hiệu quả kháng khuẩn và độc tính với tế bào xƣơng của xi măng trám bít ống tủy bioroottm rcs nghiên cứu in vitro”

MỞ ĐẦU Điều trị nội nha công việc quen thuộc thực hành nha khoa Quy tắc vàng thực hành nội nha làm hồn tồn hệ thống ống tủy trám bít ống tủy (TBOT) khít kín theo ba chiều khơng gian nhằm ngăn chặn hình thành vi kẽ xâm nhập dịch quanh chóp vào hệ thống ống tủy, ngăn cản tái viêm nhiễm thiết lập mơi trường vi sinh thuận lợi cho q trình lành thương Điều đạt kỹ thuật trám bít sử dụng vật liệu lõi nhiệt dẻo (thường côn gutta-percha) kết hợp với xi măng TBOT Mặc dù xi măng trám bít sử dụng bên ống tủy, đơi chúng ngồi qua lỗ chóp, khơng ngồi chất phóng thích từ xi măng tiếp xúc trực tiếp với mơ quanh chóp bao gồm dây chằng nha chu xương ổ thời gian dài, gây kích thích mơ chậm lành thương, từ ảnh hưởng đến kết điều trị nội nha sau cùng[18] Vì vậy, việc nghiên cứu đánh giá tính tương hợp sinh học xi măng TBOT vô cần thiết Trước đây, xi măng TBOT phân thành loại dựa theo thành phần hóa học, gồm (1) oxide kẽm-eugenol, (2) calcium hydroxide, (3) silicone, (4) glass-ionomer (5) nhựa epoxy methacrylate Mặc dù sử dụng lâm sàng y văn tổng quan kết luận tất xi măng TBOT thương mại kể có độc tính gây phá hủy mơ từ trung bình đến nặng ngồi mơ quanh chóp; đó, số loại xi măng tạo độc tính trộn loại khác tiếp tục rò rỉ yếu tố gây độc theo thời gian hòa tan xi măng[24] Cho đến năm gần đây, nhờ phát triển khoa học kỹ thuật mà loại vật liệu nội nha chứa hỗn hợp khoáng trioxide calcium silicate đời Ưu điểm bật loại vật liệu có hoạt tính sinh học Nó phóng thích calcium hydroxide phản ứng với nước, tạo pH kiềm cao giúp hoạt hóa kích thích biểu alkaline phosphatase, hỗ trợ hình thành mơ khống hóa có tác dụng kháng khuẩn Ngồi ra, pH kiềm cịn trung hòa acid lactic từ hủy cốt bào giúp ngăn cản hịa tan mơ khống hóa[38] Mặc dù có nhiều tính chất sinh học thuận lợi vật liệu lại không định để TBOT bộc lộ số nhược điểm thời gian đơng lâu, khó thao tác, khó lưu trữ giá thành cao Trên sở đó, nhà nghiên cứu tiến hành nghiên cứu phát triển thêm loại xi măng TBOT calcium silicate mà sản phẩm thương mại BioRootTM RCS (Septodont, Saint-Maur-des-Fossés, Pháp) chứa tricalcium silicate zirconium oxide Đã có số nghiên cứu cho thấy có hoạt tính sinh học cao, cụ thể phóng thích calcium hydroxide sau đông[11] tạo pha calcium phosphate tiếp xúc với dịch sinh lý[63] Ngoài ra, Camps cộng (cs) cịn ghi nhận BioRootTM RCS có độc tính thấp tế bào dây chằng nha chu đồng thời kích thích tiết yếu tố tăng trưởng tạo mạch yếu tố tăng trưởng tạo xương[12] Những kết nghiên cứu ỏi phần gợi ý BioRootTM RCS vật liệu trám bít tương hợp sinh học tiếp xúc với mơ sống quanh chóp Tuy nhiên nay, chưa có nghiên cứu đáp ứng tế bào xương tế bào diện vùng quanh chóp tiếp xúc với vật liệu Do đó, để hiểu rõ vấn đề vừa nêu cung cấp thêm chứng giúp bác sĩ Răng Hàm Mặt có sở lựa chọn vật liệu để đạt kết điều trị lâm sàng tốt nhất, thực nghiên cứu “Hiệu kháng khuẩn độc tính với tế bào xƣơng xi măng trám bít ống tủy BiorootTM RCS: Nghiên cứu in vitro” với mục tiêu cụ thể sau: Xác định so sánh độc tính tế bào xương người dịch chiết BioRootTM RCS so với AH26 Xác định so sánh mức độ tăng sinh tế bào xương người tiếp xúc với dịch chiết BioRootTM RCS so với AH26 Xác định khả bám dính tế bào xương người vật liệu BioRootTM RCS Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU TỔNG QUAN VỀ HAI LOẠI XI MĂNG SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 1.1 Thành phần Bảng 1.2: Thành phần xi măng AH26 BioRootTM RCS[48, 52] Phân loại Bột Thành phần Lỏng Tỷ lệ trộn Thời gian làm việc Thời gian đông Vật liệu AH26 (không chứa bạc) BioRootTM RCS Xi măng trám bít nhựa Xi măng trám bít epoxy calcium silicate Tricalcium silicate, Bismuth (III) oxide, zirconium oxide, Methenamine povidone Nước, Bisphenol-A-diglycidylcalcium chloride, ether hydrosolube polymer muỗng bột : 5-7 giọt Bột : lỏng = 2-3 : chất lỏng 9-15 10 phút 24-36 giờ 1.2 Cơ chế phản ứng đông cứng 1.2.1 AH26 Như trình bày trên, AH26 gồm bột chất lỏng Phản ứng cộng bắt đầu sau hai thành phần trộn mà không cần chất xúc tác chất khơi mào (Hình 1.1) Phản ứng địi hỏi nhiều nên AH26 có thời gian làm việc tương đối dài[48] 1.2.2 BioRootTM RCS BioRootTM RCS xi măng TBOT calcium silicate phát triển sở vật liệu nội nha BiodentineTM (Septodont, Saint Maur-des-Fosses, Pháp) Trong BiodentineTM vật liệu có độ bền học cao thời gian đơng ngắn BioRootTM RCS biến đổi để có độ bền học thấp thời gian đơng dài nhằm phù hợp cho việc thao tác TBOT Sự giống khác thành phần BiodentineTM BioRootTM RCS trình bày bảng Bảng 1.3: So sánh thành phần BiodentineTM BioRootTM RCS[52] Thành phần Bột BiodentineTM Tricalcium silicate (C3S) Calcium carbonate oxide Sắt oxide Vai trò Thành phần X Chất độn Chất tạo màu X Nước X Zirconium oxide (hàm lượng cao) Povidone Nước Calcium chloride Calcium chloride Chất gia tốc cho phản ứng đông Hydrosolube polymer Hydrosolube polymer Tác nhân hút nước Zirconium oxide Lỏng BioRootTM RCS Tricalcium silicate (C3S) Chất cản quang Dính với gutta-percha Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1 Tế bào nghiên cứu Tế bào sử dụng nghiên cứu tế bào xương người (được biệt hóa từ tế bào gốc trung mô thu nhận từ mô mỡ) cung cấp Bộ môn Mô-Phôi, Trường Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch thành phố Hồ Chí Minh (Phụ lục 1) 2.1.2 Vật liệu nghiên cứu - Xi măng TBOT BioRootTM RCS (Septodont, Pháp) dạng bột chất lỏng, số lô B18997, hạn sử dụng tháng 08 năm 2018 - Xi măng TBOT AH26 (Dentsply, Đức) dạng bột chất lỏng, số lô 110000440, hạn sử dụng tháng 06 năm 2020 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu in vitro có nhóm chứng 2.2.2 Thời gian địa điểm thực nghiên cứu Nghiên cứu thực từ tháng 10 năm 2016 đến tháng 05 năm 2017 phịng thí nghiệm Bộ mơn Mơ-Phơi, Trường Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch 2.2.3 Chuẩn bị trƣớc nghiên cứu 2.2.3.1 Vật liệu phương tiện nghiên cứu Bảng 2.1: Vật liệu phương tiện nghiên cứu  Xi măng TBOT BioRootTM RCS  Xi măng TBOT AH26 Vật liệu  Chứng dương: Latex  Chứng âm: Mơi trường cảm ứng biệt hóa tạo tế bào xương (gọi tắt mơi trường biệt hóa) Tế bào 2.3  Tế bào xương người QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU 2.3.1 Phân lập, nuôi cấy thu nhận tế bào xƣơng ngƣời Tế bào xương người thu nhận cách biệt hố tế bào gốc trung mơ thu từ mơ mỡ người theo quy trình chuẩn hóa Phịng thí nghiệm Bộ mơn MơPhơi, Trường Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch[1, 60] 2.3.2 Thực nghiên cứu Nghiên cứu gồm ba quy trình riêng biệt đánh giá độc tính dịch chiết vật liệu tế bào xương người thử nghiệm MTT (trả lời mục tiêu 1), đánh giá mức độ tăng sinh tế bào xương người tiếp xúc với dịch chiết phương pháp đếm số lượng tế bào (trả lời mục tiêu 2) đánh giá khả bám dính tế bào xương người vật liệu cách quan sát KHV điện tử quét (trả lời mục tiêu 3) Đánh khả bám dính quan sát SEM Xi măng TBOT Tạo khối xi măng có đường kính mm, chiều cao 1mm BioRootTM RCS AH26 Tạo dịch chiết xi măng nồng độ: 100%, 50%, 25%, 12,5% 6,25% theo ISO 10993-12:2012 Chuyển lên đĩa 96 giếng cho tế bào tiếp xúc với dịch chiết Đánh giá độc tính nồng độ dịch chiết xi măng sau 24 thử nghiệm MTT Chứng (+): dịch chiết latex Chứng (-): môi trường biệt hóa Xác định nồng độ dịch chiết tối ưu Cấy chuyển lên bề mặt Tế bào xương người biệt hóa từ tế bào gốc trung mơ thu từ mô mỡ người Đánh giá tăng sinh tế bào sau 2, 4, 6, 8, 10 ngày phương pháp đếm tế bào buồng đếm hồng cầu Chứng (-): mơi trường biệt hóa Sơ đồ 2.1: Tóm tắt quy trình nghiên cứu 2.3.2.1 Đánh giá độc tính vật liệu tế bào xương người thử nghiệm MTT * Ngày thứ nhất: Chuẩn bị dịch chiết vật liệu chuyển tế bào xương người lên đĩa 96 giếng Bước 1: Chuẩn bị dịch chiết vật liệu  Tạo dịch chiết xi măng: - Trộn loại xi măng theo hướng dẫn nhà sản xuất cho vào khuôn chuẩn bị sẵn, chờ đến khối vật liệu đông - Ngâm khối vật liệu vào mơi trường biệt hố falcon 15 ml theo tỷ lệ diện tích khối vật liệu:thể tích môi trường 300 mm2:1 ml (ISO 10993-12:2012)[58]  Tạo dịch chiết latex[8]: - Chuẩn bị latex có kích thước cm2 (chiều dài cm, chiều rộng cm) - Ngâm latex vào mơi trường biệt hóa falcon 15 ml theo tỷ lệ diện tích latex:thể tích mơi trường cm2:1 ml (ISO 10993-12:2012)[58]  Dán nhãn cho falcon: - Nhóm A (AH26): mơi trường + xi măng AH26 - Nhóm B (BioRootTM RCS): mơi trường + xi măng BioRootTM RCS - Nhóm C (Chứng âm): mơi trường biệt hóa khơng có xi măng - Nhóm D (Chứng dương): môi trường + latex  Bảo quản falcon tủ nuôi tế bào Sau 24 giờ, thu dịch chiết vật liệu Bước 2: Chuyển tế bào xương người lên đĩa 96 giếng  Chuyển tế bào xương người lên đĩa 96 giếng với mật độ 1x104 tế bào/giếng dung dịch Trypsin-EDTA  Nuôi tế bào đĩa 96 giếng tủ nuôi tế bào * Ngày thứ hai: Pha loãng dịch chiết thay môi trường nuôi tế bào Bước 1: Pha loãng dịch chiết  Sau 24 giờ, thu dịch chiết vật liệu (nồng độ 100%)  Tiến hành pha loãng dịch chiết loại xi măng thành nồng độ 50%, 25%, 12,5% 6,25%  Như vậy, lúc thu dịch chiết loại xi măng nồng độ khác 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%; chứng dương (dịch chiết latex 100%) chứng âm (mơi trường biệt hóa) Bước 2: Thay môi trường nuôi tế bào  Sau 24 giờ, hút bỏ môi trường cũ tất giếng, rửa nhẹ nhàng tế bào dung dịch PBS  Cho 100 μl dịch chiết xi măng vào giếng tương ứng (03 giếng/từng nồng độ dịch chiết loại xi măng)  Cho 100 μl dịch chiết latex vào giếng chứng dương (03 giếng)  Cho 100 μl mơi trường biệt hóa vào giếng chứng âm (03 giếng)  Ủ đĩa 96 giếng tủ nuôi tế bào 24 * Ngày thứ ba: Xác định tỷ lệ phần trăm tế bào sống thử nghiệm MTT  Sau 24 giờ, hút bỏ dịch chiết  Thêm 100 μl dung dịch MTT (1 mg/ml PBS) vào giếng ủ thêm  Thêm 100 μl dung dịch DMSO vào giếng để hồ tan tinh thể formazan hình thành  Đo mật độ quang (OD) bước sóng 490 nm máy phân tích MTT Ghi nhận kết  Chuyển số đo mật độ quang thành tỷ lệ phần trăm tế bào sống theo công thức sau: % tế bào sống = 100 x OD490e OD490b OD490e: mật độ quang dịch chiết vật liệu OD490b: mật độ quang chứng âm * Lặp lại thử nghiệm lần 2.3.2.2 Đánh giá mức độ tăng sinh tế bào xương người tiếp xúc với dịch chiết vật liệu phương pháp đếm tế bào buồng đếm hồng cầu 25 Chƣơng BÀN LUẬN Sự phát triển liên tục xi măng TBOT cho phép giải số lượng lớn trường hợp nội nha lâm sàng Tuy nhiên, xi măng TBOT gây kích thích mơ quanh chóp, ức chế q trình lành thương từ ảnh hưởng đến thành cơng điều trị nội nha[18] Do đó, tính chất sinh học xi măng TBOT phải đánh giá trước thức trở thành lựa chọn đáng tin cậy điều trị nội nha Nghiên cứu chúng tơi đánh giá tính gây độc tế bào mức độ tăng sinh tế bào xi măng TBOT calcium silicate BioRootTM RCS tế bào xương người so sánh với xi măng TBOT nhựa tiêu chuẩn AH26 thông qua mô hình ni cấy tế bào mơ tương tác xi măng trám bít với tế bào Ngồi ra, khả bám dính tế bào BioRootTM RCS khảo sát thông qua việc quan sát giá thể BioRootTM RCS cấy chuyển tế bào xương người lên bề mặt KHV điện tử quét (SEM) 4.1 ĐỘC TÍNH CỦA DỊCH CHIẾT VẬT LIỆU ĐỐI VỚI TẾ BÀO XƢƠNG NGƢỜI Như biết, xi măng TBOT phân loại dựa thành phần cấu trúc hóa học, gồm oxide kẽm-eugenol, calcium hydroxide, silicone, glass ionomer, nhựa epoxy methacrylate Trong đó, xi măng nhựa epoxy nhựa methacrylate thường ưu tiên sử dụng lâm sàng độ hòa tan chúng cải thiện đem lại kết điều trị tốt[20] Tuy nhiên, số nghiên cứu lại báo cáo tính gây đột biến gen xi măng nhựa epoxy phóng thích chất sinh ung tiềm bisphenol-A diglycidyl ether formaldehyde chưa có thống y văn nghiên cứu khác lại không phát phá hủy DNA nào[27, 47] Do đó, vật liệu calcium silicate ProRoot MTA (Dentsply, 26 Montigny-le-Bretonneux, Pháp) BiodentineTM (Septodont, Saint-Maur-desFosses, Pháp) trở thành ứng cử viên tốt nhờ tính chất sinh học bật chúng[59] Tuy nhiên, BiodentineTM khơng khuyến khích làm vật liệu TBOT độ qnh nó; cịn ProRoot MTA lại không định để TBOT độ quánh khó thao tác[14] đồng thời gây đổi màu diện bismuth oxide làm chất cản quang[61] Vì vậy, nhà nghiên cứu tiến hành nghiên cứu xi măng TBOT dựa thành phần có tiềm khống hố vật liệu tricalcium silicate cải thiện tính chất vật lý cách thao tác Trên sở đó, xi măng TBOT calcium silicate BioRootTM RCS phát triển biến đổi từ BiodentineTM Theo nhà sản xuất, BioRootTM RCS vật liệu nha khoa calcium silicate có độ tinh khiết cao Nó gồm bột chứa tricalcium silicate, zirconium oxide với chất lỏng nước chứa calcium chloride làm chất gia tốc cho phản ứng đông tác nhân hút nước[52] Mặc dù thay đổi nhằm cải thiện cách thao tác tránh gây đổi màu chúng ảnh hưởng đến khả tái tạo mơ xung quanh Do đó, cần phải có liệu tính tương hợp sinh học để đánh giá toàn nguy xi măng TBOT silicate Thử nghiệm tính gây độc tế bào in vitro bước thiết yếu trình khảo sát tính tương hợp sinh học, sử dụng tế bào mô để quan sát tăng trưởng, sinh sản hình thái tế bào tác động vật liệu Nó xem thử nghiệm dẫn đường số quan trọng để đánh giá độc tính vật liệu đơn giản, nhanh chóng, có độ nhạy cao giảm bớt số lượng thử nghiệm độc tính động vật[33] Có ba loại thử nghiệm tính gây độc tế bào trình bày Tổ chức Tiêu chuẩn Quốc tế 10993-5 (ISO 10993-5) thử nghiệm dịch chiết, thử nghiệm tiếp xúc trực tiếp thử nghiệm tiếp xúc gián tiếp[57] Nghiên cứu đánh giá tính gây độc tế bào thử nghiệm dịch chiết phù hợp cho việc xác định độc tính vật liệu có độ 27 hòa tan xi măng TBOT thường cho kết tương đương với kết thử nghiệm độc tính động vật Trong thử nghiệm dịch chiết, thử nghiệm MTT phương pháp sử dụng phổ biến để đánh giá tỷ lệ tăng trưởng tế bào độc tính mơi trường ni cấy Vì vậy, nghiên cứu chúng tơi sử dụng thử nghiệm MTT để đánh giá độc tính dịch chiết vật liệu tế bào, tương tự nghiên cứu trước đây[12, 18, 42] Bên cạnh đó, tế bào ni cấy từ mơ khác biểu enzyme chuyển hóa khác nhau, từ ảnh hưởng đến tính nhạy cảm với sản phẩm gây độc ngoại sinh tế bào, nên nhiều nghiên cứu trước sử dụng nguyên bào sợi dây chằng nha chu để đánh giá tính gây độc tế bào xi măng TBOT nguồn tế bào cho tái tạo mơ quanh chóp[7] Khác với nghiên cứu kể trên, nghiên cứu tiến hành tế bào xương người chúng tế bào đích xi măng TBOT Ngồi ra, nghiên cứu lựa chọn xi măng nhựa epoxy AH26 làm nhóm so sánh xi măng TBOT sử dụng rộng rãi bất chấp tính gây độc tế bào trộn[17] 4.1.1 Phần trăm tế bào sống tế bào xƣơng ngƣời tiếp xúc với dịch chiết vật liệu nồng độ khác Nghiên cứu cho thấy dịch chiết xi măng TBOT nhựa epoxy AH26 gây độc mức độ nhẹ tế bào xương người năm nồng độ 100%, 50%, 25%, 12,5% 6,25% (Bảng 3.1) Kết củng cố thêm việc phần trăm tế bào sống tế bào xương người tiếp xúc với dịch chiết AH26 nồng độ thấp nhóm chứng âm có ý nghĩa thống kê (Biểu đồ 3.1) Những kết phù hợp với quan sát nghiên cứu khác sử dụng AH26 cho hệ thống nuôi cấy tế bào khác Chẳng hạn nghiên cứu Huang cs (2002) nhận thấy dịch chiết AH26 gây độc tế bào hình mức độ từ nhẹ đến nặng tùy theo nồng độ dịch chiết, nhiều nghiên cứu in vitro in vivo khác nhận thấy mẫu AH26 vừa trộn trùng hợp 28 gây độc tế bào mạnh[19, 22, 37, 51] Các kết thực nghiệm xác nhận qua số báo cáo động vật[56] Như kết luận xi măng TBOT nhựa epoxy AH26 gây độc tế bào mức độ từ nhẹ đến trầm trọng Điều có lẽ methenamine thành phần bột AH26 Khi bị thủy phân, tạo ammonia formaldehyde[31] Các nhà nghiên cứu cho formaldehyde phóng thích từ AH26 trùng hợp ngun nhân giải thích cho tính gây độc tế bào cao suốt q trình đơng, đặc biệt giai đoạn đầu[54] Mặt khác, thành phần nước AH26 bisphenol-Adiglycidyl ether chứng minh yếu tố gây độc Các tác giả cho chất lỏng sót lại sau trộn AH26 gây độc nhiều so với xi măng trùng hợp, từ gây vấn đề sức khỏe[51] Do đó, việc trộn xi măng AH26 khơng hồn tồn vơ nguy hiểm Trong đó, xi măng TBOT calcium silicate BioRootTM RCS, có dịch chiết 100% ghi nhận gây độc tế bào xương người mức độ nhẹ (Bảng 3.1) Như biết, sống tế bào chịu ảnh hưởng từ nhiều yếu tố, số pH mơi trường Theo ISO 10993-5:2009 pH tối ưu cho môi trường nuôi cấy tế bào 7,2-7,4[57] Trong đó, BioRootTM RCS biết đến vật liệu dạng hydrate hóa có pH kiềm phóng thích calcium hydroxide[11] Theo nhà sản xuất, pH BioRootTM RCS lên tới 11,0[52]; cịn nghiên cứu Camps cs (2015) pH dịch chiết BioRootTM RCS sau 24 đo 8,4[12] Có lẽ lý giải thích cho tính gây độc nhẹ tế bào xương người dịch chiết BioRootTM RCS Điều mâu thuẫn với kết nghiên cứu trước BioRoot RCS khơng gây độc tế bào[12, 18, 42], khác cách chuẩn bị dịch chiết xi măng loại tế bào sử dụng nghiên cứu Kể từ nồng độ pha loãng 50%, dịch chiết BioRootTM RCS khơng cịn gây độc tế bào xương người (Bảng 3.1) Tuy nhiên, điều mâu thuẫn với kết so sánh phần trăm tế bào sống tế bào xương người tiếp xúc với dịch chiết BioRootTM RCS chứng âm phần trăm tế bào sống tiếp xúc với nồng 29 độ 50% thấp nhóm chứng âm có ý nghĩa thống kê (Biểu đồ 3.1) Vì vậy, giả thuyết nồng độ 25% nồng độ an toàn tối thiểu dịch chiết BioRootTM RCS tế bào xương người Đáng ý dịch chiết BioRootTM RCS nồng độ 12,5% 6,25% có phần trăm tế bào sống cao nhóm chứng âm có ý nghĩa thống kê (Biểu đồ 3.1) Điều gợi ý dịch chiết BioRootTM RCS từ nồng độ pha loãng 12,5% kích thích tế bào xương tăng sinh Kết phù hợp với nghiên cứu Camps cs (2015) BioRootTM RCS có khả kích thích tăng sinh di cư tế bào tiền thân dây chằng nha chu[12] Lý giải cho tính tương hợp tế bào thuận lợi BioRootTM RCS trước hết chất tricalcium silicate Như biết, xi măng TBOT tricalcium silicate phát triển tính chất lý-hố sinh học đầy hứa hẹn Hoạt tính sinh học kích thích tạo mơ cứng lành thương mơ mềm Nó cịn cải thiện tăng sinh biệt hóa tạo xương chứng minh qua tăng biểu số chất đánh dấu xương, chẳng hạn protein hình thái xương-2 (BMP-2)[10] Ngồi ra, phân tích EDS cho thấy BioRootTM RCS chủ yếu gồm calcium, zirconium, oxygen, carbon, silicon, chlorine mà không phát kim loại nặng yếu tố gây độc xi măng này[50] Các yếu tố ghi nhận phù hợp với mà nhà sản xuất BioRootTM RCS cung cấp Camilleri chứng minh[11] Kết so sánh phần trăm tế bào sống tế bào xương người tiếp xúc với dịch chiết BioRootTM RCS dịch chiết AH26 cho thấy phần trăm tế bào sống nhóm BioRootTM RCS cao nhóm AH26 tất nồng độ dịch chiết (Bảng 3.1), phù hợp với nghiên cứu Eldeniz cs (2015) cho thấy BioRootTM RCS có tính gây độc tế bào thấp so với xi măng TBOT khác gồm AH Plus, Acroseal, EndoRez, RealSeal SE, Hybrid Root SEAL, RootSP, MTA Fillapex[18] Tóm lại, nghiên cứu cho thấy dịch chiết chưa pha lỗng BioRootTM RCS có tính gây độc tế bào nhẹ tế bào xương người 30 có khác biệt kết nghiên cứu in vitro với thực tế lâm sàng Trên lâm sàng, vật liệu calcium silicate MTA BiodentineTM sử dụng môi trường miệng chúng tiếp xúc với mơ chứa dịch sinh lý bao gồm máu, huyết thanh, huyết tương, dịch ngà, dịch nướu [32] Khi có diện dịch mơ, hoạt tính sinh học calcium silicate diễn làm lắng đọng hydroxy apatite bề mặt vật liệu[32, 50] làm thay đổi đặc tính lý hố Bên cạnh đó, dịch mơ cịn có tác dụng pha lỗng nồng độ vật liệu theo thời gian Vì kết luận xi măng TBOT calcium silicate BioRootTM RCS có tính tương hợp tế bào thuận lợi so với nhiều xi măng TBOT thương mại khác lựa chọn tốt thực hành nội nha lâm sàng 4.1.2 Phần trăm tế bào sống tế bào xƣơng ngƣời tiếp xúc với nồng độ dịch chiết khác vật liệu Mặc dù thử nghiệm MTT có nhiều ưu điểm gặp phải số vấn đề áp dụng nghiên cứu Một số sử dụng liều lượng dịch chiết khác thu kết đánh giá khác Vì vậy, nhiều nghiên cứu khơng đánh giá độc tính vật liệu thơng qua thử nghiệm dịch chiết mà cịn đánh giá độc tính nhiều liều lượng dịch chiết khác vật liệu Tuy nhiên, chúng tơi nhận thấy khơng có thống cách pha lỗng dịch chiết nghiên cứu Có ba cách pha loãng dịch chiết thường sử dụng pha loãng theo nồng độ, pha loãng theo tỷ lệ thể tích pha lỗng dựa hàm lượng vật liệu dịch chiết (tức khối lượng vật liệu (mg) ml dịch chiết, tính đơn vị mg/ml) Trong nghiên cứu này, tạo dịch chiết vật liệu theo tiêu chuẩn ISO 10993-5:2009 tiến hành pha loãng thành nồng độ 50%, 25%, 12,5% 6,25% cách pha lỗng đơn giản xác Kết nghiên cứu cho thấy phần trăm tế bào sống tế bào xương người tiếp xúc với nồng độ dịch chiết khác xi măng sử dụng nghiên cứu có khác biệt có ý nghĩa thống kê số nồng độ (Biểu đồ 3.2 31 Biểu đồ 3.3), phù hợp với kết nghiên cứu trước đánh giá tính gây độc tế bào nhiều nồng độ dịch chiết khác nhau[25-27] Từ cho thấy xi măng TBOT BioRootTM RCS AH26 gây độc tế bào xương người theo kiểu phụ thuộc liều 4.1.3 Phƣơng trình hồi quy độc tính tế bào xƣơng ngƣời theo nồng độ dịch chiết vật liệu Kết phân tích hồi quy tuyến tính cho thấy nồng độ dịch chiết xi măng TBOT yếu tố ảnh hưởng đến phần trăm tế bào sống tế bào xương người Đây mối tương quan nghịch, chặt (Biểu đồ 3.4) Nó củng cố thêm cho kết luận hai vật liệu sử dụng nghiên cứu gây độc tế bào xương người theo kiểu phụ thuộc liều Nói cách khác, nồng độ dịch chiết xi măng TBOT BioRootTM RCS AH26 tăng phần trăm tế bào sống tế bào xương người thấp, nghĩa độc tính tế bào xương người cao 4.2 MỨC ĐỘ TĂNG SINH CỦA TẾ BÀO XƢƠNG NGƢỜI KHI TIẾP XÚC VỚI DỊCH CHIẾT VẬT LIỆU Một số nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng nồng độ dịch chiết thời gian lên tính gây độc tế bào cho thấy nồng độ thay đổi thời điểm xuất độc tính khác Trong giới hạn định, độc tính tăng dần theo thời gian[33] Do đó, việc đánh giá mức độ tăng sinh tế bào sau tiếp xúc với dịch chiết vật liệu quan trọng Sự tăng sinh tế bào đánh giá phương pháp gián tiếp trực tiếp Phương pháp gián tiếp phương pháp đánh giá dựa mật độ quang dịch chiết để tính phần trăm tế bào sống thời điểm, từ đưa nhận xét tăng sinh tế bào sau tiếp xúc với dịch chiết Phần lớn nghiên cứu thường đánh giá tăng sinh tế bào phương pháp này, nhiên cho biết diện tế bào sống dịch chiết không xác định mật độ tế bào giếng ni cấy Do đó, nghiên cứu chúng tơi tiến hành xác định mật độ tế bào phương pháp buồng đếm hồng cầu 32 xem tiêu chuẩn để đếm tế bào có độ xác cao, trực quan hiệu quả[35, 55] Dựa kết thử nghiệm MTT, chọn nồng độ dịch chiết xi măng có độc tính tế bào xương người thấp nồng độ 6,25% để tiến hành đánh giá tăng sinh tế bào xương người Mức độ tăng sinh tế bào đánh giá dựa mật độ tế bào xương người sau tiếp xúc với dịch chiết vật liệu thời điểm 2, 4, 6, 8, 10 ngày Từ kết thu được, xây dựng đường tăng trưởng tế bào xương người sau tiếp xúc với dịch chiết BioRootTM RCS dịch chiết AH26 nồng độ 6,25% bên cạnh đường cong tăng trưởng bình thường tế bào xương người (chứng âm) (Biểu đồ 3.6) Khi xem xét đường cong tăng trưởng bình thường tế bào xương người, chúng tơi nhận thấy khoảng thời gian từ ngày đến ngày giai đoạn hồi phục quần thể tế bào sau trình cấy chuyển đạt bám dính ổn định Từ ngày đến ngày giai đoạn tăng sinh quần thể tế bào Đây giai đoạn tế bào ổn định phát triển, đồng thời giai đoạn tế bào có hoạt động trao đổi chất diễn mạnh mẽ Sau tế bào tăng sinh đạt đỉnh cực đại vào ngày 8, mật độ tế bào bắt đầu giảm xuống tốc độ phân chia trao đổi chất tế bào bắt đầu giảm Bên cạnh đó, diện tích bề mặt ni cấy khơng đổi tế bào tiếp tục tăng sinh gây tượng kìm hãm tiếp xúc khiến cho tế bào chết Ở nhóm dịch chiết AH26, đường tăng trưởng tế bào xương người gần đường tuyến tính giảm dần theo thời gian Điều hoàn toàn phù hợp với kết thử nghiệm MTT dịch chiết AH26 gây độc nhẹ tế bào xương người Ngược lại, nhóm dịch chiết BioRootTM RCS, đường cong tăng trưởng tế bào xương người có hình dạng tương tự đường cong tăng trưởng bình thường mức độ tăng sinh tế bào thấp Có thể lý giải cho điều cho pH kiềm dịch chiết BioRootTM RCS nghiên cứu in vitro trước chứng minh pH kiềm ảnh hưởng đến tăng sinh tế bào[36] Tuy nhiên, 33 điều kiện lâm sàng, pH kiềm trung hịa pH acid giúp mơi trường trở pH tối ưu Ngồi ra, BioRootTM RCS cịn chứng minh kích thích tiết yếu tố tăng trưởng tạo mạch yếu tố tăng trưởng tạo xương[12] Vì kết luận xi măng TBOT calcium silicate BioRootTM RCS tạo thuận lợi cho tăng sinh tế bào xương người 4.3 KHẢ NĂNG BÁM DÍNH CỦA TẾ BÀO XƢƠNG NGƢỜI TRÊN XI MĂNG BIOROOTTM RCS Sự bám dính tế bào bước trước tế bào tăng sinh, biệt hóa, sản xuất khn khống hóa ngoại bào chất Do đó, bám dính tế bào lên vật liệu sinh học nội nha thường xem tiêu chuẩn đánh giá tính chất sinh học chúng KHV điện tử quét (SEM) công cụ giúp cung cấp thông tin quan trọng tính tương hợp sinh học vật liệu cách hỗ trợ quan sát hình thái tế bào tương tác vật liệu-tế bào[3] Để chuẩn bị mẫu cho khảo sát SEM, mẫu vật liệu calcium silicate thường khảo sát sau trộn để chúng đông khoảng thời gian định[3] Nguyên nhân điều khảo sát tính chất bám dính tế bào MTA dạng trộn vật liệu phóng thích lượng đáng kể sản phẩm hóa học phụ gây độc cho tế bào nuôi cấy[9, 32, 40] Tuy nhiên, thực tế lâm sàng, sản phẩm phụ thường bị hịa tan dịch mơ kẽ bị thải trừ qua mạch máu[41] Do đó, việc sử dụng mẫu calcium silicate đông để khảo sát SEM hợp lý Vì vậy, nghiên cứu khảo sát khả bám dính tế bào mẫu BioRootTM RCS sau đơng Trước cấy chuyển tế bào lên vật liệu, ngâm mẫu BioRootTM RCS dung dịch muối đệm phosphate tuần rửa lại nước cất, sau ngâm mơi trường biệt hóa 48 tương tự số nghiên cứu trước ngâm lại mẫu nghiên cứu môi trường nuôi cấy nước cất khoảng thời gian định[5, 29, 34] Bước nhằm đảm bảo loại bỏ sản phẩm phụ có tiềm gây độc ảnh hưởng đến bám dính tế bào nuôi cấy lên bề mặt vật liệu[34] Tuy nhiên, số nhà nghiên cứu lo ngại 34 việc loại bỏ chất phóng thích từ vật liệu dẫn tới đánh giá q mức tính chất sinh học vật liệu, đặc biệt ngâm mẫu sau đơng[5, 29, 34] độc so với dạng trộn sử dụng lâm sàng Do đó, bước cịn gây tranh cãi chưa rút kết luận cuối Y văn cho thấy dòng tế bào sarcom xương người (MG-63 Saos-2) tế bào sử dụng phổ biến để đánh giá khả bám dính tế bào vật liệu calcium silicate[40] Cả hai dòng tế bào sarcom xương sở hữu số đặc trưng nguyên bào xương; nhiên, chúng lại biểu chức phân tử tế bào bất thường thay đổi nhiễm sắc thể[39] Như vậy, dịng tế bào khơng hồn tồn phù hợp cho việc nghiên cứu tất khía cạnh chức nguyên bào xương Do đó, nghiên cứu chúng tơi sử dụng tế bào xương người phân lập nuôi cấy theo quy trình chuẩn [1, 60] để đánh giá xác tính chất tế bào Sự bám dính trải rộng tế bào bề mặt vật liệu giai đoạn khởi đầu chức tế bào bình thường Do đó, tế bào tiếp tục trì hình dạng trịn mà khơng có trải rộng tạo khơng bào tế bào chất bề mặt vật liệu gây độc Các nhà nghiên cứu thường giải thích hình ảnh SEM tiêu chuẩn Bên cạnh đó, số tác giả khác cịn trình bày hệ thống mơ tả hình thái tế bào để xếp hạng đáp ứng tế bào với vật liệu sinh học nhằm cung cấp đánh giá định lượng Tuy nhiên, hệ thống định lượng không phù hợp với vật liệu calcium silicate, đặc biệt hệ thống dựa phần trăm tế bào sống-chết phầm trăm diện tích tế bào bao phủ mức độ bao phủ tế bào khơng phải dấu hiệu lý tưởng tương tác tế bào-vật liệu số lượng tế bào tăng trưởng trải rộng chủ yếu phụ thuộc vào thời gian ủ[3] Trong nghiên cứu chúng tôi, quan sát SEM cho thấy tế bào xương người bám dính khoảng 80% bề mặt giá thể BioRootTM RCS (Hình 3.2), đa số có hình dạng trịn số có hình đa diện (Hình 3.3) Điều 35 chất cịn sót lại sinh từ phản ứng hóa học vật liệu calcium silicate với hóa chất sử dụng trình xử lý, cụ thể phóng thích cation khởi phát kết tủa bề mặt dịch xung quanh[50] Sự tương tác làm phức tạp việc diễn giải hình thái tế bào, đặc biệt tế bào nhỏ trịn có tế bào chất tế bào phổ biến mẫu khảo sát vịng 24 nghiên cứu chúng tơi Khơng vậy, độ phóng đại lớn x1300, chúng tơi cịn quan sát được phần tế bào chất mở rộng (Hình 3.4) Do đó, kết luận BioRootTM RCS có tính chất bám dính tế bào thuận lợi, phù hợp với kết thử nghiệm gây độc tăng sinh tế bào trình bày Khi quan sát bề mặt xi măng BioRootTM RCS, kết cho thấy bề mặt nhám có vi lỗ với kích thước khoảng 10 µm Đây sở cho phần tế bào chất mở rộng chui vào hỗ trợ cho bám dính tế bào bề mặt Ngoài ra, kết SEM nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu khác khả bám dính tế bào cơng thức MTA thương mại, báo cáo hình thành tinh thể hợp chất calcium (chủ yếu calcium carbonate calcium phosphate) với hình dạng kích thước khác nhau[23, 34] Những tinh thể quan sát thêm chất gia tốc cho phản ứng đông calcium chloride dihydrate (CaCl2.2H2O) vào MTA trắng, tương tự công thức hóa học BioRootTM RCS Đáng ý tinh thể khơng ngăn cản bám dính trải rộng tế bào[34] Mặc dù SEM cung cấp thơng tin hữu ích khả bám dính tế bào vật liệu chủ yếu phân tích định tính Do đó, thử nghiệm bám dính định tính và/hoặc định lượng ln cần kết hợp với thử nghiệm khác tăng sinh độ sống tế bào để ghi nhận xác tính chất sinh học vật liệu sinh học 36 Hạn chế đề tài Mặc dù mô hình sử dụng nghiên cứu lặp lại số khía cạnh tương tác xi măng trám bít ống tủy với tế bào xương người, có số hạn chế nghiên cứu thực vật liệu đông, trong thể sống lại sử dụng vật liệu chưa đơng Do đó, chưa thể xác định mối tương quan kết nghiên cứu in vitro với thực tế lâm sàng Ngồi ra, BioRootTM RCS vật liệu nên có nghiên cứu tương đồng mục tiêu, đặc biệt chưa có nghiên cứu đánh giá tế bào xương người làm cho phần bàn luận phong phú Phần bàn luận sử dụng số kết từ nghiên cứu vật liệu calcium silicate khác MTA BiodentineTM có thành phần hóa học tương tự BioRootTM RCS để bàn luận kết nghiên cứu chúng tơi khơng xác Ý nghĩa lâm sàng ứng dụng đề tài Tính tương hợp sinh học xi măng nội nha điều kiện điều trị nội nha thành công lành thương mơ nha chu Do đó, cần lựa chọn cẩn thận xi măng trám bít ống tủy thích hợp dựa tính chất vật lý tính tương hợp sinh học Nghiên cứu chúng tơi nghiên cứu sở, bước đầu xác định đáp ứng sinh học tế bào xương người xi măng trám bít ống tủy calcium silicate BioRootTM RCS Kết nghiên cứu cho thấy tế bào xương người có khả sống tăng sinh sau tiếp xúc gián tiếp với BioRootTM RCS thông qua dịch chiết đồng thời có khả bám dính lên bề mặt vật liệu có hoạt tính sinh học (tiếp xúc trực tiếp) Dựa tính chất này, giả thuyết BioRootTM RCS có khả kích thích tế bào xương tăng trưởng phát triển để tạo xương Đây điều kiện tiên cho tái tạo mơ quanh chóp Kết nghiên cứu số liệu lần công bố, cung cấp chứng khoa học mức độ tế bào giúp Bác sĩ Răng Hàm Mặt hiểu 37 chủ động lựa chọn xi măng trám bít ống tủy sử dụng lâm sàng nhằm nâng cao tỷ lệ thành công điều trị nội nha Đề xuất hƣớng nghiên cứu Từ hạn chế nêu trên, đề xuất nghiên cứu đánh giá đáp ứng sinh học tế bào xương người xi măng trám bít ống tủy BioRootTM RCS vừa trộn để phù hợp với thực tế lâm sàng 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Qua nghiên cứu in vitro đánh giá tính tương hợp sinh học xi măng trám bít ống tủy calcium silicate BioRootTM RCS tế bào xương người, rút số kết luận sau đây: Độc tính dịch chiết xi măng trám bít ống tủy tế bào xƣơng ngƣời:  Dịch chiết xi măng AH26 gây độc tế bào nhẹ năm nồng độ 100%, 50%, 25%, 12,5% 6,25%  Dịch chiết xi măng BioRootTM RCS gây độc tế bào xương người nồng độ 100% với mức độ nhẹ Từ nồng độ pha loãng 50% trở đi, dịch chiết xi măng khơng cịn gây độc tế bào Mức độ tăng sinh tế bào xƣơng ngƣời sau tiếp xúc với dịch chiết xi măng trám bít ống tủy:  Đường tăng trưởng tế bào xương người sau tiếp xúc với dịch chiết nồng độ 6,25% xi măng AH26 gần đường tuyến tính giảm dần theo thời gian, nghĩa xi măng AH26 không hỗ trợ cho tế bào xương người tăng sinh  Đường tăng trưởng tế bào xương người sau tiếp xúc với dịch chiết nồng độ 6,25% xi măng BioRootTM RCS có hình dạng tương tự đường cong tăng trưởng tế bào bình thường mức độ thấp hơn, gợi ý xi măng BioRootTM RCS có khả kích thích tế bào xương người tăng sinh Khả bám dính tế bào xƣơng ngƣời lên xi măng trám bít ống tủy BioRootTM RCS:  Hình ảnh SEM bề mặt giá thể BioRootTM RCS cấy chuyển tế bào xương người cho thấy tế bào có khả bám dính bề mặt giá thể, có dạng hình trịn đa diện, có phần tế bào chất mở rộng bao phủ khoảng 80% 39 bề mặt Như vậy, xi măng BioRootTM RCS có tính chất bám dính tế bào thuận lợi Những kết luận cho thấy xi măng trám bít ống tủy calcium silicate BioRootTM RCS vật liệu tương hợp sinh học Đây tiêu chuẩn đảm bảo cho thành công điều trị nội nha KIẾN NGHỊ Nghiên cứu nghiên cứu đánh giá đáp ứng tế bào xương người xi măng trám bít ống tủy calcium silicate BioRootTM RCS Những kết ban đầu nghiên cứu tương đối khả quan, kết hợp với nghiên cứu khác giới BioRootTM RCS, đề xuất xi măng trám bít ống tủy nhóm calcium silicate mà nhà thực hành lựa chọn điều trị nội nha, chưa có báo cáo kết lâm sàng vật liệu Do đó, chúng tơi mong muốn có thêm nghiên cứu vật liệu BioRootTM RCS trộn nghiên cứu theo dõi lâm sàng vật liệu tương lai để cung cấp thêm nhiều chứng khoa học mạnh phù hợp với thực tế lâm sàng ... nhất, thực nghiên cứu ? ?Hiệu kháng khuẩn độc tính với tế bào xƣơng xi măng trám bít ống tủy BiorootTM RCS: Nghiên cứu in vitro” với mục tiêu cụ thể sau: Xác định so sánh độc tính tế bào xương người... đánh giá tính tương hợp sinh học xi măng trám bít ống tủy calcium silicate BioRootTM RCS tế bào xương người, rút số kết luận sau đây: Độc tính dịch chiết xi măng trám bít ống tủy tế bào xƣơng ngƣời:... giá tính gây độc tế bào xi măng TBOT nguồn tế bào cho tái tạo mơ quanh chóp[7] Khác với nghiên cứu kể trên, nghiên cứu tiến hành tế bào xương người chúng tế bào đích xi măng TBOT Ngồi ra, nghiên