Trong môi trường acid, Coomassie Brilliant Blue G-250 liên kết chặt chẽ với protein, tương tác với cả nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein làm dung dị[r]
(1)4.3 Xác định hàm lượng protein phương pháp Bradford 4.3.1 Nguyên tắc
Dựa vào phản ứng màu protein với xanh Coomassie (Coomassie Brilliant Blue G-250) khả hấp thụ ánh sáng bước sóng 595 nm Trong mơi trường acid, Coomassie Brilliant Blue G-250 liên kết chặt chẽ với protein, tương tác với nhóm kỵ nước nhóm mang điện tích dương phân tử protein làm dung dịch có màu xanh Cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein dung dịch Dựa vào đường chuẩn protein suy hàm lượng protein dung dịch mẫu
(2)4.3.2 Cách tiến hành 4.3.2.1 Lập đường chuẩn
Tiến hành theo bảng 2.4
Bảng 2.4 Chuẩn bị ống nghiệm xây dựng đường chuẩn
Dựng đường chuẩn albumin biểu diễn tương quan lượng albumin giá trị OD đo bước sóng 595 nm
4.3.2.2 Xác định hàm lượng protein Lấy ống nghiệm:
- Ống thí nghiệm: 0,1 ml dung dịch protein (enzyme) + ml Bradford - Ống đối chứng: 0,1 ml nước cất + ml Bradford
Đem đo độ hấp thụ bước sóng 595 nm ghi nhận mật độ quang sau phút đến Từ giá trị OD đo được, dựa vào đường chuẩn albumin suy hàm lượng protein
Hóa chất Đơn vị
Các ống nghiệm Ống 0 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5 Dung dịch albumin
0,01% ml 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Nước cất ml 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5
Nồng độ albumin µg/ml 10 20 30 40 50
Thuốc thử Bradford ml 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Lắc Để yên 10 phút Đo độ hấp thụ bước sóng 595 nm