Góp phần phân biệt về mặt dược liệu 2 loài ban việt nam hypericum patulum thunb ex maray và hypericum uralum buch ham ex d don họ ban hypericaceae

Định tính các nhóm hợp chất trong dược liệu bằng phản ứng hóa học .... Ở Việt Nam đã có một số đề tài nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của loài Hypericum patulum Thu

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ VŨ NGỌC HÂN

GÓP PHẦN PHÂN BIỆT VỀ MẶT DƯỢC LIỆU 2 LOÀI BAN VIỆT NAM

Hypericum patulum Thunb ex Murray Và Hypericum uralum Buch Ham ex D Don

HỌ BAN-HYPERICACEAE

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2014

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ VŨ NGỌC HÂN

GÓP PHẦN PHÂN BIỆT VỀ MẶT DƯỢC LIỆU 2 LOÀI BAN VIỆT NAM

Hypericum patulum Thunb ex Murray Và Hypericum uralum Buch Ham ex D Don

LỜI CẢM ƠN

Những dòng đầu tiên của khóa luận này, tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô, bạn bè và gia đình, những người luôn quan tâm, ủng hộ và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu hoàn thành khóa luận

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Duy Thuần

- Học viện Y dược học cổ truyền và TS Nguyễn Thu Hằng - giảng viên Bộ môn Dược

liệu đã hết lòng tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo cùng các anh chị kỹ thuật viên bộ

môn Dược liệu Trường Đại Học Dược Hà Nội – là những người đã chia sẻ và giải đáp

các vướng mắc của tôi trong suốt quá trình làm khóa luận, đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận

Để hoàn thành khóa luận này, không thể không kể đến sự giảng dạy tỉ mỉ và nhiệt tình của toàn thể các thầy cô giáo và Ban giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội, giúp cho em có nền tảng kiến thức vững chắc, để không chỉ hoàn thành tốt khóa luận, mà còn phục vụ cho công việc sau này

Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, gia đình, người thân và bạn bè, những người đã luôn sát cánh động viên và giúp đỡ tôi vượt qua những thời điểm khó khăn nhất trong học tập cũng như trong quá trình hoàn thành khóa luận

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014 Sinh viên

Lê Vũ Ngọc Hân

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2

1.1 Vị trí phân loại 2

1.2 Đặc điểm chi Hypericum L 2

1.3 Phân bố 3

1.4 Các loài thuộc chi Hypericum L 3

1.5 Giới thiệu về loài Hypericum patulum Thunb ex Murray 4

1.6 Giới thiệu về loài Hypericum uralum Buch Ham ex D Don 11

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 13

2.2 Nội dung nghiên cứu 13

2.3 Phương pháp nghiên cứu 14

CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 15

3.1 Kết quả nghiên cứu về thực vật 15

3.1.1 Đặc điểm thực vật cây BLT 15

3.1.2 Đặc điểm thực vật cây BLN 16

3.2 Kết quả nghiên cứu về hóa học 23

3.2.1 Định tính các nhóm hợp chất trong dược liệu bằng phản ứng hóa học 23

3.2.2 Định tính bằng SKLM 30

3.3 Bàn luận 40

CHƯƠNG IV: ĐỀ XUẤT VÀ KẾT LUẬN 44

4.1 Kết luận 44

4.2 Đề xuất 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13 Bảng 3.10: So sánh đặc điểm hình thái loài BLT và BLN 40

14 Bảng 3.11: So sánh đặc điểm hiển vi hai loài BLT và BLN 41

15 Bảng 3.12: So sánh sắc ký đồ phân đoạn dịch chiết n – hexan lá BLT

17 Bảng 3.14:So sánh sắc ký đồ phân đoạn dịch chiết ethyl acetat lá

DANH MỤC CÁC HÌNH

2 Hình 3.2: Hypericum uralum Buch Ham ex D Don 18

3 Hình 3.3: Ảnh chụp vi phẫu lá Ban lá to dưới kính hiển vi 19

4 Hình 3.4: Ảnh chụp vi phẫu lá Ban lá nhỏ dưới kính hiển vi 19

5 Hình 3.5: Ảnh chụp vi phẫu thân Ban lá to dưới kính hiển vi 20

6 Hình 3.6: Ảnh chụp vi phẫu thân Ban lá nhỏ dưới kính hiển vi 20

7 Hình 3.7: Ảnh chụp bột lá Ban lá to dưới kính hiển vi 21

8 Hình 3.8: Ảnh chụp bột lá Ban lá nhỏ dưới kính hiển vi 21

9 Hình 3.9: Ảnh chụp bột thân Ban lá to dưới kính hiển vi 22

10 Hình 3.10: Ảnh chụp bột thân Ban lá nhỏ dưới kính hiển vi 22

11 Hình 3.11: Sắc ký đồ phân đoạn dịch chiết n-hexan lá BLN và lá

ĐẶT VẤN ĐỀ

Họ Ban - Hyperiaceae là một trong họ thực vật phong phú và đa dạng nhất thế giới

Chỉ tính riêng chi Hypericum L., trên thế giới đã ghi nhận được 461 loài, phân bố rộng

khắp tất cả các châu lục, chỉ trừ Nam cực và Bắc Cực [25] Đây cũng là chi có nhiều loài thực vật có giá trị đối với cuộc sống con người Các loại dược thảo này được sử dụng rộng rãi trên thế giới và được dùng trong điều trị bệnh thấp khớp, bệnh vàng da, phù nề, viêm chảy dịch vị và dùng ngoài điều trị các vết thương bầm giập [6]

Hypericum patulum Thunb ex Murray và Hypericum uralum Buch.Ham ex D

Don là hai dược liệu quý trong chi Hypericum L được sử dụng rộng rãi trong dân gian để

chữa bệnh [6] Ở Việt Nam đã có một số đề tài nghiên cứu về thành phần hóa học và tác

dụng sinh học của loài Hypericum patulum Thunb ex Murray [1],[13],[14] Tuy nhiên, những nghiên cứu về loài Hypericum uralum Buch.Ham ex D Don còn hạn chế Trên

thực tế, hai loài này thuộc cùng một chi và có những đặc điểm hình thái tương đối giống

nhau Để góp phần phân biệt và tránh nhầm lẫn khi sử dụng hai loài này, đề tài “Góp

phần phân biệt về mặt dược liệu hai loài Ban Việt Nam Hypericum patulum Thunb ex Murray và Hypericum uralum Buch.Ham ex D Don, họ Ban - Hypericaceae” được

tiến hành với mục tiêu so sánh phân biệt hai loài Hypericum patulum Thunb ex Murray

và Hypericum uralum Buch.Ham ex D Don về đặc điểm thực vật và thành phần hóa

học

Để thực hiện mục tiêu trên, đề tài bao gồm những nội dung sau:

- Nghiên cứu về thực vật: Mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm vi phẫu và đặc điểm

bột của loài Hypericum patulum Thunb ex Murray và loài Hypericum uralum

Buch.Ham ex D Don

- Nghiên cứu về hóa học: Định tính loài Hypericum patulum Thunb ex Murray và loài Hypericum uralum Buch.Ham ex D Don bằng phản ứng hóa học và bằng sắc ký lớp

mỏng

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Vị trí phân loại

Theo hệ thống phân loại Takhtajan (2009)[16], chi Hypericum L có vị trí phân

loại như sau:

1.2 Đặc điểm chi Hypericum L

Cây bụi hoặc nửa bụi, sống lâu năm, không có lông hoặc có lông đơn giản, có các tuyến trong mờ hoặc mờ đục, màu đen hoặc đỏ tối, nhiều tầng (trộn vào nhau và có khi chỉ ở mặt dưới), thường ở rìa hoặc ven rìa Lá mọc đối (hoặc vòng), không cuống hoặc cuống ngắn, gân lông chim hoặc chân vịt (hiếm khi rẽ đôi), mép nguyên hoặc có tuyến ở mép lá Cụm hoa xim Hoa lưỡng tính, hoa hình sao hoặc hình cốc Đài 5, tiền khai hoa năm điểm, hiếm khi 4, xếp chữ thập, không đều hoặc đều, tràng liền một phần hoặc rời Tràng 4 hoặc 5, xếp xoắn ốc, màu vàng hoặc vàng chanh (hiếm khi trắng), mặt dưới thường màu nhạt, hoặc có gân đỏ, không rụng hoặc sớm rụng sau nở hoa, thường không đối xứng Nhị hoa chùm 4 hoặc 5, rời và dính vào họng tràng, có thể dính với nhau thành

3 hoặc 4 bó nhị dính vào đài, hoặc không theo quy tắc và không dính thành cụm chỉ nhị, không rụng hoặc rụng sớm, mỗi bó nhị có thể lên đến 70 (120) nhị, chỉ nhị mảnh, rời nhau hoặc dính 2/3, bao phấn nhỏ, dính lưng hoặc có thể dính gốc, mở dọc, có tuyến liên kết, nhị vô tính bị khuyết (rất hiếm) Bầu nhụy 3-5 khoang, đính noãn trung trụ hoặc chỉ 1 khoang với 2-3-5 hợp điểm đính noãn bên, mỗi hợp điểm có từ 2 đến nhiều noãn, thân noãn 2 hoặc 3-5, rời nhau hoặc đính một phần đến hoàn toàn, núm nhụy nhỏ, bè hoặc không Quả nang chẻ ô hoặc hiếm khi tự mở, vỏ quả thường chứa dầu Hạt nhỏ, hình

chum hoặc có cánh hẹp, vỏ hạt hình dạng đa dạng, không có áo hạt (rất hiếm khi có mồng), cây mầm nhọn, thẳng, với một lá mầm nhọn [26]

1.3 Phân bố

Các loài thuộc chi Hypericum L phân bố rộng rãi ở khắp mọi nơi trên thế giới, chỉ

ngoại trừ các vùng đất thấp nhiệt đới, hoang mạc, Bắc Cực và Nam Cực [25]

Ở Việt Nam, các loài thuộc chi Hypericum L phân bố ở các tỉnh vùng núi phía

Bắc [12]

1.4 Các loài thuộc chi Hypericum L

Trên thế giới chi Hypericum L có 469 loài thuộc chi Hypericum L [25] Theo Thực vật chí Trung Quốc [26], chi Hypericum gồm 65 loài Trong đó, có 12 loài thuộc chi Hypericum L có ở Việt Nam Ngoài ra, theo các tài liệu [7] và [21], chi Hypericum L

ở Việt Nam còn có thêm 5 loài nữa Các loài thuộc chi Hypericum L ở Việt Nam được

trình bày tóm tắt ở bảng 1

Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Hypericum L ở Việt Nam

8 Hypericum attenuatum C E C Fischer ex

Arn

1.5 Giới thiệu về loài Hypericum patulum Thunb ex Murray

1.5.1 Tên gọi

- Tên khoa học: Hypericum patulum Thunb ex Murray, họ Hypericaceae

- Tên đồng nghĩa: Hypericum argyi H Leveille & Vaniot; Komana patula (Thunberg) Y Kimura ex Honda; Norysca patula (Thunberg) J Voigt

- Tên thường gọi: Ban lá to, Ban tròn

1.5.2 Đặc điểm thực vật

Cây dưới bụi, cao 0,4 - 1m Thân và cành hình trụ, vỏ hơi hồng và có các sợi tơ

Lá hình Oval hay Oval thuôn, chóp lá tù hay nhọn mũi, cuống lá rất ngắn Phiến lá dài 3 - 5cm Mặt trên hơi xanh lục, mặt dưới nhợt nhạt, có những điểm tuyến trong suốt (hoặc hơi mờ) Gân rất nhỏ, có 3 - 4 chiếc mỗi bên Cụm hoa dạng ngù Hoa to, đường kính 4cm, có cuống ngắn 6mm; có lá bắc hay lá bắc nhỏ ở gốc Đài 5 ô van - tù; đôi khi có mũi lồi, dìa 5 - 7mm, mép hơi hồng, có các vết rạch ngắn, màu trong Cánh hoa 5, hầu như tròn, dài 2cm Nhị xếp 5 bó Bầu 5 cục và có 5 vòi nhuỵ, dài 6- 7mm Vòi dài bằng bầu, cụt hoặc nhọn ở đỉnh tự do và dính nhau từ giữa bầu trở xuống Quả nang hình trứng

- viên chuỳ (hình nón), dài 12 mm Hạt dạng sợi (vạch) nhỏ hơi cong, dài 1,5mm, rộng 0,25mm, nhọn 2 đầu, có các vân ngang [6]

1.5.3 Phân bố

Loài Hypericum patulum Thunb ex Murray phân bố rộng rãi ở nhiều nơi trên thế

giới: Ấn Độ, Butal, Hymalaya, phía Tây Nam và trung tâm Trung Quốc (Vân Nam) và Đài Loan [6]

Ở Việt Nam, cây chủ yếu mọc tập trung ở vùng núi và trung du phía Bắc và một

số khu vực miền Trung: Ô Quy Hồ (gần Sa Pa), Phong Thổ (Lào Cai), San-ta-ngay (Lai Châu) [11]

1.5.4 Thành phần hóa học

Kết quả định lượng các hợp chất polyphenol trong cây Hypericum patulum Thunb

ex Murray bằng phương pháp đo quang [17] như sau:

- Polyphenol toàn phần: 7,33 ± 0,01%

- Polyphenol không tanin: 2,26 ± 0,03%

- Tanin: 5,07 ± 0,04%

Dựa theo cấu trúc hóa học, các hợp chất được phân lập từ lá Hypericum patulum

Thunb ex Murray được chia thành 3 nhóm chính là xanthon, flavonoid và các hợp chất khác

1.5.4.1 Xanthon

Các hợp chất xanthon được phân lập từ lá BLT được tổng kết ở bảng 2

Bảng 1.2: Các hợp chất xanthon được phân lập từ lá BLT

Các hợp chất flavonoid phân lập từ lá BLT được tổng kết ở bảng 3

Bảng 1.3: Các hợp chất flavonoid được phân lập từ lá BLT

1.5.4.3 Các hợp chất khác

Bằng phương pháp SKLM cho thấy trong lá BLT có các hợp chất phenol, acid

thơm, sterol [7] Ngoài ra lá Hypericum patulum Thumb Ex Murray có chứa tinh dầu,

trong đó thành phần chính là β-selinen (14,7%) [15]

1.5.5 Tác dụng sinh học

1.5.5.1 Các tác dụng trên gan và mật

Flavonoid chiết xuất từ lá BLT - được gọi là “Cao BLT ” (còn gọi là bột Hypatin)

có tác dụng chống viêm gan mạn, tác dụng lợi mật, tác dụng chống viêm gan mạn như sau:

- Tác dụng bảo vệ gan: Với liều thử 250mg/kg chuột nhắt trắng, bột Hypatin đã làm giảm 36,50% hoạt độ enzym GPT và 53,58% hàm lượng bilirubin trong huyết thanh chuột có ý nghĩa thống kê trên mô hình thí nghiệm gây độc gan bởi CCl4 [1]

- Tác dụng ức chế xơ gan: Bột Hypatin với các liều thử 125mg/kg và 250mg/kg làm giảm tương ứng 10,76% (p < 0.05) và và 15,24% (p < 0,001) collagen trong gan chuột nhắt trắng bị gây viêm gan mạn và tăng collagen bằng CCl4 [1]

- Tác dụng chống oxy hóa: Bột Hypatin với các liều thử 125mg/kg và 250mg/kg làm giảm tương ứng 21,38% và 13,65% hàm lượng MDA trong gan chuột nhắt trắng bị gây tăng peroxy hóa lipid bằng CCl4 [1]

- Tác dụng trên tổ chức tế bào gan: Bột Hypatin thể hiện tác dụng bảo vệ gan trên chuột cống trắng bị gây xơ gan bằng CCl4, tuy không giúp hồi phục hoàn toàn nhưng đã cải thiện rõ rệt các tổn thương gan Đặc biệt đã hạn chế mức độ xơ hóa gan rất nhiều so với lô chuột bệnh lý không được điều trị [1]

- Tác dụng chống viêm gan mạn: Bột Hypatin với liều thử 250mg/kg đã làm giảm

có ý nghĩa thống kê 23,5% trọng lượng ổ viêm do amian gây ra trên chuột cống trắng [1]

- Tác dụng lợi mật: Bột Hypatin với liều thử 250mg/kg làm tăng tiết mật 29,29% (p < 0,05) so với lô chứng trên chuột nhắt trắng trưởng thành ở mô hình thực nghiệm Rudi [1]

Với các tác dụng sinh học được đánh giá trên chuột bị gây viêm gan cấp và mạn tính bằng CCl4 đã liệt kê ở trên, chế phẩm flavonoid BLT (Hypatin) đáp ứng các yêu cầu đối với thuốc điều trị viêm gan mạn do virut VGB [1]

Tác dụng trên gan và mật của cao nước của lá BLT: Cao nước lá BLT có tác dụng giảm 33,02% GPT (p < 0,01) và giảm 33,83% Bilirubin (p < 0,01) liều tương đương 10g dược liệu khô/kg chuột [8] Cao nước lá Ban tròn còn có tác dụng giảm hàm lượng collagen và malonyl dialdehyd (MDA) trong gan chuột bị gây viêm gan mạn bằng CCl4

- Ngăn cản sự sao chép gen mã hóa enzym tham gia vào quá trình sinh tổng hợp

PG hoặc cytokines viêm [27]

1.5.5.3 Tác dụng gây độc tế bào và chống ung thư

Dịch chiết methanol của thân, lá cây BLT được thử nghiệm tác dụng gây độc tế bào trên dòng tế bào HEp-2, RD và dòng tế bào Vero Kết quả dịch chiết thân BLT cho hiệu quả gây độc tế bào cao nhất trong các dịch chiết được thử nghiệm với CTC50 (nồng

độ gây độc 50% tế bào) là 1,71μg/mL đối với HEp-2, 1,53μg/mL đối với RD và 2,23μg/mL đối với dòng tế bào Vero Dịch chiết lá BLT cho kết quả gây độc tế vào trung bình trên tất cả dòng tế bào thử nghiệm [24]

Đối với dịch chiết methanol của thân BLT: Trong nghiên cứu tác dụng chống ung thư ngắn hạn sử dụng tế bào DLA, 50% tế bào sống sót qua thử nghiệm khi dùng nồng độ

từ 100-200μg/ml, Trong nghiên cứu khả chống ung thư dài hạn sử dụng dòng tế bào HEp-3, không có tổ chức tế bào nào được hình thành khi dùng nồng độ 1.6μg/mL[24]

1.5.5.4 Tác dụng làm lành vết thương

Dịch chiết methanol của lá BLT ở dạng bào chế thuốc mỡ với 2 nồng độ 5% và 10% (kl/kl) được đánh giá khả năng làm lành vết thương trên mô hình vết thương đường rạch (incision) và mô hình vết thương đường cắt (excision) trên chuột Cả hai nồng độ đều cho thấy đáp ứng đáng kể trong cả hai mô hình thử nghiệm so với nhóm chứng [23]

1.5.5.5 Tác dụng kháng khuẩn

Các hợp chất xanthon được phân lập từ BLT được thử nghiệm tác dụng đối với

các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus 209P IF0-3061 và Escherichia coli NIHJ trên

đĩa thạch ở liều 40μl (1000μg/ml) [19] Kết quả như sau:

- Các hợp chất xanthon cho tác dụng kháng khuẩn mạnh (đường kícnh vòng vô khuẩn từ 15-20mm) là γ-mangostin, tripterosid và patulon [19]

- Các hợp chất xanthon cho tác dụng kháng khuẩn vừa (đường kính vòng vô khuẩn

từ 9-14mm) là paxanthon B, patulosid A, garcinon B, morusignin D, demethyl paxanthonin, paxathonin và paglucinol [19]

- Độc tính bán trường diễn: Bột flavonoid của BLT với liều uống 5000mg/kg thể trọng trên thỏ trong 30 ngày không thấy ảnh hưởng đến chức năng gan thận và chức năng tạo máu của thỏ Flavonoid BLT không gây độc đối với cấu trúc tế bào gan và thận [1]

1.6 Giới thiệu về loài Hypericum uralum Buch Ham ex D Don

1.6.1 Tên gọi

- Tên khoa học: Hypericum uralum Buch Ham ex D.Don, họ Hypericaceae

- Tên thường gọi: Ban lá nhỏ

1.6.2 Đặc điểm thực vật

Cây gỗ, cao 0,3 - 2m, nhiều thân tạo thành bụi, có thân đứng thẳng hoặc thân cong Thông thường thân có nhiều lá Thân màu hồng, lúc non có 4 gân dọc hoặc có 4 gân dọc nhưng dẹp 2 bên rõ ràng; Cuối cùng có hai sườn hoặc hình trụ tròn Các đốt thân dài 0,5 - 2cm, ngắn hơn lá Lớp vở màu nâu hồng Lá có cuống, cuống lá dẹp bằng, dài 0,5 - 1mm Phiến lá toàn bộ hình mác hoặc lá già có hình trứng, dài 1 - 4cm, rộng 0,4 - 2,4cm, đỉnh lá nhọn mũi đến tròn nhưng có gai nhọn; Gốc lá hình nêm hẹp hoặc ngẫu nhiên có hình nêm rộng Mép lá phẳng, chất giấy cứng Mặt trên lá xanh, mặt dưới ít nhiều phủ bọt phấn trắng Gân chủ 3 đôi Gân giữa ít phân nhánh Gân cấp III dạng mạng

có thể nhìn thấy Phức thể tuyến thông thường ít nhiều dày đặc Thể tuyến ở phiến lá thành dạng sợi (hướng gân giữa) và dạng điểm Cụm hoa 1 - 3 (-10) hoa, mọc ra ở 1 - 2 đốt, gần thành dạng tản phòng Nếu cụm hoa từ 2 đốt sinh ra thì 1 ở đỉnh đốt ngắn Thông thường từ phần giữa thân sinh ra 1 số có 1 - 3 nhánh dạng dải Cuống hoa dài 3 - 7mm

Lá bắc hình tròn dài hẹp sớm rụng Đường kính hoa 1,5 - 3cm, ít nhiều thành hìng cốc (chén sâu) Cụm hoa hình cầu trứng đến cầu tròn, đỉnh tù đến tròn Lá đài rời, xếp dạng lợp ở thời kỳ nụ và thời kỳ qủa đều đứng thẳng, hình tròn dài hoặc hình ellip đến hình thìa dạng trứng, gần to bằng nhau hoặc không cùng lớn, dài 3,5 - 6 (-9)mm, rộng (1-) 2 -

5 (-6,5)mm, đỉnh tròn hoặc rất ngẫu nhiên có dạng tù Mép nguyên, có rìa hẹp là chất màng, không có gân giữa hoặc cơ hồ không phân minh, gân nhỏ không rõ hoặc ngẫu nhiên có thể thấy rõ, thể tuyến có nhiều, dạng sợi Cánh hoa màu vàng kim đến vàng đậm, không có màu hồng vựng, cong vào phía trong, hình trứng đảo rộng đến gần tròn, dài 0,9 - 1,8cm, rộng 0,5 - 1,2cm, gấp 2,5 - 3 lần lá đài Mép cánh hoa nguyên, không có

các điểm tuyến ở gần mép, có các kim nhỏ ở bên đến gần đỉnh, đầu kim tròn đến Nhị 5

bó Mỗi bó 40 - 60 nhị Nhị dài nhất 4 - 6 (-8)mm, bằng 1/4 - 1/2 cánh hoa Bao phấn vàng kim đến vàng đậm Bầu hình cầu trứng rộng đến hình cầu tròn, dài 3 - 5mm, rộng 2,5 - 3mm Vòi nhuỵ dài 2,5 - 4,5mm, bằng 3/5 - 9/10 độ dài của bầu, rất ít khi có độ dài bằng bầu Vòi đứng thẳng, ở đỉnh ít nhiều có hơi ngả ra hoặc toàn nhiên ngoại cong Núm nhuỵ dạng đầu hẹp Quả nang gần hình cầu (hoặc hạn hữu lắm có hình cầu trứng rộng) đến hình cầu tròn, dài 0,7 - 1,1 (-1,3)cm, rộng 0,7 - 1,1cm Hạt nâu đậm, hình elip dạng trụ tròn, dài 0,4 - 0,6mm, hầu như không dạng xương rồng nổi lên, có các vân sóng thưa dạng sợi Nhiễm sắc thể 2n = 20 Hoa VII-IX Quả IX-XI [6]

1.6.3 Phân bố

Loài Hypericum uralum Buch Ham ex D.Don phân bố rộng rãi ở nhiều nơi trên

thế giới: Nepal, Sikkim, Pakistan, Ấn Độ (phía Bắc), Trung Quốc (Vân Nam), Mianma, Thái Lan, Malaisia [6]

Ở Việt Nam, cây chủ yếu mọc tập trung ở vùng núi và trung du phía Bắc: Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang, Cao Bằng [6]

1.6.4 Công dụng

Toàn cây BLN được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian trị viêm gan cấp và mạn tính, băng huyết, viêm da, lở ngứa Rễ có tác dụng lợi tiểu, lợi sữa, đau gân [6]

Nhận xét: Dựa trên các tài liệu thu thập được cho thấy loài Hypericum uralum Buch

Ham ex D.Don chưa được nghiên cứu nhiều về thành phần hóa học và tác dụng sinh học

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

Cây BLT và BLN được thu hái tại Sa Pa - Lào Cai vào tháng 10/2013 Mẫu nghiên cứu đã được lưu trữ tại Phòng Bảo tồn dược liệu - Viện nghiên cứu Y - Dược cổ truyền Tuệ Tĩnh và đã được CN Ngô Văn Trại thẩm định tên khoa học Kết quả mẫu BLT có

tên khoa học là Hypericum patulum Thunb ex Murray, họ Ban Hypericaceae L., mẫu BLN có tên khoa học là Hypericum uralum Buch.Ham D Don, họ Ban Hypericaceae L

2.1.2 Hóa chất và dụng cụ

Các hóa chất và thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dược điển Việt

Nam IV

- Hóa chất: NaOH, HCl, Amoniac, H2SO4, Anhydrid acetic

- Dung môi: Ethanol, Methanol, Aceton, Ethyl acetat, Toluen, Chloroform, Hexan

- Thuốc thử: Các thuốc thử Mayer, Dragendorff, Bouchardat, Diazo, FeCl3 5% Gelatin 1%, Chì acetat 10%, Đồng acetat 10%

- Bản mỏng silica gel F254 (Merck), hoạt hóa trong tủ sấy 110oC trong 1 giờ

- Dụng cụ: Bình nón, ống nghiệm, pipet, phễu lọc, cốc có mỏ, đũa thủy tinh, lamen, lam kính, bình gạn, thuyền tán, mao quản

2.1.3 Thiết bị và máy móc

- kính hiển vi LEICA, máy ảnh kỹ thuật số CANON

- Tủ sấy SHELLAB, cân phân tích PRECISA XB 220A

- Nồi cách thủy, bếp điện, tủ hốt

- Hệ thống sắc ký: Thiết bị bơm mẫu tự động (CAMAG - LIMONAT5), máy nén khí, bình khai triển sắc ký, bình phun sắc ký, đèn tử ngoại

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu về thực vật: Mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm vi phẫu và đặc điểm bột (thân, lá) của cây BLT và BLN

- Nghiên cứu về hóa học: Định tính các nhóm hợp chất có trong lá hai loài BLT và BLN bằng phản ứng hóa học và bằng sắc ký lớp mỏng

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu về thực vật

- Mô tả đặc điểm hình thái theo phương pháp mô tả phân tích

- Nghiên cứu đặc điểm hiển vi

+ Bột dược liệu: Sấy khô dược liệu trong tủ sấy ở nhiệt độ 600C sau đó dùng thuyền tán và chày cối sứ hoặc máy xay nghiền nhỏ Rây lấy bột mịn, dùng kim mũi mác lấy bột dược liệu cho lên phiến kính đã nhỏ sẵn một giọt nước cất, đặt lamen lên và quan sát dưới kính hiển vi để xác định các đặc điểm bột dược liệu [3]

+ Vi phẫu: Cắt vi phẫu bằng máy cắt cầm tay, tẩy bằng nước Javen, nhuộm vi phẫu theo phương pháp nhuộm kép, quan sát dưới kính hiển vi xác định các đặc điểm vi phẫu [4]

+ Chụp ảnh đặc điểm bột và vi phẫu bằng máy ảnh Canon Xử lý ảnh bằng phần mềm PHOTOSHOP CS8

2.3.2 Nghiên cứu về hóa học

- Định tính các nhóm hợp chất chính trong dược liệu bằng phản ứng hóa học theo phương pháp ghi trong các tài liệu [2], [3]

- Định tính dịch chiết ethanol và các phân đoạn dịch chiết từ dược liệu bằng SKLM

theo phương pháp ghi trong Dược điển Việt Nam IV (Phụ lục 5.4) [ 5]

CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Kết quả nghiên cứu về thực vật

3.1.1 Đặc điểm thực vật cây Ban lá to

3.1.1.1 Đặc điểm hình thái

Quan sát tại thực địa, cây BLT (Hình 1) có những đặc điểm sau:

Cây dưới bụi, cao 0,4 - 1m Thân và cành hình trụ, vỏ hơi hồng và có lông che chở

Lá hình oval hay oval thuôn, chóp lá tù hay nhọn mũi, cuống lá rất ngắn Phiến lá dài 3 - 5cm Mặt trên hơi xanh lục, mặt dưới nhợt nhạt, có những điểm tuyến trong suốt (hoặc hơi mờ) Gân rất nhỏ, có 3 - 4 chiếc mỗi bên Cụm hoa dạng ngù Hoa to, màu vàng, đường kính 4cm, có cuống ngắn 6 mm; có lá bắc hay lá bắc nhỏ ở gốc Đài 5 ô van - tù; đôi khi có mũi lồi, dài 5 - 7mm, mép hơi hồng, có các vết rạch ngắn, màu trong Cánh hoa 5, hầu như tròn, dài 2 cm Nhị xếp 5 bó Bầu 5 ô và có 5 vòi nhuỵ, dài 6- 7mm Vòi dài bằng bầu, cụt hoặc nhọn ở đỉnh tự do và dính nhau từ giữa bầu trở xuống Quả nang hình trứng, dài 12 mm Hạt dạng sợi, nhỏ hơi cong, dài 1,5mm, rộng 0,25mm, nhọn 2 đầu, có các vân ngang

3.1.1.2 Vi phẫu

- Vi phẫu lá (Hình 3):

Phần phiến lá: Biểu bì dưới (5) gồm 1 hàng tế bào xếp đều đặn, mô khuyết (4) gồm nhiều hàng tế bào hình gần tròn, kích thước không đều, xếp lộn xộn, có khoảng trống giữa các tế bào Mô giậu (2) gồm 1 hàng tế bào nằm sát biểu bì trên.Tế bào tiết (3) nằm xen kẽ trong mô giậu Biểu bì trên (1) gồm 1 hàng tế bào xếp đều đặn

Phần gân lá: Biểu bì dưới (5) gồm 1 hàng tế bào xếp đều đặn Mô dày (10) gồm 2-3 hàng tế bào có thành dày, hình đa giác, xếp lộn xộn Mô mềm (9) gồm 4-5 hàng tế bào hình gần tròn, kích thước không đều, xếp lộn xộn, ở sát bó libe-gỗ Chính giữa gân lá là

bó libe-gỗ hình cung, libe (8) ở phía ngoài, gỗ (7) ở trong gồm 3-4 mạch gỗ Mô dày (6) gồm 1-2 hàng tế bào có thành dày nằm sát biểu bì trên Biểu bì trên (1) gồm 1 hàng tế bào

xếp đều đặn

- Vi phẫu thân (Hình 5): Mặt cắt thân hình gần tròn, từ ngoài vào trong có các đặc

điểm: Biểu bì (1) gồm 1 hàng tế bào xếp đều đặn, mô mềm vỏ (2) gồm 6-7 hàng tế bào

thành mỏng, hình đa giác Libe-gỗ xếp thành từng bó, các bó libe gỗ tạo thành vòng hướng tâm, mỗi bó gồm libe (3) ở phía ngoài, gỗ (5) ở phía trong gồm 4-5 dãy mạch gỗ, ngăn cách với libe bởi tầng phát sinh libe-gỗ (4) Mô mềm ruột (6) chiếm phần lớn tiết diện thân, gồm nhiều tế bào thành mỏng, hình gần tròn, càng vào trong các tế bào có kích thước càng lớn

3.1.1.3 Đặc điểm bột

- Bột lá (Hình 7): Bột mầu nâu nhạt, không mùi, vị hơi đắng Quan sát dưới kính

hiển vi có các đặc điểm sau: mảnh mô mềm (7), (8), (9), biểu bì (1), mạch dẫn (2), (3),(4), mảnh mang màu (5), mảnh mô giậu (6)

- Bột thân (Hình 9) Bột mầu nâu nhạt, không mùi, vị hơi đắng Quan sát dưới kính

hiển vi có các đặc điểm sau: mảnh mô mềm (6),(7), sợi (5), mạch dẫn (2),(3),(4), mảnh mang màu (8),(9), đám tinh bột có các tinh bột hình tròn (1)

3.1.2 Đặc điểm thực vật cây Ban lá nhỏ

3.1.2.1 Đặc điểm hình thái

Quan sát tại thực địa, cây BLN (Hình 2) có những đặc điểm sau:

Cây gỗ, cao 0,3 - 2m, thân tạo thành bụi, đứng thẳng hoặc cong Thân màu hồng, lúc non có 4 gân dọc hoặc có 4 gân dọc nhưng dẹp 2 bên rõ ràng; ở cây trưởng thành thân có hai sườn hoặc hình trụ tròn Các đốt thân dài 0,5 - 2cm, ngắn hơn lá Lớp vỏ màu nâu hồng Lá có cuống, cuống lá dẹp bằng, dài 0,5 - 1mm Phiến lá toàn bộ hình mác hoặc lá già có hình trứng, dài 1 - 4cm, rộng 0,4 - 2,4cm, đỉnh lá nhọn mũi đến tròn nhưng có gai nhọn Mép lá phẳng, chất giấy cứng Mặt trên lá xanh, mặt dưới ít nhiều phủ bọt phấn trắng Gân chủ 3 đôi Gân giữa ít phân nhánh Cụm hoa 1 - 3 (-10) hoa, mọc ra ở 1 - 2 đốt, gần thành dạng tản phòng Cuống hoa dài 3 - 7mm Lá bắc hình tròn dài hẹp sớm rụng Đường kính hoa 1,5 - 3cm, ít nhiều thành hình cốc (chén sâu) Lá đài rời, xếp dạng lợp dài 3,5 - 6 (-9)mm, rộng (1-) 2 - 5 (-6,5)mm, đỉnh tròn hoặc rất ngẫu nhiên có dạng

tù Tràng 5 Cánh hoa màu vàng kim đến vàng đậm, cong vào phía trong, hình trứng đảo rộng đến gần tròn, dài 0,9 - 1,8cm, rộng 0,5 - 1,2cm, gấp 2,5 - 3 lần lá đài Nhị 5 bó Mỗi

bó 40 - 60 nhị Nhị dài nhất 4 - 6 (-8)mm, bằng 1/4 - 1/2 cánh hoa Bầu hình cầu trứng rộng đến hình cầu tròn, dài 3 - 5mm, rộng 2,5 - 3mm Bầu 5 khoang Quả nang gần hình

cầu đến hình cầu tròn, dài 0,7 - 1,1 (-1,3)cm, rộng 0,7 - 1,1cm Hạt nâu đậm, hình elip dạng trụ tròn, dài 0,4 - 0,6mm, có các vân sóng thưa dạng sợi Nhiễm sắc thể 2n = 20

3.1.2.2 Đặc điểm vi phẫu

- Vi phẫu lá (Hình 4):

Phần phiến lá: Biểu bì dưới (4) gồm 1 hàng tế bào xếp đều đặn, mô khuyết (3) gồm nhiều hàng tế bào hình gần tròn, kích thước không đều, xếp lộn xộn, có khoảng trống giữa các tế bào Mô giậu (2) gồm 1 hàng tế bào nằm sát biểu bì trên Biểu bì trên (1) gồm

1 hàng tế bào xếp đều đặn

Phần gân lá: Biểu bì dưới (4) gồm 1 hàng tế bào xếp đều đặn Mô dày (9) gồm 2-3 hàng tế bào có thành dày, hình đa giác, xếp lộn xộn Mô mềm (8) gồm 4-5 hàng tế bào hình gần tròn, kích thước không đều, xếp lộn xộn, ở sát bó libe-gỗ Chính giữa gân lá là

bó libe-gỗ hình cung, libe (7) ở phía ngoài, gỗ (6) ở trong gồm 3-4 mạch gỗ Mô dày (5) gồm 1-2 hàng tế bào có thành dày nằm sát biểu bì trên Biểu bì trên (1) gồm 1 hàng tế bào xếp đều đặn

- Vi phẫu thân (Hình 6): Mặt cắt thân hình tròn, có hai gân dọc đối xứng hai bên, từ

ngoài vào trong có các đặc điểm: Biểu bì (1) gồm 1 hàng tế bào xếp đều đặn, mô mềm vỏ (2) gồm 4-5 hàng tế bào thành mỏng, hình đa giác Libe-gỗ xếp thành từng bó, các bó libe gỗ tạo thành vòng hướng tâm, mỗi bó gồm libe (4) ở phía ngoài, gỗ (6) ở phía trong gồm 4-5 dãy mạch gỗ, ngăn cách với libe bởi tầng phát sinh libe-gỗ (5) Mô mềm ruột (7) chiếm phần lớn tiết diện thân, gồm nhiều tế bào thành mỏng, hình gần tròn, càng vào trong các tế bào có kích thước càng lớn

3.1.2.3 Đặc điểm bột

Bột lá (Hình 8): Bột mầu vàng nhạt, không mùi, vị hơi đắng Quan sát dưới kính

hiển vi có các đặc điểm sau: biểu bì (1),(2), mảnh mang màu (4), mạch dẫn (3), mảnh mô giậu (5), mảnh mô mềm (6)

Bột thân (Hình 10): Bột mầu vàng nhạt, không mùi, vị hơi đắng Quan sát dưới kính

hiển vi có các đặc điểm sau: mạch vạch (1), (2), (3), (4), biểu bì (5), (6), sợi (7), mô mềm (8), mảnh mang màu (9)

Hình 3.1: Hypericum patulum Thunb ex Muray

Hình 3.2: Hypericum uralum Buch.-Ham ex D Don

Hình 3.3: Ảnh chụp vi phẫu lá Ban lá to dưới kính hiển vi

Hình 3.4: Ảnh chụp vi phẫu lá Ban lá nhỏ dưới kính hiển vi