Giải thícha) Thuốc thử Bouchardat (Ống nghiệm 1)Hiện tượng: tủa nâu dưới đáy ống nghiệmKết luận: Dương tínhThuốc thử Bouchardat (I2Iodine, KI, H2O).Cơ chế: I2 sẽ tạo phức periodua alkaloid không tan với alkaloid khi có mặt của KI. Phức không tan có màu nâu.•2I2 + KI > KI4•KI4 + Alkaloid + H+ > Alkaloid.HI4 + K+b) Thuốc thử Dragendorff (Ống nghiệm 2)Hiện tượng: tủa vàng cam, tủa vô định hìnhKết luận: Dương tínhThuốc thử Dragendorff (Bismuth nitrate, KI, H2O) là dung dịch muối của kim loại nặng Bismuth: KbiI4 – Kalitetraiodobismutat III Dùng đđịnh tính amine bậc 3 và một vài amine bậc 2.Cơ chế: Phản ứng xảy ra giữa nguyên tử kim loại nặng (Bi) trong thuốc thử với nguyên tử nitrogen trong alkaloid tạo muối iodid bismuth alkaloid không tan có màu vàng cam > đỏ. Thuốc thử phát hiện alkaloid rất nhanh.•BiI3+KI↔KBiI4 – SPU•BiI4 + HNR3+ > HNR3+n.BiI4nc) Thuốc thử ValseMayer (Ống nghiệm 3)Hiện tượng: tủa trắng hơi ngả vàng nhạt, tủa vô định hình Kết luận: Dương tínhThuốcthửValseMayer:DungdịchmuốicủakimloạinặngHg(Dipotassium tetraiodomercurate K2HgI4).Cơ chế: Phản ứng xảy ra giữa nguyên tử kim loại nặng (Hg) trong thuốc thử với nguyên tử nitrogen trong alkaloid tạo muối không tan iodid thủy ngân alkaloid có màu trắng hoặc vàng nhạt•HgCl2 + 2KI > HgI2 + 2KCl•HgI2 + + 2KI > K2HgI4•HgI42 + HNR3+> HNR3+2.HgI42d) Thuốc thử Bertrand (Ống nghiệm 4)Hiện tượng: tủa trắngKết luận: Dương tínhThuốc thử Bertrand là Silicotungstic acid (SiO2 • 12WоO3 • 4Н2O)Cơ chế: Phản ứng xảy ra giữa nguyên tử kim loại nặng (Wo) trong thuốc thử với nguyên tử nitrogen trong alkaloid tạo muối kh ng tan có màu vàng trắng2.Định tính bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng Bản mỏng: Silicagel F254 Merck Dung môi khai triển: CHCl3 – MeOH – NH4OH ( 50:9:1) Dung dịch thử: Dịch chloroform chứa alkaloid dạng base của các dược liệu. Phát hiện bằng UV 254nm và 365 nm thuốc thử Dragendorff Kết quả thí nghiệm:h quy trình tiến hành định tính tinh dầu, chất béo Nhận xét và giải thích:Sự phát hiện của UV 254 nm, 365 nm và thuốc thử Dragendorff:+ UV 254nm: tắt huỳnh quang rõ rệt với hầu hết alkaloid.+ UV 365 nm: phát huỳnh quang rõ rệt với hầu hết alkaloid.+ Thuốc thử Dragendorff: cho vết màu cam.Về Rf của bản 1: Khi phát hiện dưới UV 365nm, cả 4 vết đều có cùng màu sắc cùng hình dạng và có Rf tương đương nhau nên có thể nhận định 4 dược liệu trên đều chứa cùng một alkaloid giống nhau.Về Rf của bản 2: : Khi phát hiện dưới UV 365nm, cả 3 vết đều có cùng màusắc cùng hình dạng và có Rf tương đương nhau nên có thể nhận định 3phương pháp chiết có tính ưu việt tương đối ngang nhau. Dung dịch NH3 trong sắc kí bản mỏng có vai trò làm gọn vết alkaloid (tránh kéo vệt) do đó dùng alkaloid dạng base để định tính bằng sắc kí lớp mỏng.
Khoa Dược BÁO CÁO THỰC TẬP DƯỢC LIỆU Bài 1: ĐỊNH TÍNH DƯỢC LIỆU CHỨA ALKALOID BẰNG PHẢN ỨNG HĨA HỌC VÀ SẮC KÍ LỚP MỎNG I CHIẾT XUẤT ALKALOID THEO PHƯƠNG PHÁP Chiết xuất alkaloid dung môi hữu môi trường kiềm (PP1) Cân 2g Bách NH3 đậm đặc, vừa đủ + 20 ml CHCl3 Dịch chiết CHCl3 Lọc Dịch lọc Lắc phân bố (L-L-E) x 10ml H2SO4 2% Dịch Acid NH4OH đậm đặc Thuốc thử chung Dịch kiềm hóa pH=10 L-L-E với 10ml CHCl3 Dịch chiết CHCl3 Sắc ký lớp mỏng Giải thích sơ đồ chiết alkaloid dung mơi hữu mơi trường kiềm - Alkaloid có tính kiềm Làm ẩm NH3 đậm đặc để chuyển alkaloid dạng muối tế bào thực vật thành dạng base tự Ngoài ra, làm ẩm giúp dược liệu trương nở giúp dung môi dễ thấm vào tế bào chiết nhiều hoạt chất - Dạng alkaloid base tan dung môi hữu phân cực -> dùng dung dịch chloroform để chiết alkaloid dạng base từ Bách - Khi lắc phân bố dịch chloroform với sulfuric acid 2%, alkaloid dạng base chuyển sang dạng muối tan nước (Base + Acid -> Muối) -> loại bỏ lớp chloroform, lấy dịch aicd (lắc phân bố lần chiết nhiều alkaloid hơn) Lớp aicd trên, lớp chloroform tỉ trọng chloroform nặng nước acid - Chia dịch chiết thành phần: Phần 1: Dùng để định tính Alkaloid thuốc thử chung Để định tính alkaloid thuốc thử chung alkaloid phải dạng muối tan nước, vì: Các thuốc thử alkaloid bền môi trường kiềm alkaloid tạo tủa không tan với thuốc thử mơi trường trung tính acid yếu Alkaloid dạng muối nước acid lượng tạp chất lẫn vào đảm bảo cho việc định tính Phần 2: Dùng để định tính Alkaloid sắc ký lớp mỏng Kiềm hóa dịch acid NH3 đậm đặc đến pH=10 để chuyển từ alkaloid dạng muối tan nước sang dạng base tan dung môi hữu phân cực Lắc phân bố với 10ml chloroform để chiết alkaloid dạng base Phải dùng Alkaloid dạng base để làm sắc ký mỏng Alkaloid dạng base lẫn tạp chất Nếu dùng alkaloid dạng muối tan nước khó dịch chiết o o H2O có tsơi Nước=100 C > tsơi Chloroform=61,2 C Khi sấy mỏng vết chấm sắc ký alkaloid dạng muối tan nước bị kéo vệt dài -> sai số khó xác định xác Rf Chiết xuất alkaloid nước acid (PP 2) Cân 2g Bách 20ml dd H2SO4 2% Đun cách thủy 15 ’ Dịch chiết acid (Alkaloid dạng muối) Lọc nóng qua gòn Kiềm hóa NH3 đđ đến pH10 Alkaloid base 10ml CHCl3 (2 lần) Lắc phân bố LLE Na2SO4 khan Dịch CHCl3 khan Phản ứng Vitali – Morin Giải thích quy trình chiết xuất alkaloid từ Cà độc dược - Alkaloid có tính kiềm Làm ẩm dược liệu NH 4OH đậm đặc để chuyển alkaloid dạng muối tế bào thực vật thành dạng base tự Ngoài ra, làm ẩm giúp dược liệu trương nở, giúp dung môi dễ thâm vào tế bào chiết nhiều hoạt chất - Alkaloid dạng base tan dung môi hữu phân cực -> dùng dung dịch chloroform để chiết alkaloid dạng base từ Cà độc dược - Khi lắc phân bố dịch chloroform với sulfuric acid 2%, alkaloid dạng base chuyển sạng dạng muối tan nước (Base + Acid -> Muối) -> loại bỏ lớp chloroform, lấy dịch acid (lớp acid tỉ trọng nước acid nhẹ chloroform) Lắc phân bố lần chiết nhiều alkaloid - Chia dịch chiết thành phần: Phần 1: Dùng để định tính Alkaloid thuốc thử chung Phần 2: Dùng để định tính Alkaloid phản ứng đặc hiệu Vitali – Mori Kiềm hóa dịch acid NH4OH đậm đặc đến pH=10 để chuyển từ alkaloid dạng muối tan nước sang dạng base tan dung môi hữu phân cực Lắc phân bố với 10ml CHCl3 chiết alkaloid dạng base từ nước acid Làm khan Na2SO4 để loại bỏ nước có lẫn trọng dịch chloroform Cho Na2SO4 khan vào để hút nước vì, natri slulfat khan sử dụng chất làm khô trơ, loại bỏ dấu vết nước khỏi chất lỏng hữu cơ, làm dịch chiết Định tính thuốc thử chung - Quy trình: Cho vào ống nghiệm ống 1ml dịch nước acid -> cho riêng rẽ vào ống nghiệm giọt thuốc thử Ống nghiệm 1: Thuốc thử Bouchardat Ống nghiệm 2: Thuốc thử Dragendorff Ống nghiệm 3: Thuốc thử Valse-Mayer Ống nghiệm 4: Thuốc thử Bertrand Định tính phản ứng Vitali - Morin - Sơ đồ thí nghiệm - Hiện tượng: xuất màu tím - Kết luận: dương tính Dịch CHCl3 khan Cắn Bốc +5 giọt HNO3 đậm đặc Hợp chất nitro màu vàng Cô đến cắn, để nguội +3ml acetone, giọt KOH 5%/CH3OH Màu tím khơng bền - Giải thích: Alkaloid Cà độc dược (chủ yếu Atropin Scopolamin) thuộc nhóm Tropane alkaloid Tropane alkaloid tồn Cà độc dược dạng ester Khi cho vào cắn giọt HNO3 đậm đặc, acid cắt đứt liên kết ester phân tử alkaloid tạo tropic acid, tropine base Tropic acid tác dụng với acid HNO3 đậm đặc vòng thơm tropic acid gắn nhóm NO2 vào vị trí para (chất I) Ngồi ra, nhóm NO2 gắn vào vòng thơm phân tử alkaloid sinh 4-nitroatropin (II) Các hợp chất nitro có màu vàng Hòa tan cắn hợp chất nitro với acetone sau tác dụng với KOH 5%/CH3OH Cả hợp chất nitro cho màu tím đặc trưng tác dụng với kiềm mạnh, tạo anion mesomeri bền vững (III) Cân g bột Cà độc dược Định tính sắc kí lớp mỏng - Tiến hành 1ml NH4OH đđ Cà độc dược làm ẩm 25 ml CHCl3 Dịch CHCl3 Lọc Bay Cắn + 1ml CHCl3 Dung dịch thử - Bản mỏng: Silica gel G - Dung môi khai triển: Ethyl acetat - methanol – amoniac đậm đặc (17:2:1) - Dung dịch chuẩn: Hòa tan atropin sulfat chuẩn scopolamin hydrobromid - chuẩn methanol để dung dịch có chửa mồi chất mg/ml Dung môi khai triển: Ethyl acetat - methanol – amoniac đậm đặc (17:2:1) Triển khai sắc ký: Phát UV 254 365 nm; ngâm thuốc thử Bouchardat Kết Bước sóng 254nm Bước sóng 365nm Phát thuốc thử Bouchardat Chú thích: C: dung dịch chuẩn atropin T: dung dịch thử Khi soi UV bước sóng 365 nm Mẫu thử gồm nhiều vết thị có màu: màu hồng, xanh dương,… Mẫu chuẩn gồm vết có màu xanh dương Khi phát thuốc thử Bouchardat: Mẫu chuẩn gồm vết thị alkaloid rõ có màu nâu đỏ Mẫu thử có vết có màu nâu đỏ tương ứng với mẫu chuẩn Trong Cà đơc dược có khả có chứa alkaloid tương tự alkaloid chứa mẫu (atropin) Hệ số di chuyển Rf vết ởBước mẫu chuẩn RfC1 =1,8 : = 0,36 sóng 365 nm Hệ số di chuyển Rf vết mẫu chuẩn : RfC2= 2,5:5= 0,5 Hệ số di chuyển Rf vết mẫu thử: RfT= 2,5 : = 0,5 Kết luận: Trong dược liệu hoa cà độc dược có chứa alkaloid, atropin 2.4 Kiểm nghiệm dược liệu Hoàng đằng 2.4.1 Bột dược liệu Mảnh mạch điểm Mảnh bần Cân 0,5g Hoàng đằng Đun cách thủy Dịch acid 2.4.2 Định tính Sợi mơ cứng có vách dày Dịch chiết nước acid + 20ml acid sulfuric 0,5% Lọc qua giấy lọc Giải thích sơ đồ - Alkaloid tự nhiên tồn dạng muối, nước acid hòa tan alkaloid, giúp kéo triệt để hoạt chất Hoàng đằng dịch chiết - Lọc qua giấy lọc để loại tạp không tan acid, giữ alkaloid dạng muối để định tính với thuốc thử Định tính với thuốc thử chung Chú thích Ống nghiệm 1: Thuốc thử Bouchardat Ống nghiệm 2: Thuốc thử Dragendorff Ống nghiệm 3: Thuốc thử Valse-Mayer Ống nghiệm 4: Thuốc thử Bertrand Kết sau bỏ thuốc thử chung - Kết quả: ống nghiệm không tạo tủa có màu với thuốc thử chung - Kết luận: ống nghiệm âm tính - Giải thích: berberin, palmatin Hồng đằng có pKa thấp, tính base yếu nên khơng cho rõ phản ứng thuốc thử chung alkaloid Ngoài dùng phương pháp chiết acid mà không dùng chiết dung môi hữu mơi trường kiềm berberin palmatin ổn định môi trường kiềm mạnh dễ hỗ biến mở vòng, cho chức aldehyd gọi berberinal, palmatinal Định tính với thuốc thử đặc hiệu - Kết quả: Dùng nước Javel cho màu đỏ cam cho dư màu Sauluận: cho nước - Kết phản ứngJavel dương tính Cho dư nước Javel - Giải thích: thành phần Hồng đằng palmatin có berberin, cho phản ứng đặc hiệu với nước Javel nước Javel có tính oxy hóa mạnh nên oxy hóa berberin thành oxy-berberin chất làm dịch có màu đỏ máu bị màu cho dư nước Javel nước Javel có tính tẩy mạnh nên tẩy màu dịch [O] Oxy-berberin Berberin chloride Cl2 + 2NaOH > NaCl + NaClO + H2O Nước Javel Bài ĐỊNH LƯỢNG ALKALOID TRONG CÀ ĐỘC DƯỢC ... tính sắc kí lớp mỏng Bài KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA ALKALOID 2. 1 Kiểm nghiệm dược liệu Mã tiền 2. 1. 1 Bột dược liệu Thể cứng Lông che chở đơn bào Mảnh nội nhũ 2. 2 Định tính Cân 3g bột Mã tiền +30... Bản mỏng 2: Bản sắc kí vết dược liệu Bách theo phương pháp BB1 BB1 BB2 BB2 BB3 BB3 Phát UV 365 nm Phát UV 25 4 nm Chú thích: - Dung mơi khải triển: CHCl3 – MeOH – NH4OH ( 50:9 :1) - BB1: Dịch chiết... (PP1) Cân 2g Bách NH3 đậm đặc, vừa đủ + 20 ml CHCl3 Dịch chiết CHCl3 Lọc Dịch lọc Lắc phân bố (L-L-E) x 10 ml H2SO4 2% Dịch Acid NH4OH đậm đặc Thuốc thử chung Dịch kiềm hóa pH =10 L-L-E với 10 ml