Xác định hàm lượng Anthocyanin bằng phương pháp pH vi sai

Anthocyanin là hợp chất hữu cơ có nguồn gốc tự nhiên, thuộc họ flavonoid. Tất cả các flavonoid thì đều có cùng 1 khung xương cơ bản (C6-C3-C6). Flavonoids được hydroxy hóa (-OH) hoặc methoxylated (-OCH3) với mức độ khác nhau tại bảy vị trí cụ thể (R1-R7) xung quanh xương sống flavonoid thuộc về một lớp chất flavonoid được gọi là anthocyanins. Sắc tố anthocyanin chủ yếu là do tích điện tích trên vòng C của phân tử. Tuy nhiên, nó phụ thuộc vào pH. Ở pH=1 do tích điện dương trên vòng C, anthocyanin hấp thụ mạnh ánh sáng từ 460-550nm ( màu xanh lam, xanh lục) và có độ hấp thụ tối đa khoảng 520nm. Như vậy, ở pH=1, anthocyanin được nhuộm màu. Còn ở pH=4.5, do vòng C được ngậm nước, điện tích dương được trung hòa nên các anthocyanin không hấp thụ ánh sáng trong phạm vi khả kiến. Ở độ pH cao hơn này chúng truyền tất cả các bước sóng của ánh sáng nhìn thấy bằng mắt và do đó không màu. Và ở 520nm là bước sóng ánh sáng mà chúng ta cần phải đo lường khi xác định phổ lượng anthocyanin theo bất kỳ mẫu nào bằng quang phổ. Tuy nhiên, có một vấn đề khi xác định nồng độ anthocyanin trong các hỗn hợp phức tạp như rượu vang và các loại nước ép trái cây thì chúng ta cần xem xét thực tế rằng những hỗn hợp phức tạp này thường chức cả sắc tố phân hủy và phụ gia cũng có Amax ở 520nm. Vấn đề đặt ra là làm sao để chúng ta có thể xác định một cách chọn lọc nồng độ anthocyanin và loại bỏ các chất gây nhiễu khác ra khỏi phép đo. Và để giải quyết vấn đề này người ta thường sử dụng phương pháp pH vi sai để xác định hàm lượng anthocyanin.

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ANTHOCYANIN TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU QUẢ BẰNG PHƯƠNG PHÁP pH VI SAI

SVTH: NGUYỄN THỊ TUYẾT TRÂM

NGUYỄN THỊ CHÍ LINH

GVHD: TS.HOÀNG THỊ KIM DUNG

Click to edit Master text styles

Second level

Third level

Fourth level

Fifth level

Click to edit Master text styles

Second level

Third level

Fourth level Fifth level

ĐẠI HỌC LẠC HỒNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

NỘI DUNG

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2

1 ANTHOCYANIN

• Là hợp chất màu hữu cơ có nguồn gốc tự nhiên, thuộc họ flavonoid.

• Hòa tan tốt trong nước, khi kết hợp với đường làm cho phân tử Anthocyanin càng dễ hòa tan hơn.

TỔNG QUAN

Nguồn: Micro-ox (Bouillard et al J Am Chem Soc.99:8461-8468, 1977.)

1 ANTHOCYANIN

• Có 6 loại anthocyanin phổ biến như:

Pelargonidin, cyanidin, Peonidin, Delphinidin, Petunidin, Malvidin

• Là chất chống oxy hóa mạnh

12% 50% 12% 12% 7% 7%

• Khả năng chống oxy hóa của anthocyanins có liên quan đến các nhóm hydroxyl của vòng B của anthocyanin (Cooke và cộng sự, 2005)

1 ANTHOCYANIN

Nguồn: M Mónica Giusti and Ronald E Wrolstad, Current Protocols in Food Analytical Chemistry ,2001

Nguồn: Bouillard et al J Am Chem Soc.99:8461-8468, 1977.

1 ANTHOCYANIN

• Có bước sóng hấp thụ trong vùng khả kiến (400nm – 700nm)

• Độ hấp thu cực đại ở 520nm.

Xác định một cách có chọn lọc nồng độ anthocyanin ?

Phương pháp pH vi sai

2 Phương pháp pH vi sai

Dựa trên nguyên tắc: chất màu anthocyanin thay đổi theo pH

Tại pH = 1 các anthocyanin tồn tại ở dạng oxonium hoặc flavium có độ hấp thụ cực đại, còn ở pH = 4,5 thì chúng lại ở dạng carbinol không màu.

Đo mật độ quang của mẫu tại pH=1 và pH=4,5 tại bước sóng hấp thụ cực đại, so với độ hấp thụ tại bước sóng

700 nm.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1 Nguyên Liệu

Lá tía tô, bắp cải tím, quả dâu tằm, nho, cà tím, trà đỏ (đài hoa cây thảo dược hibicus): mua tại

Đà Nẵng

 Dung dịch ethanol 50%.

 HCl đậm đặc, nồng độ từ 36,5 % đến 38,0 % (khối lượng).

 Dung dịch KCI, 0,025 M pH= 1,0

 Dung dịch NaCH3COO.3H2O, 0,4 M pH= 4,5

 Máy đo pH

 Máy đo quang phổ khả kiến

 Cuvet thủy tinh

 Bình định mức 50 ml.

 Pipet chia vạch, có các dung tích thích hợp.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2 Hóa chất và thiết bị

3 Phương pháp nghiên cứu

11

PHƯƠNG PHÁP pH VI SAI

Dựa trên công thức của định luật Lambert-Beer

Trong đó: Đặc trưng cho mức độ ánh sáng yếu dần khi đi qua dung dịch hay

còn gọi là mật độ quang, ký hiệu là A

I: Cường độ ánh sáng sau khi đi qua dung dịch;

I0: Cường độ ánh sáng chiếu vào dung dịch;

C: Nồng độ chất nghiên cứu, mol/l;

l: Chiều dày của lớp dung dịch mà ánh sáng đi qua;

ε: Hệ số hấp thụ phân tử, mol-1 cm-1

12

add: hàm lượng anthocyanin trong dịch trích ly (mg/l)

A = (Aλmax – A700nm)pH 1.0 – (Aλmax – A700nm)pH 4.5

MW = 449.2 g/mol : KLPT cyanidin-3-glucosdie

DF: độ pha loãng

l: bề dày cuvet (cm)

ε = 26900: Hệ số hấp thu phân tử (l.mol-1.cm-1)

(1)

(2)

C

l I

Io

.

lg = ε

I

I0

DF MW

A l

mg

add

×

×

×

×

=

ε

3 10 )

/ (

Từ đó tính được anthocyanin theo phần trăm

13

% Anthocyanin toàn phần =

Trong đó:

a: Lượng anthocyanin tính được theo công thức (2), g;

m: Khối lượng nguyên liệu ban đầu, g;

w: Độ ẩm nguyên liệu, %

(3)

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

1 Xác định bước sóng hấp thu cực đại

Hình: Phổ hấp thụ của dịch chiết giàu

anthocyanin từ các nguyên liệu: file0: Bắp cải tím;

file1: quả dâu;

file2: lá tía tô;

file3: trà đỏ

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

1 Xác định bước sóng hấp thu cực đại

Mẫu Chỉ tiêu Quả dâu ta Trà đỏ Bắp cải tím Lá tía tô Vỏ nho Vỏ cà tím

λmax (nm) 513,5 519,5 523 524 523,5 523,5

Aλmax 1,465 1,170 1,134 0,973 1,231 0,698

Lấy 5 ml dịch chiết pha loãng với dung dịch đệm pH = 1,0 trong bình định mức 25 ml, quét phổ hấp thụ trong vùng khả kiến (l = 450 –

720 nm) trên máy quang phổ UV – ViS

Bảng1: Bước sóng hấp thụ cực đại và độ hấp thụ tại bước sóng cực đại của các mẫu nghiên cứu

Mẫu

(%)

λmax λ = 700 nm λmax λ = 700 nm

Bảng 3: Mật độ quang tại bước sóng hấp thụ cực đại và 700nm

trong các dung dịch đệm pH=1,0 và pH=4,5 và hàm lượng anthocyanin của các mẫu

Đo mật độ quang của các mẫu nghiên cứu tại bước sóng hấp thụ cực đại và 700nm, ở pH = 1,0 và pH = 4,5, từ đó áp dụng công thức (2) và (3), ta tính được hàm lượng anthocyanin trong các loại nguyên liệu.

Hăm lượng anthocyanin có trong câc mẫu nguyín liệu nghiín cứu, được biểu diễn dưới dạng biểu đồ.

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

Quả dâu ta Bắ p cải tím Lá tia tô Trà đỏ Vỏ nho Vỏ cà tím

KẾT LUẬN

 Kết quả cho thấy độ hấp thụ cực đại của dịch chiết từ quả dâu tại bước sóng λmax= 513,5nm; bắp cải tím 523nm; lá tía tô 524nm; trà đỏ (đài hoa hibicus) 519,5nm; vỏ quả nho 523,5nm; vỏ cà tím 523,5nm

 Hàm lượng anthocyanin trong quả dâu: 1,188% > bắp cải tím: 0,909% >

vỏ quả nho: 0,564% > vỏ cà tím: 0,441% > lá tía tô: 0,397% > trà đỏ: 0,335%

Từ kết quả này chúng ta sẽ lựa chọn được các nguyên liệu để nghiên cứu sâu hơn về chiết tách, làm sạch hợp chất màu anthocyanin, và ứng dụng chúng trong chế biến các sản phẩm thực phẩm

18