BÀI 6: KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA SAPONIN I.CHIẾT XUẤT SAPONIN TỪ BỘT CAM THẢO1.Tiến hành: 0.5g bột Cam thảo + 50ml ethanol 70% lọc bông2.Kết quả Dịch chiết SaponinII.ĐỊNH TÍNH BẰNG PHẢN ỨNG HÓA HỌC1.Phản ứng trên bột dược liệuTiến hành:•Bột cam thảo + amoniac (TT) quan sát màu.•Thêm tiếp acid sulfuric 80% (TT) quan sát màu.Hiện tượng: Nhỏ dung dịch ammoniac lên bột dược liệu sẽ xuất hiện màu vàng tươi. Thêm sulfuric acid 80% thì màu vàng tươi nhạt dần. Giải thích: Glycyrrhyzic acid có tính acid yếu (trong bột Cam thảo) phản ứng với NH3 tạo muối monoammonium glycyrrhizinate có màu vàng tươi. Khi cho dung dịch H2SO4 80%, H2SO4 sẽ phản ứng với muối trên cho lại glycyrrhyzic acid làm màu vàng tươi nhạt dần.2.Phản ứng Lierbermann BurchartTiến hành•10ml dịch lọc khô cắn.•Cắn + 1ml anhydrid + 1ml clorofrom dịch trong.•Thêm từ từ theo thành ống nghiệm 2ml acid sulfuric → Quan sát hiện tượng.Hiện tượng: Khi nhỏ từ từ theo thành ống khoảng 2 ml sulfuric acid → xuất hiện vòng ngăn cách màu nâu đỏ giữa 2 lớp chất lỏng, lớp dung dịch phía trên có màu vàng nâu sẫm.→ Phản ứng phân loại sapogenin: dẫn chất triterpenoid thì cho màu hồng đến tía. Giải thích:•Anhydric acetic+ chloroform giúp hòa tan cắn saponin.•Khi cho H2SO4 đậm đặc vào, H2SO4 khử nhóm hydroxyl ở vị trí C3 tạo 1 nối đôi, quy trình này lặp lại → tạo aromatic triterpene có các nối đôi liên hợp (nhóm mang màu) xuất hiện vòng nâu đỏ ngăn cách giữa 2 lớp.3.Phản ứng ShinodaHiện tượng: Khi cho vào dịch lọc một ít bột magnesi kim loại và hydrochloric acid xuất hiện màu đỏ sẫm.Giải thích: Mg + HCl tạo ra hydro mới sinh (H+), hydro này sẽ khử nhóm carbonyl trong flavonoid (nhóm hoạt chất quan trọng thứ hai trong rễ Cam thảo) tạo nối đôi liên hợp (nhóm mang màu) → Sản phẩm có màu đỏ sẫm. III.ĐỊNH TÍNH BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG1.Dược liệu Cam thảo1.1.Chuẩn bị:a.Mẫu thử:B1: 0.5g dược liệu + 20ml ether → Siêu âm 15p → Gạn bỏ dịch ether, chiết thêm 2 lần nữa để loại bỏ tạp → Thu bã.B2: Bã + 1ml HCl (TT) + 20ml cloroform (TT) → Siêu âm 1h → Lọc bông.B3: Bốc hơi dịch chiết → Cắn + 1ml methanol (TT).b.Bình sắc ký có hệ dung môi: Cloroform – Methanol – nhexane (7:1:2) cho vào bình lắng gạn lắc đều, xả khí. Để yên trong 15 phút rồi lấy lớp dưới cho vào bình chạy sắc ký. Lưu ý để thêm một miếng giấy lọc (10 x 12) vào bình sắc ký để bão hòa dung môi, giúp chạy sắc ký được chuẩn và đẹp hơn.1.2.Tiến hànhB1: Triển khai chạy sắc ký với hệ dung môi tương ứng đã bão hòa. Trên bản mỏng (7:3) chấm riêng biệt lần lượt 3 vết: Vết chuẩn – Vết thử trước (dịch chiết với ethanol 70%) – Vết thử sau (mẫu thử)B2: Quan sát sắc ký đồ:•Để khô bản mỏng đã triển khai, lần lượt quan sát bản mỏng với UV 254nm và UV 365nm → Thu được sắc ký đồ.•Tiếp tục lấy bản mỏng trên, phun H2SO4 10% trong methanol (TT), đem sấy bản mỏng ở 105oC trong 5 phút. Lần lượt quan sát bản mỏng với UV 254nm và UV 365nm → Thu được sắc kí đồ.1.3.Kết quả Soi UV ở bước sóng 254nmNhận xét: Trong dung dịch sau khi chiết có một vết màu hồng giống với dung dịch chuẩn. Trong dịch chiết ban đầu không xuất hiện vết tương tự như dung dịch sau khi chiết. Soi UV ở bước sóng 365nmNhận xét: Khi soi UV 365 hoàn toàn không thấy vết của dung dịch chuẩn. Các vết trên dịch chiết ban đầu hiện rõ hơn so với UV 254. Phun sulfuric acid 10% trong mẹthanolGiải thích:•Glycyrrhizin là saponin quan trọng nhất của rễ Cam thảo, ở dạng bột kết tinh trắng, dễ tan trong nước nóng và cồn loãng, không tan trong ether và chloroform.•Glycyrrhizin ở trong cây dưới dạng muối Mg và Ca của glycyrrhizinic acid. Dưới tác dụng của acid vô cơ (hydrocloric acid), glycyrrhizinic acid bị đẩy ra khỏi muối, bị thủy phân tạo thành glycyrrhetic acid. → Do đó, với dung dịch chiết ban đầu, khi cho thủy phân với ethanol 70% thì vẫn chưa loại hết tạp chất, glycyrrhetic acid sinh ra chưa được nhiều nên vết sắc ký mờ nhạt. → Còn dung dịch sau khi chiết đã được chiết siêu âm 3 lần với ethylic ether để loại chất béo và tạp chất, sau đó thủy phân bằng HCl acid nên glycyrrhetic acid sinh ra nhiều và không lẫn tạp chất, nên vết sắc ký rõ nét hơn. 2.Dược liệu Tục đoạn2.1.Chuẩn bịa.Mẫu thử: 0.5g dược liệu + 20ml ether → chiết siêu âm 15’ → lọc bôngb.Bình sắc ký có hệ dung môi: Cloroform – methanol – H2O (65:35:10)ta nên pha hệ dung môi này bên ngoài trước rồi mới cho vào bình sắc kí một lượng phù hợp. Lưu ý để them một miếng giấy lọc (10x12) vào bình sắc ký để bão hòa dung môi, giúp chạy sắc ký được chuẩn và đẹp hơn.2.2.Tiến hànhB1: Triển khai chạy sắc ký với hệ dung môi tương ứng đã bão hòa. Trên bản mỏng (7:3) chấm riêng biệt lần lượt 2 vết: Vết chuẩn – Vết thử (mẫu thử).B2: Quan sát sắc ký đồ: Để khô bản mỏng đã triển khai, phun H2SO4 10% trong methanol (TT) lên, đem sấy bản mỏng ở 105oC trong 5 phút → thu được sắc ký đồ.2.3.Kết quả Nhận xét: Các vết sắc ký trong mẫu Tục đoạn chuẩn và thử tương đương nhau về vị trí, màu sắc, kích thước. Rf = 0.55Nhận định kết quả•Dược liệu cho vết màu tím ( màu saponin)•Rf =0.55Hiện tượngNguyên nhânCách khắc phụcVết di chuyển không hoàn toànMẫu còn nhiều tạp phân cựcLoại tạp kĩ nhiều lầnVết hình ngọn lửa nhiều dầuChấm vết không trùng nhau, đậmChấm kĩ, cẩn thận, không chấm quá nhiều dịchVết trải dài không táchPha hệ dung môi sắc ký chưa tốt hoặc do chiết không hiệu quảChọn hệ dung môi sắc ký và dung môi chiết xuất mẫu chuyên biệt
BÁO CÁO THỰC TẬP DƯỢC LIỆU BÀI 6: KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA SAPONIN [KHOA DƯỢC] I CHIẾT XUẤT SAPONIN TỪ BỘT CAM THẢO Đun cách thủy 15’ Tiến hành: 0.5g bột Cam thảo + 50ml ethanol 70% lọc Kết Dịch chiết Saponin II ĐỊNH TÍNH BẰNG PHẢN ỨNG HĨA HỌC Phản ứng bột dược liệu − Tiến hành: • Bột cam thảo + amoniac (TT) → quan sát màu • Thêm tiếp acid sulfuric 80% (TT) → quan sát màu − Hiện tượng: Nhỏ dung dịch ammoniac lên bột dược liệu xuất màu vàng tươi Thêm sulfuric acid 80% màu vàng tươi nhạt dần Màu vàng tươi Màu vàng tươi nhạt dần − Giải thích: Glycyrrhyzic acid có tính acid yếu (trong bột Cam thảo) phản ứng với NH3 tạo muối monoammonium glycyrrhizinate có màu vàng tươi Khi cho dung dịch H2SO4 80%, H2SO4 phản ứng với muối cho lại glycyrrhyzic acid → làm màu vàng tươi nhạt dần Phản ứng Lierbermann- Burchart − Tiến hành • 10ml dịch lọc Cô cách thủy khô cắn • Cắn + 1ml anhydrid + 1ml clorofrom Khuấy, lọc dịch • Thêm từ từ theo thành ống nghiệm 2ml acid sulfuric → Quan sát tượng − Hiện tượng: Khi nhỏ từ từ theo thành ống khoảng ml sulfuric acid → xuất vòng ngăn cách màu nâu đỏ lớp chất lỏng, lớp dung dịch phía có màu vàng nâu sẫm → Phản ứng phân loại sapogenin: dẫn chất triterpenoid cho màu hồng đến tía − Giải thích: • Anhydric acetic+ chloroform giúp hịa tan cắn saponin • Khi cho H2SO4 đậm đặc vào, H2SO4 khử nhóm hydroxyl vị trí C3 tạo nối đơi, quy trình lặp lại → tạo aromatic triterpene có nối đơi liên hợp (nhóm mang màu) → xuất vòng nâu đỏ ngăn cách lớp 3 Phản ứng Shinoda Cho – 3ml dịch lọc vào ống nghiệm − Hiện tượng: Khi cho vào dịch lọc bột magnesi kim loại hydrochloric acid xuất màu đỏ sẫm − Giải thích: Mg + HCl tạo hydro sinh (H+), hydro khử nhóm carbonyl flavonoid (nhóm hoạt chất quan trọng thứ hai rễ Cam thảo) tạo nối đôi liên hợp (nhóm mang màu) → Sản phẩm có màu đỏ sẫm III ĐỊNH TÍNH BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG Dược liệu Cam thảo 1.1 Chuẩn bị: a Mẫu thử: − B1: 0.5g dược liệu + 20ml ether → Siêu âm 15p → Gạn bỏ dịch ether, chiết thêm lần để loại bỏ tạp → Thu bã − B2: Bã + 1ml HCl (TT) + 20ml cloroform (TT) → Siêu âm 1h → Lọc − B3: Bốc dịch chiết → Cắn + 1ml methanol (TT) b Bình sắc ký có hệ dung mơi: Cloroform – Methanol – n-hexane (7:1:2) cho vào bình lắng gạn lắc đều, xả khí Để yên 15 phút lấy lớp cho vào bình chạy sắc ký Lưu ý để thêm miếng giấy lọc (10 x 12) vào bình sắc ký để bão hịa dung mơi, giúp chạy sắc ký chuẩn đẹp 1.2 Tiến hành − B1: Triển khai chạy sắc ký với hệ dung mơi tương ứng bão hịa Trên mỏng (7:3) chấm riêng biệt vết: Vết chuẩn – Vết thử trước (dịch chiết với ethanol 70%) – Vết thử sau (mẫu thử) − B2: Quan sát sắc ký đồ: • Để khơ mỏng triển khai, quan sát mỏng với UV 254nm UV 365nm → Thu sắc ký đồ • Tiếp tục lấy mỏng trên, phun H2SO4 10% methanol (TT), đem sấy mỏng 105oC phút Lần lượt quan sát mỏng với UV 254nm UV 365nm → Thu sắc kí đồ 1.3 Kết Chú thích: C: Dung dịch chuẩn Bđ: Dịch chiết ban đầu Ch: Dung dịch sau chiết Nhận xét: Trong dung dịch sau chiết có vết màu hồng giống với dung dịch chuẩn Trong dịch chiết ban đầu không xuất vết tương tự dung dịch sau chiết Soi UV bước sóng 254nm Chú thích: C: Dung dịch chuẩn Bđ: Dịch chiết ban đầu Ch: Dung dịch sau chiết Nhận xét: Khi soi UV 365 hồn tồn khơng thấy vết dung dịch chuẩn Các vết dịch chiết ban đầu rõ so với UV 254 Soi UV bước sóng 365nm Chú thích: C: Dung dịch chuẩn Bđ: Dịch chiết ban đầu Ch: Dung dịch sau chiết Phun sulfuric acid 10% mẹthanol − Giải thích: • Glycyrrhizin saponin quan trọng rễ Cam thảo, dạng bột kết tinh trắng, dễ tan nước nóng cồn lỗng, khơng tan ether chloroform • Glycyrrhizin dạng muối Mg Ca glycyrrhizinic acid Dưới tác dụng acid vô (hydrocloric acid), glycyrrhizinic acid bị đẩy khỏi muối, bị thủy phân tạo thành glycyrrhetic acid → Do đó, với dung dịch chiết ban đầu, cho thủy phân với ethanol 70% chưa loại hết tạp chất, glycyrrhetic acid sinh chưa nhiều nên vết sắc ký mờ nhạt → Còn dung dịch sau chiết chiết siêu âm lần với ethylic ether để loại chất béo tạp chất, sau thủy phân HCl acid nên glycyrrhetic acid sinh nhiều không lẫn tạp chất, nên vết sắc ký rõ nét Dược liệu Tục đoạn 2.1 Chuẩn bị a Mẫu thử: 0.5g dược liệu + 20ml ether → chiết siêu âm 15’ → lọc bơng b Bình sắc ký có hệ dung môi: Cloroform – methanol – H2O (65:35:10) ta nên pha hệ dung mơi bên ngồi trước cho vào bình sắc kí lượng phù hợp Lưu ý để them miếng giấy lọc (10x12) vào bình sắc ký để bão hịa dung mơi, giúp chạy sắc ký chuẩn đẹp 2.2 Tiến hành − B1: Triển khai chạy sắc ký với hệ dung môi tương ứng bão hòa Trên mỏng (7:3) chấm riêng biệt vết: Vết chuẩn – Vết thử (mẫu thử) − B2: Quan sát sắc ký đồ: Để khô mỏng triển khai, phun H2SO4 10% methanol (TT) lên, đem sấy mỏng 105oC phút → thu sắc ký đồ 2.3 Kết Chú thích: TĐC: Dung dịch chuẩn TĐ thử: Dung dịch thử chứa dịch chiết Tục đoạn Nhận xét: Các vết sắc ký mẫu Tục đoạn chuẩn thử tương đương vị trí, màu sắc, kích thước Rf = 0.55 ❖ Nhận định kết • Dược liệu cho vết màu tím ( màu saponin) • Rf =0.55 Hiện tượng Nguyên nhân Cách khắc phục Vết di chuyển Mẫu nhiều tạp phân cực Loại tạp kĩ nhiều lần khơng hồn tồn Vết hình lửa nhiều dầu Vết trải dài không tách Chấm vết không trùng nhau, đậm Pha hệ dung môi sắc ký chưa tốt chiết không hiệu Chấm kĩ, cẩn thận, không chấm nhiều dịch Chọn hệ dung môi sắc ký dung môi chiết xuất mẫu chuyên biệt ... SẮC KÝ LỚP MỎNG Dược liệu Cam thảo 1. 1 Chuẩn bị: a Mẫu thử: − B1: 0.5g dược liệu + 20ml ether → Siêu âm 15 p → Gạn bỏ dịch ether, chiết thêm lần để loại bỏ tạp → Thu bã − B2: Bã + 1ml HCl (TT) +...BÀI 6: KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA SAPONIN [KHOA DƯỢC] I CHIẾT XUẤT SAPONIN TỪ BỘT CAM THẢO Đun cách thủy 15 ’ Tiến hành: 0.5g bột Cam thảo + 50ml ethanol 70% lọc Kết Dịch chiết Saponin II ĐỊNH TÍNH... sắc ký rõ nét Dược liệu Tục đoạn 2 .1 Chuẩn bị a Mẫu thử: 0.5g dược liệu + 20ml ether → chiết siêu âm 15 ’ → lọc bơng b Bình sắc ký có hệ dung mơi: Cloroform – methanol – H2O (65:35 :10 ) ta nên pha