant Mol Biol., 17(1), 127– 130 141 Ramsay N A., Glover B J (2005), “MYB–bHLH–WD40 protein complex and the evolution of cellular diversity”, Trends in Plant Sci., 10(2), 63- 70 142 Ramzzotti S., Filippetti I., Intrieri C (2008), “Expression of genes associated with anthocyanin synthesis in red purplish, pink, pinkish green and green grape berries from mutated 'Sangiovese' biotypes: A case study”, Vitis, 47(3), 147– 151 143 Ray H., Yu M., Auser P., Blahut-Beatty L., McKersie B., Bowley S., Westcott N., Coulman B., Lloyd A., Gruber M Y (2003), “Expression of anthocyanins and proanthocyanidins after transformation of alfalfa with maize Lc”, Plant Physiol., 132(3), 1448- 1463 122 144 Reddy A M., Reddy V S., Scheffler B E., Wienand U., Reddy A R (2007), “Novel transgenic rice overexpressing anthocyanidin synthase accumulated a mixture of flavonoids leading to an increased antioxidant potential”, Meta Eng., 9(1), 95- 111 145 Rhodes D (2008), Anthocyanin biosynthesis (maize and Arbidopsis genes), http://www.hort.purdue.edu/rhodcv/hort640c/secprod/se00013.htm 146 Roby G., Harbertson J F., Adams D A., Matthews M A (2004), “Berry size and vine water deficits as factors in winegrape composition: Anthocyanins and tarinins”, Aust J Grape Wine Res., 10(2), 100- 107 147 Sharma S., Villamor J G., Verslues P E (2011), “Essential role of tissue specific proline synthesis and catabolism in growth and redox balance at low water potential”, Plant Physiol., 157(1), 292- 304 148 Schemske D W., Bierzychudek P (2001), “Evolution of flower color in the desert annual Linanthus parryae”, Evolution, 55(1), 1269- 1282 149 Schmittgen T D., Zakrajsek B A., Mills A G., Gorn V., Singer M J., Reed M W (2000), “Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction to study mRNA decay: comparison of end oint and real-time methods”, Anal Biochem., 285(2), 194- 204 150 Seki M., Narusaka M., Abe H., Kasuga M., Yamaguchi-Shinozaki K., Carninci P., Hayashizaki Y., Shinozaki K (2001), “Monitoring the expression pattern of Arabidopsis genes under drought DNA cold stresses by using a full length cDNA microarray”, Plant Cell, 13 (1), 61- 72 151 Selinger D A., Chandler V L (2001), “B-Bolivia, an allele of the maize b1 gene retrotransposon with variable related expression, sequence Physiol., 125(3), 1363- 1379 contains immediately a high upstream”, copy Plant 123 152 Selma M V., Martínez-Culebras P V., Aznar R (2008), “Real-time PCR based procedures for detection and quantification of Aspergillus carbonarius in wine grapes”, Int J Food Microbiol., 122(1-2), 126- 134 153 Smirnoff N (2005), Antioxidants and Reactive Oxygen Species in Plants, Blackwell Publishing Ltd, UK 154 Solfanelli C., Poggi A., Loreti E., Alpi A., Perata P (2006), “Sucrose specific induction of the anthocyanin biosynthetic pathway in Arabidopsis”, Plant Physiol., 140(2), 637– 646 155 Spackman E and Suarez D L (2008), “Type A influenza virus detection and quantitation by real-time RT-PCR”, Methods Mol Biol., 436, 19– 26 156 Springob K., Nakajima J., Yamazaki M., Saito K (2003), “Recent advances in the biosynthesis and accumulation of anthocyanins”, Nat Prod Rep., 20(3), 288- 303 157 Srivalli B., Sharma G., Khanna-Chopra R (2003), “Antioxidative defense system in an upland rice cultivar subjected to increasing intensity of water stress followed by recovery”, Physiol Plant., 119(4), 503- 512 158 Stintzing F C., Carle R (2004), “Functional properties of anthocyanins and betalains in plants, food, and in human nutrition”, Trends in Food Science & Technology, 15(1), 19– 38 159 Stirnimann C U., Petsalaki E., Russell R B., Müller C W (2010), “WD40 proteins propel cellular networks”., Trends Biochem Sci., 35 (10), 565– 574 160 Strader D B., Wright T., Thomas D L., Seeff L B (2004), “Diagnosis, management, and treatment of hepatitis C”, Hepatology, 39(4), 1147– 1171 124 161 Su J., Wu R (2004), “Stress inducible synthesis of proline in transgenic rice confers faster growth under stress conditions than that with constitutive synthesis”, Plant Science, 166(4), 941- 948 162 Swigoňová Z., Bennetzen J L., Messing J (2005), “Structure and evolution of the r/b chromosomal regions in rice, maize and sorghum”, Genetics, 169(2), 891- 906 163 Szankowski I, Li H., Flachowsky H., Fischer T C., Hanke M V, Forkmann G., Treutter D., Schwab W., Hoffmann T (2007), “Maize Lc transcription factor enhances biosynthesis of anthocyanins, distinct proanthocyanidins and phenylpropanoids in apple (Malus domestica Borkh)”, Planta, 226(5), 1243- 1254 164 Tanyolaỗ D., Ekmekỗi Y., ĩnalan (2007), Changes in photochemical and antioxidant enzyme activities in maize (Zea mays L.) leaves exposed to excess copper”, Chemosphere, 67(1), 89– 98 165 Teif V B., Rippe K (2009), “Predicting nucleosome positions on the DNA: combining intrinsic sequence preferences and remodeler activities”, Nucleic Acids Res., 37 (17), 5641- 5655 166 Teif V B., Rippe K (2010), “Statistical mechanical lattice models for protein-DNA binding in chromatin”, J Phys Condens Matter., 22 (41), 4105- 4124 167 VanGuilder H D., Vrana K E., Freeman W M (2008), “Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis”, Biotechniques, 44(5), 619- 626 168 van Nimwegen E (2003), “Scaling laws in the functional content of genomes”, Trends Genet., 19 (9), 479- 484 169 Vanacker H., Sandalio L M., Jiménez A., Palma J M., Corpas F J., Mesequer V., Gómez M., Sevilla F., Leterrier M., Foyer C H., del Río L 125 A (2006), “Roles for redox regulation in leaf senescence of pea plants grown on different sources of nitrogen nutrition”, J Exp Bot., 57(8), 17351745 170 Vernimmen D., De Gobbi M., Sloane-Stanley J A., Wood W G., Higgs D R (2007), “Long-range chromosomal interactions regulate the timing of the transition between poised and active gene expression”, EMBO J., 26(8), 2041- 2051 171 Wärnmark A., Treuter E., Wright A P., Gustafsson J Å (2003), "Activation functions and of nuclear receptors: molecular strategies for transcriptional activation", Mol Endocrinol., 17 (10), 1901- 1909 172 Wilkinson S., Davies W J (2002), “ABA based chemical signalling: the co-ordination of responses to stress in plants”, Plant Cell Environ., 25(2), 195- 210 173 Winkel-Shirley B (2001),” Flavonoid biosynthesis: a colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology”, Plant Physiol., 126(2), 485- 493 174 Winkel-Shirley B (2002), “Biosynthesis of flavonoids and effects of stress”, Curr Opin Plant Biol., 5(3), 218- 223 175 Wong M L., Medrano J F (2005), “Real-time PCR for mRNA quantitation”, Biotechniques, 39(1), 75- 85 176 Xu C., Min J (2011), “Structure and function of WD40 domain proteins, Protein Cell, 2(3), 202- 214 177 Yamada M., Morishita H., Urano K., Shiozaki N., Yamaguchi Shinozaki K., Shinozaki K., Yoshiba Y (2005), “Effects of free proline accumulation in petunias under drought stress”, J Exp Bot., 56(417), 1975- 1981 126 178 Zimmermann I M., Heim M A., Weisshaar B., Uhrig J F (2004), “Comprehensive identification of Arabidopsis thaliana MYB transcription factors interacting with R/B-like BHLH proteins”, Plant J., 40(1), 22- 34 Tài liệu mạng 179 http://www.angelfire.com/un/giantcrops/maize.html 180 Kirstie Saltsman (2013), http://www.biologyreference.com/Ce- Co/Control-of-Gene-Expression.htm, Copyright © 2013 Advameg, Inc 181 http://www.ces.ncsu.edu/nreos/forest/topics/leafco~1.html 182 http://www.gene-quantification.de/real-time-pcr-guide-biorad.pdf 183 Fao Statistical Yearbook (2013), http://www.fao.org/docrep/018/i3107e/i3107e00.htm, 159- 161 184 http://www.maizegenetics.net/drought-tolerance 185 http://www.maizegdb.org/ 186 The Oxford English Dictionary (2007), http://www.websters-onlinedictionary.org/definitions/maize?cx 187 http://www.nal.usda.gov/fnic/foodcomp/search 188 Trung tâm nghiên cứu ngô Bắc Kinh (2005), http://petikam.tripod.com/id11.html 189 US Grains Council, Value Enhanced Grains Quality Report (2001), http://www.vegrains.org/english/varieties-waxycorn.htm 190 College of Agriculture (2003), http://web.aces.uiue.edu/value/factsheets/cor/faet-waxy-corn.htm 191 Wise M J (2003), A computational reanalysis of late embryogenesis abundant proteins and their possible roles BMC Bioinformatics 4:52, http://www.biomedcentral.com/1471- 2105/4/52 127 PHỤ LỤC Bảng 1.1 Hình thái kích thƣớc hạt 10 giống ngô nếp địa phƣơng TT Giống Chiều cao Màu (cm) sắc thân Màu Kích thƣớc hạt (mm) Khối lƣợng vỏ hạt 1000 hạt (g) Dài Rộng Dày BN 190,11±0,76 Xanh Trắng 250,60± 1,14 9,60±0,11 10,00±0,06 5,10±0,03 BS1 166,71±1,10 Xanh Trắng 187,70± 1,51 9,90±0,23 DG2 168,41±0,80 Xanh Trắng 242,30± 0,92 9,70±0,09 9,00±0,18 5,10±0,05 ĐX2 156,88±1,16 Xanh Trắng 231,50± 1,10 10,00±0,06 9,30±0,22 4,80±0,10 KL 182,84±0,38 Xanh Trắng 206,30± 0,80 9,20±0,15 9,00±0,08 5,50±0,06 Mo 117,91±0,40 Xanh Trắng 222,10± 0,86 9,70±0,21 8,10±0,11 4,40±0,05 NH 160,08±1,23 Xanh Trắng 200,40± 0,98 9,30±0,05 8,40±0,15 4,40±0,09 PT 179,28±0,78 Xanh Trắng 213,40± 1,08 9,70±0,12 9,00±0,21 4,90±0,05 TB 173,17±0,38 Xanh Trắng 212,20± 1,16 9,50±0,16 8,80±0,05 4,80±0,08 10 VK2 138,64±0,98 Xanh Trắng 212,90± 0,68 9,50±0,19 8,40±0,10 4,60±0,09 8,50±0,10 4,30±0,01 Bảng 1.2 Chất lƣợng hạt 10 giống ngô STT Giống Hàm lƣợng lipit Hàm lƣợng protein Hàm lƣợng đƣờng BN 3,53±0,03 9,37± 0,01 2,64± 0,01 BS1 3,47±0,03 8,94± 0,08 2,62± 0,01 DG2 3,54±0,02 9,46± 0,01 2,82± 0,01 ĐX2 3,73±0,12 9,13± 0,01 2,79± 0,01 KL 5,00±0,01 6,88± 0,01 2,69± 0,01 Mo 3,47±0,03 8,92± 0,01 2,52± 0,01 NH 3,37±0,03 8,10± 0,01 2,66± 0,01 PT 3,83±0,09 9,13± 0,01 2,59± 0,01 TB 4,98±0,03 8,66± 0,01 2,53± 0,01 10 VK2 3,31±0,02 9,41± 0,01 2,72± 0,01 (Đơn vi ̣ tính: %KLK, n=3; mức độ tin cậy 95%) 128 PHỤ LỤC Bảng 2.1 Hoạt độ amylase qua tuổi mầm xử lý sorbitol 5% ngày TM Lô BN BS1 DG2 ĐX2 KL Mo NH PT TB VK2 ĐC 0,020±0,001 0,016±0,001 0,024±0,001 0,025±0,001 0,021±0,001 0,024±0,001 0,022±0,001 0,024±0,001 0,022±0,001 0,022±0,001 Hạn 0,026±0,001 0,02±0,001 0,029±0,001 0,031±0,001 0,026±0,001 0,030±0,001 0,029±0,001 0,030±0,001 0,027±0,001 0,026±0,001 ngày %ĐC 129,09±2,31 120,03±0,83 123,33±1,73 125,0±2,89 123,66±1,76 124,0±2,31 130,01±0,58 125,34±1,34 125,00±2,31 124,33±2,12 ĐC 0,028±0,001 0,023±0,001 0,028±0,001 0,024±0,001 0,02±0,001 0,025±0,001 0,032±0,001 0,027±0,001 0,025±0,001 0,025±0,001 Hạn 0,035±0,001 0,028±0,001 0,035±0,001 0,031±0,001 0,025±0,001 0,034±0,001 0,043±0,001 0,035±0,001 0,034±0,001 0,031±0,001 ngày 125±0,58 134,03±1,76 133,13±1,78 126,67±0,98 135,00±1,15 125,04±2,31 ĐC 0,456±0,004 0,38!±0,134 0,638±0,003 0,471±0,007 0,456±0,004 0,636±0,004 0,536±0,003 0,558±0,006 0,623±0,007 0,316±0,134 Hạn 0,603±0,001 0,475±0,006 0,802±0,001 0,595±0,002 0,513±0,002 0,873±0,002 0,804±0,002 0,743±0,002 0,862±0,001 0,590±0,003 ngày %ĐC 132,37±1,16 125,01±2,89 125,66±0,58 126,37±2,31 112,44±1,29 137,19±1,16 150,09±1,16 133,04±1,73 138,35±1,73 131,18±1,18 ĐC 1,441±0,01 1,584±0,006 1,277±0,009 1,35±0,019 1,486±0,004 1,425±0,029 1,457±0,01 1,452±0,015 1,312±0,015 1,502±0,016 Hạn 1,965±0,003 1,931±0,002 2,015±0,002 1,891±0,003 1,738±0,002 2,233±0,004 2,274±0,003 2,022±0,002 1,993±0,002 1,851±0,002 ngày %ĐC 136,34±1,16 121,91±0,58 157,79±1,27 140,02±2,08 116,93±0,5 156,78±3,64 156,16±1,21 139,37±1,50 151,87±1,73 136,34±1,44 ĐC 0,368±0,008 0,396±0,001 0,375±0,002 0,397±0,001 0,399±0,004 0,400±0,001 0,384±0,002 0,386±0,003 0,397±0,002 0,415±0,002 Hạn 0,421±0,006 0,416±0,002 0,423±0,002 0,425±0,003 0,421±0,005 0,454±0,002 0,433±0,002 0,421±0,006 0,434±0,005 0,436±0,002 %ĐC 114,37±1,16 105,03±0,57 112,7±1,04 107,07±0,57 105,36±0,17 113,33±0,46 112,67±1,16 109,09±0,59 109,33±0,56 105,16±0,06 (Đơn vi ̣ tính: ĐVHĐ/mg; TM: tuổi mầm; ĐC: đối chứng; %ĐC: % so đối chứng; n=3; mức độ tin cậy 95%) 128 %ĐC 125,33±1,16 121,67±0,58 124,01±1,15 130,5±1,73 129 Bảng 2.2 Hàm lƣợng đƣờng qua tuổi mầm xử lý sorbitol 5% Lô BN BS1 DG2 ĐX2 KL Mo NH PT TB VK2 ĐC 2,12±0,001 Hạn 2,249±0,011 2,205±0,006 2,175±0,012 2,191±0,008 2,021±0,004 2,184±0,017 2,164±0,017 2,338±0,017 2,411±0,004 2,155±0,014 %ĐC 106,1±0,58 106,25±0,58 105,61±0,23 103,96±0,54 103,32±0,58 105,55±0,58 105,95±0,57 112,33±1,16 111,15±0,58 106,1±0,52 ĐC 2,19±0,019 2,083±0,005 2,096±0,004 2,180±0,008 2,06±0,031 2,103±0,011 2,197±0,012 2,106±0,01 2,289±0,011 Hạn 2,4±0,028 2,171±0,012 2,166±0,01 2,336±0,017 2,076±0,015 2,06±0,016 2,108±0,003 1,956±0,007 2,069±0,005 2,042±0,005 2,082±0,002 2,17±0,008 2,039±0,003 2,1±0,028 2,19±0,03 2,521±0,012 2,535±0,020 2,48±0,011 2,539±0,017 2,411±0,058 %ĐC 109,57±0,35 104,23±0,29 103,36±0,29 107,14±0,40 101,98±0,23 119,91±1,16 115,40±0,27 117,77±1,04 110,92±1,03 116,78±1,09 ĐC 2,236±0,016 2,122±0,004 2,201±0,008 2,178±0,014 2,07±0,002 2,307±0,016 2,262±0,012 2,289±0,01 2,391±0,009 2,266±0,01 Hạn 2,516±0,007 2,275±0,013 2,512±0,006 2,415±0,008 2,361±0,017 2,786±0,015 2,664±0,009 2,698±0,017 2,682±0,017 2,451±0,017 %ĐC 112,54±1,16 107,22±0,46 114,12±0,64 110,94±1,02 114,08±0,92 120,75±1,42 117,76±0,95 117,9±0,98 112,15±1,16 108,18±0,95 ĐC 2,431±0,022 2,157±0,003 2,336±0,003 2,392±0,003 2,333±0,025 2,509±0,026 2,494±0,006 2,356±0,007 2,514±0,006 2,33±0,018 Hạn 3,028±0,012 2,60±0,029 2,862±0,019 2,893±0,025 2,822±0,01 3,092±0,01 3,099±0,012 2,962±0,017 2,841±0,023 2,825±0,013 %ĐC 124,58±1,40 120,55±1,16 122,52±0,98 120,92±1,16 121,0±1,52 123,29±1,67 124,26±0,75 125,74±1,10 113,02±1,16 121,25±1,42 ĐC 2,269±0,006 2,181±0,008 2,219±0,012 2,14±0,019 2,073±0,01 2,17±0,004 2,181±0,013 2,164±0,014 2,133±0,022 2,236±0,006 Hạn 2,347±0,024 2,347±0,012 2,347±0,012 2,347±0,023 2,347±0,023 2,347±0,013 2,347±0,016 2,347±0,017 2,347±0,025 2,347±0,009 %ĐC 103,42±0,81 101,39±0,17 102,63±0,11 105,43±0,44 103,76±0,12 109,40±0,40 104,63±0,12 104,48±0,11 105,65±0,10 103,42±0,16 Y= 1,58X53,15 (R= 0,86) Y= 6,82X21,58 (R= 0,91) Y= 1,75X75,43 (R= 0,91) Y= 1,64X59,20 (R= 0,86) Y= 1,54X51,38 (R= 0,72) Y= 0,84X+ 2,49 (R= 0,72) Y= 1,71X59,37 (R= 0,78) Y= 1,37X25,82 (R= 0,86) Y=2,17X102,48 (R= 0,85) Y=1,32X23,30 (R= 0,82) Tƣơng quan hoạt độ amylase đƣờng (Đơn vi ̣ tính: %KLT; TM: tuổi mầm; ĐC: đối chứng; %ĐC: % so đối chứng; n=3; mức độ tin cậy 95%) 129 ngày TM 130 Bảng 2.3 Hoạt độ protease qua tuổi mầm xử lý sorbitol 5% TM Lô BN BS1 DG2 ĐX2 KL Mo NH PT TB VK2 ngày ĐC 0,034±0,002 0,071±0,003 0,112±0,009 0,079±0,006 0,036±0,005 0,080±0,005 0,159±0,002 0,051±0,004 0,125±0,006 0,106±0,008 Hạn 0,051±0,004 0,088±0,004 0,158±0,015 0,102±0,008 0,041±0,002 0,104±0,007 0,201±0,004 0,068±0,006 0,139±0,008 0,131±0,012 %ĐC 147,99±1,16 125,18±0,58 141,25±1,16 129,68±0,46 115,32±0,58 129,68±1,10 126,22±0,46 132,02±1,16 110,97±0,69 123,31±1,73 ngày ĐC 0,077±0,003 0,051±0,009 0,293±0,014 0,111±0,008 0,117±0,01 0,103±0,004 0,216±0,015 0,199±0,007 0,106±0,013 0,119±0,009 Hạn 0,104±0,005 0,064±0,012 0,345±0,017 0,135±0,012 0,155±0,015 0,134±0,006 0,294±0,023 0,273±0,012 0,134±0,017 0,145±0,012 %ĐC 135,62±1,04 125,23±0,58 117,69±0,46 121,08±1,54 131,91±1,14 130,27±1,04 136,02±1,81 137,12±0,92 125,96±0,58 121,38±0,46 Hạn 1,026±0,012 0,865±0,006 1,112±0,006 0,869±0,012 0,828±0,012 1,031±0,017 1,104±0,006 1,072±0,012 0,998±0,023 0,911±0,012 %ĐC 145,19±2,31 145,19±1,73 145,19±1,16 145,19±2,49 145,19±1,73 145,19±1,16 145,19±0,58 145,19±1,16 145,19±1,73 145,19±1,73 ngày ĐC 0,865±0,008 1,03±0,005 0,888±0,001 0,978±0,004 1,022±0,009 1,302±0,002 1,323±0,002 1,233±0,003 1,202±0,001 0,865±0,007 Hạn 1,445±0,023 1,436±0,017 1,577±0,012 1,428±0,012 1,419±0,017 2,123±0,012 2,144±0,012 1,941±0,017 1,923±0,012 1,415±0,007 %ĐC 167,06±1,16 139,47±2,31 177,53±1,16 146,04±1,73 138,83±1,73 163,08±0,58 162,12±1,16 157,48±1,73 160±0,87 139,58±1,73 ngày ĐC 0,391±0,005 0,286±0,007 0,446±0,003 0,351±0,009 0,309±0,009 0,542±0,004 0,503±0,005 0,512±0,015 0,454±0,003 0,304±0,004 Hạn 0,404±0,006 0,404±0,012 0,404±0,006 0,404±0,017 0,404±0,017 0,404±0,012 0,404±0,012 0,404±0,017 0,404±0,009 0,404±0,01 %ĐC 103,22±0,12 113,79±1,16 111,11±0,57 122,86±1,73 119,15±2,31 114,77±1,86 114,02±1,16 103,73±0,40 115,38±1,16 123,37±1,73 (Đơn vi ̣ tính: ĐVHĐ/mg; TM: tuổi mầm; ĐC: đối chứng; %ĐC: % so đối chứng; n=3; mức độ tin cậy 95%) 130 ngày ĐC 0,707±0,003 0,648±0,004 0,702±0,001 0,622±0,003 0,620±0,001 0,749±0,006 0,781±0,001 0,731±0,002 0,716±0,008 0,682±0,001 i 131 PHỤ LỤC Bảng 3.1 Tỉ lệ tƣơng đồng trình tự nucleotit đoạn gen B giống NH BS1 với số trình tự họ bHLH Bảng 3.2 Tỉ lệ tƣơng đồng trình tự nucleotit đoạn gen Lc giống NH BS1 với số trình tự họ bHLH ii 132 PHỤ LỤC 1130 1140 1150 1160 | | | | | | | | ACT- mRNA (NM001155179) AGTGTGATGT TGATATCAGG AAGGATTTGT ATGGTAACGT ACT- NH 1170 1180 1190 1200 | | | | | | | | ACT- mRNA (NM001155179) T-GTCCTCAG TGGGGGATCT ACCATGTTCC CTGGGATTGC ACT- NH T 1210 1220 1230 1240 | | | | | | | | ACT- mRNA (NM001155179) CGATCGTATG AGCAAGGAGA TCACGTCCCT GGCTCCTAGC ACT- NH 1250 1260 1270 1280 | | | | | | | | ACT- mRNA (NM001155179) AGCATGAAGG TTAAAGTGAT TGCGCCACCT GAAAGGAAGT ACT- NH 1290 1300 1310 1320 | | | | | | | | ACT- mRNA (NM001155179) ACAGTGTCTG GATCGGTGGC TCTATTTTGG CTTCTCTCAG ACT- NH 1330 1340 1350 1360 | | | | | | | | ACT- mRNA (NM001155179) CACTTTTCAG CAGATGTGGA TCTCCAAGGG AGAGTATGAC ACT- NH 1370 1380 1390 | | | | | | | ACT- mRNA (NM001155179) GAAACTGGTC CGGGCATTGT CCACATGAAG TGCTTCTAA ACT- NH .C Hình 4.1 So sánh trình tự nucleotit đoạn gen Act giống NH với trình tự GenBank ... NHÀN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ GEN ĐIỀU HÒA SINH TỔNG HỢP ANTHOCYANIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY NGƠ NẾP ĐỊA PHƢƠNG Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH. .. anthocyanin liên quan đến tính chịu hạn ngô nếp địa phƣơng” Mục tiêu đề tài Xác định đƣợc mối tƣơng quan anthocyanin khả chịu hạn ngô nếp địa phƣơng Xác định phân lập đƣợc số gen điều hòa (gen TF) quan. .. thái, sinh lý, hóa sinh tính chịu hạn Cơ chế chống chịu hạn thực vật phức tạp liên quan đến đặc điểm hình thái giải phẫu, sinh lí, hoá sinh, liên quan đến gen chịu hạn Hiện có nhiều quan điểm