HOẠT ĐỘNG KH-CN NGHIÊN CỨu Quy TRìNH CơNG NGHỆ CHIẾT TÁCH CÁC CHấT fLAVONOId VÀ sTeROL T CÂY DI P CÁ T I NGH AN n Ngơ Hồng Linh Trung tâm Ứng dụng TB KH&CN Nghệ An I ĐẶT VẤN ĐỀ Diếp cá gọi dấp cá, tiếng Hán gọi ngư tinh thảo; tên khoa học Houttuynia cordata Thunb thuộc họ dấp (saururaceae) Ở nước ta, diếp cá mọc hoang khắp nơi, thường vùng đất ẩm Hiện nay, diếp cá trồng làm rau gia vị dùng làm vị thuốc quý cho nhiều thuốc dân gian chữa nhiều bệnh, phận dùng toàn (phần nằm mặt đất) tươi khô Theo kết nghiên cứu sơ công bố gần đây, 100g rau diếp cá có: nước: 91,5%; protid: 2,9%, glucid: 2,7%, lipid: 0,5%, cellulose: SỐ 11/2017 1,8%, calci: 0,3mg, kali: 0,1mg, tiền vitamin A: 1,26mg, vitamin C: 68mg Nhưng thành phần quan trọng rau diếp cá chất flavonoid sterol chiếm khoảng 6-7% so với trọng lượng khô Các hoạt chất sinh học thường chiết tách từ thân diếp cá phương pháp trích ly với dung môi hữu thông dụng etanol, etyl acetat, n-Butanol Nhờ chứa lượng đáng kể hoạt chất mà diếp cá có tác dụng kháng khuẩn, kháng virút, có khả hỗ trợ điều trị nhiều bệnh như: lọc máu, giải độc, giải nhiệt, kháng viêm, tăng sức miễn dịch thể, làm giảm tổn thương gan, bảo vệ chức gan, ngăn chặn q trình oxy hóa gốc tự khử gốc tự do, chữa bệnh trĩ Trên sở đó, năm 2015, UBND tỉnh Nghệ An giao cho Trung tâm Ứng dụng tiến KH&CN Nghệ An triển khai đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất đồ uống chức hòa tan dạng bột dạng lỏng từ diếp cá phục vụ tiêu dùng” Trong khuôn khổ đề tài, tiến hành nghiên cứu quy trình cơng nghệ chiết tách chất flavonoid sterol từ diếp cá nhằm tạo sở cho việc khai thác ứng dụng diếp cá cho số ngành y học, thực phẩm chức II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Nguyên liệu toàn thân diếp cá (phần mặt đất) thu hái huyện Nam Đàn - tỉnh Nghệ An Mẫu lấy vào lúc 6-8h vào buổi sáng Phương pháp nghiên cứu - Sử dụng phương pháp phân tích truyền thống theo TCVN phương pháp phân tích Tạp chí KH-CN Nghệ An [15] HOẠT ĐỘNG KH-CN thiết bị đại GC, GC-MS, HPLC, LC-MS, UV… để phân tích nguyên liệu - Sử dụng phương pháp chưng cất theo nước kết hợp với phương pháp xử lý nguyên liệu để tách tinh dầu diếp cá - Sử dụng phương pháp truyền thống trích ly rắn lỏng sử dụng dung môi sạch, thân thiện để thu nhận hoạt chất flavonoid sterol từ diếp cá III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết nghiên cứu tách chiết (trích ly) flavonoid sterol 1.1 Nghiên cứu lựa chọn dung mơi trích ly cho q trình thu nhận flavonoid sterols Dung mơi đóng vai trị quan trọng q trình trích ly Đối với q trình trích ly flavonoid sterols, dung mơi thường sử dụng acetone, methanol, ethanol nước với nồng độ khác Chúng tiến hành khảo sát với loại dung môi: EtOH 96%, EtOH 70%, EtOH 50%, EtOH 25% nước Các thí nghiệm tiến hành với số lần chiết xuất lần, thời gian chiết 1h/lần, nhiệt độ 60oC, chiết hồi lưu Mỗi mẫu thí nghiệm có khối lượng ngun liệu khoảng: 50g Kết thí nghiệm thể bảng Bảng Hiệu suất tách chiết flavonoid tổng số hàm lượng sterols tổng số diếp cá dung môi khác Dung môi Hiệu suất Khối Flavonoid Sterols chiết lượng tổng số tổng số Flavonoid mẫu (%) (mg/100g) (%) Etanol 96% 50,05 5,81 Etanol 50% 50,10 6,29 Etanol 70% Etanol 25% Nước 50,08 50,06 50,10 11,52 17,82 12,36 18,63 6,35 12,69 5,02 10,66 4,28 8,35 18,69 16,09 10,02 Số liệu bảng cho thấy, dung môi tách chiết sử dụng để chiết flavonoid sterols từ diếp cá dung môi EtOH 70% dung môi chiết nhiều flavonoid sterol Tuy nhiên, hiệu suất chiết xuất flavonoid EtOH 50% đạt cao Lượng favonoid sterols có cao chiết EtOH 50% gần tương đương với chiết EtOH SỐ 11/2017 70%, đồng thời sử dụng EtOH 50% giúp giảm bớt chi phí tiến hành sản xuất so với dùng EtOH 70% Do đó, ưu tiên lựa chọn dung môi EtOH 50% 1.2 Nghiên cứu lựa chọn nhiệt độ trích ly cho q trình thu nhận Flavonoid Sterols Sau chọn dung mơi trích ly phù hợp EtOH 50%, tiếp tục khảo sát tìm nhiệt độ trích ly phù hợp Các nhiệt độ khảo sát độ phòng, 600C, 800C (gần nhiệt độ sôi dung môi) Các yếu tố công nghệ giữ nguyên không đổi Kết khảo sát nhiệt độ trích ly thể bảng Bảng Hiệu suất trích ly flavonoid tổng số hàm lượng sterols diếp cá chiết nhiệt độ khác Nhiệt độ (0C) Hiệu suất Khối Flavonoid Sterols chiết lượng tổng số tổng số Flavonoid (mg/100g) mẫu (g) (%) (%) 60 50,01 6,52 13,06 18,73 Nhiệt độ phòng 50,01 3.61 7,86 13,25 80 50,03 6,55 13,10 17,22 Kết bảng cho thấy, nhiệt độ trích ly tăng hiệu suất thu nhận flavonoid tăng, nhiên nhiệt độ 600C 800C hiệu suất thu nhận flavonoid tổng số chênh lệch không đáng kể Mà nhiệt độ 600C, hàm lượng sterols tổng số cao Vì nhiệt độ cao (800C) thời gian 1h, nên sterols biến đổi phần Do vậy, xét mặt kinh tế chất lượng sản phẩm, lựa chọn nhiệt độ thích hợp cho q trình trích ly flavonoid từ diếp cá 600C 1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian trích ly số lần trích ly đến hiệu suất trích ly flavonoid hàm lượng sterols diếp cá Sau khảo sát lựa chọn dung môi chiết EtOH 50% trích ly nhiệt độ 600C, chúng tơi tiến hành khảo sát thời gian số lần trích ly Các thông số công nghệ giữ nguyên không đổi Kết thể bảng Tạp chí KH-CN Nghệ An [16] HOẠT ĐỘNG KH-CN Bảng Ảnh hưởng thời gian số lần trích ly đến hàm lượng flavonoid hàm lượng sterols diếp cá Thời gian trích ly (giờ) 0,5 Số lần trích ly Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Khối lượng mẫu (g) 50,00 50,03 50,01 Tiến hành khảo sát thời gian số lần chiết dựa bột chiết nhận thấy: + Khi thời gian chiết tăng hàm lượng flavonoid sterols tăng lên Hàm lượng flavonoid sterols thu tập trung chủ yếu lần chiết + Hàm lượng flavonoid sterols thu với thời gian chiết 1h/lần không khác biệt nhiều so với 2h/lần, xét hiệu kinh tế, chọn thời gian trích ly 1h/lần Vậy, lựa chọn thời gian chiết 1h/lần tiết kiệm chi phí so với 2h/lần Flavonoid tổng số (%) 3,56 1,28 0,89 4, 05 2,29 0,300 5,10 1,36 0,100 Sterols tổng số (mg/100g) 10,02 5,31 2,06 11,26 6,98 0,42 12,38 6,01 0,30 Đồng thời tổng hàm lượng flavonoid sterols thu lần chiết đầu điều kiện 1h/lần, lần chiết sản phẩm thu Do lựa chọn thời gian chiết 1h/lần x lần phù hợp 1.4 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung mơi thích hợp cho q trình trích ly Để lựa chọn tỷ lệ ngun liệu/dung mơi (NL/DM) thích hợp cho q trình trích ly đạt hiệu cao nhất, khảo sát tỷ lệ sau: 1/10, 1/15, 1/20, 1/25 Các điều kiện công nghệ khác giữ nguyên không thay đổi Bảng Ảnh hưởng tỷ lệ NL/DM đến hiệu suất trích ly flavonoid hàm lượng sterols diếp cá Tỷ lệ NL/DM (m/v) 1/10 1/15 1/20 1/25 Khối lượng Flavonoid Hiệu suất chiết mẫu (g) tổng số (%) Flavonoid (%) 50,06 5,25 50,02 6,61 50,03 50,02 6,03 6,63 Kết bảng cho thấy, tỷ lệ NL/DM thích hợp 1/20 lượng dung môi tăng lên (tỷ lệ NL/DM 1/25) hiệu suất trích ly thu nhận hợp chất flavonoid tăng lên không nhiều, nhiên hàm lượng sterols có xu hướng giảm Vậy, xét hiệu kinh tế, lựa chọn tỷ lệ NL/DM 1/20 cho thí nghiệm SỐ 11/2017 11,18 Sterols tổng số (mg/100g) 16,68 12,19 17,91 13,99 18,72 13,80 18,75 1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng tốc độ khuấy trộn đến hiệu suất trích ly Tốc độ khuấy trộn ảnh hưởng lớn đến hàm lượng flavonoid setrols có mẫu Do vậy, chúng tơi tiến hành khảo sát với tốc độ khuấy trộn khác nhau: 100, 200, 300, 400 vịng/phút Các điều kiện cơng nghệ giữ ngun khơng đổi Kết trình bày bảng Tạp chí KH-CN Nghệ An [17] HOẠT ĐỘNG KH-CN Bảng Ảnh hưởng tốc độ khuấy trộn đến hiệu suất trích ly Tốc độ khuấy Khối lượng Flavonoid Hiệu suất chiết Sterols tổng số trộn (vòng/phút) mẫu (g) tổng số (%) Flavonoid (%) (mg/100g) 100 200 300 400 50,01 50,03 50,05 50,03 Từ kết thu được, chúng tơi lựa chọn tốc độ khuấy trộn thích hợp 200 vịng/phút Quy trình cơng nghệ tách chiết hoạt chất flavonoid sterol Sơ đồ quy trình cơng nghệ tách chiết hoạt chất flavonoid sterol Thuyết minh quy trình: * Xử lý nguyên liệu + Nguyên liệu diếp cá loại bỏ tạp chất, rửa sạch, sấy khô nhiệt độ 600C đến đạt độ ẩm 6-8% (đo máy xác định độ ẩm nhanh) + Nguyên liệu sau sấy đến độ ẩm quy định xay đến độ mịn từ 1-2mm bảo quản túi PE dung để chiết tách flavonoid sterol * Trích ly + Cho nguyên liệu xay mịn dung môi Etanol (EtOH) 50% vào thiết bị trích ly với tỷ lệ SỐ 11/2017 6,06 6,59 6,52 6,50 12,05 13,26 13,09 13,00 18,48 18,85 18,82 18,63 NL/DM 1/12 (m/v) lần + Tiến hành gia nhiệt đến 600C đưa vào khuấy với tốc độ 200 vòng/phút thời gian Sau lọc lấy dịch trích ly + Phần bã sau trích ly lần tiếp tục cho dung mơi vào trích ly tiếp lần với tỷ lệ NL/DM 1/8 (m/v), điều kiện trích ly tương tự lần Trong q trình trích ly, nguyên liệu dung môi đảo trộn cánh khuấy với tốc độ 200 vòng/phút, lọc bỏ bã cô đuổi dung môi thu cao chiết flavonoid * Cơ đuổi dung mơi Dịch trích ly đuổi dung môi thiết bị bốc màng mỏng áp suất chân không 550 mbar; áp suất 1,2 at; nhiệt độ kết thúc 600C Sau đó, tiếp tục cô đặc thiết bị cô quay chân không RV10 BASIC V- IKA áp suất chân không 200 mbar, nhiệt độ 500C thu cao chiết giàu flavonoid * Tinh chế cao chiết flavonoid + Cao chiết giàu flavonoid tách cột inox có kích thước 80xØ15cm, chất nhồi cột nhựa hấp phụ Amberlite XAD-2 Sigma-Aldric Co + Cho nguyên liệu vào cột với tỷ lệ nguyên liệu /gel 1/30 (m/m) + Rửa giải hệ dung môi H2O EtOH + Rửa H2O với tỷ lệ H2O/flavonoid thô 30/1 (v/v) để loại bỏ đường + Rửa EtOH với tỷ lệ EtOH/flavonoid thô 50/1 (v/v) để thu nhận chất flavonoid, tốc độ rửa giải 50ml/phút + Phân đoạn EtOH sau qua cột cô đuổi bớt 3/4 lượng dung môi * Sấy đông khô chân không - Sau cô đuổi bớt dung môi đem dung dịch lạnh đông nhiệt độ từ -18 đến -200C thời gian từ 10-12h - Sau giai đoạn lạnh đông sản phẩm, đem sấy hệ thống thăng hoa chân không áp suất 0,2mmHg thời gian 12 nhận sản phẩm bột giàu hoạt chất Flavonoid có độ ẩm ≤6%, với độ tinh khiết cao./ Tạp chí KH-CN Nghệ An [18] ... vịng/phút Quy trình cơng nghệ tách chiết hoạt chất flavonoid sterol Sơ đồ quy trình cơng nghệ tách chiết hoạt chất flavonoid sterol Thuyết minh quy trình: * Xử lý nguyên liệu + Nguyên liệu diếp cá loại... môi tách chiết sử dụng để chiết flavonoid sterols từ diếp cá dung mơi EtOH 70% dung môi chiết nhiều flavonoid sterol Tuy nhiên, hiệu suất chiết xuất flavonoid EtOH 50% đạt cao Lượng favonoid sterols... để tách tinh dầu diếp cá - Sử dụng phương pháp truyền thống trích ly rắn lỏng sử dụng dung môi sạch, thân thiện để thu nhận hoạt chất flavonoid sterol từ diếp cá III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết nghiên