Xác định hàm lượng Anthocyanin bằng phương pháp pH vi sai

Anthocyanin là hợp chất hữu cơ có nguồn gốc tự nhiên, thuộc họ flavonoid. Tất cả các flavonoid thì đều có cùng 1 khung xương cơ bản (C6-C3-C6). Flavonoids được hydroxy hóa (-OH) hoặc methoxylated (-OCH3) với mức độ khác nhau tại bảy vị trí cụ thể (R1-R7) xung quanh xương sống flavonoid thuộc về một lớp chất flavonoid được gọi là anthocyanins. Sắc tố anthocyanin chủ yếu là do tích điện tích trên vòng C của phân tử. Tuy nhiên, nó phụ thuộc vào pH. Ở pH=1 do tích điện dương trên vòng C, anthocyanin hấp thụ mạnh ánh sáng từ 460-550nm ( màu xanh lam, xanh lục) và có độ hấp thụ tối đa khoảng 520nm. Như vậy, ở pH=1, anthocyanin được nhuộm màu. Còn ở pH=4.5, do vòng C được ngậm nước, điện tích dương được trung hòa nên các anthocyanin không hấp thụ ánh sáng trong phạm vi khả kiến. Ở độ pH cao hơn này chúng truyền tất cả các bước sóng của ánh sáng nhìn thấy bằng mắt và do đó không màu. Và ở 520nm là bước sóng ánh sáng mà chúng ta cần phải đo lường khi xác định phổ lượng anthocyanin theo bất kỳ mẫu nào bằng quang phổ. Tuy nhiên, có một vấn đề khi xác định nồng độ anthocyanin trong các hỗn hợp phức tạp như rượu vang và các loại nước ép trái cây thì chúng ta cần xem xét thực tế rằng những hỗn hợp phức tạp này thường chức cả sắc tố phân hủy và phụ gia cũng có Amax ở 520nm. Vấn đề đặt ra là làm sao để chúng ta có thể xác định một cách chọn lọc nồng độ anthocyanin và loại bỏ các chất gây nhiễu khác ra khỏi phép đo. Và để giải quyết vấn đề này người ta thường sử dụng phương pháp pH vi sai để xác định hàm lượng anthocyanin.

Click to edit Master text styles Second level Third level Fourth level Fifth level ĐẠI HỌC LẠC HỒNG KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC VÀ MƠI TRƯỜNG XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ANTHOCYANIN TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU QUẢ BẰNG PHƯƠNG PHÁP pH VI SAI SVTH: NGUYỄN THỊ TUYẾT TRÂM NGUYỄN THỊ CHÍ LINH GVHD: TS.HỒNG THỊ KIM DUNG Click to edit Master text Second level Third leve Fou NỘI DUNG TỔNG QUAN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP KẾT QUẢ KẾT LUẬN TỔNG QUAN ANTHOCYANIN • • Là hợp chất màu hữu có nguồn gốc tự nhiên, thuộc họ flavonoid Hòa tan tốt nước, kết hợp với đường làm cho phân tử Anthocyanin dễ hòa tan Nguồn: Micro-ox (Bouillard et al J Am Chem Soc.99:8461-8468, 1977.) ANTHOCYANIN • Có loại anthocyanin phổ biến như: Pelargonidin, cyanidin, Peonidin, Delphinidin, Petunidin, Malvidin • Là chất chống oxy hóa mạnh • Khả chống oxy hóa anthocyanins có liên quan đến nhóm hydroxyl vòng B anthocyanin (Cooke cộng sự, 2005) 12% 50% 12% 12% 7% 7% ANTHOCYANIN Nguồn: M Mónica Giusti and Ronald E Wrolstad, Current Protocols in Nguồn: Bouillard et al J Am Chem Soc.99:8461-8468, 1977 Food Analytical Chemistry ,2001 ANTHOCYANIN • • Có bước sóng hấp thụ vùng khả kiến (400nm – 700nm) Độ hấp thu cực đại 520nm Xác định cách có chọn lọc nồng độ anthocyanin ? Phương pháp pH vi sai Phương pháp pH vi sai Dựa nguyên tắc: chất màu anthocyanin thay đổi theo pH Tại pH = anthocyanin tồn dạng oxonium flavium có độ hấp thụ cực đại, pH = 4,5 chúng lại dạng carbinol không màu Đo mật độ quang mẫu pH=1 pH=4,5 bước sóng hấp thụ cực đại, so với độ hấp thụ bước sóng 700 nm VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên Liệu Lá tía tơ, bắp cải tím, dâu tằm, nho, cà tím, trà đỏ (đài hoa thảo dược hibicus): mua Đà Nẵng VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Hóa chất thiết bị      Hóa chất  Thiết bị Dung dịch ethanol 50% HCl đậm đặc, nồng độ từ 36,5 % đến 38,0 % (khối lượng) Dung dịch KCI, 0,025 M pH= 1,0 Dung dịch NaCH3COO.3H2O, 0,4 M pH= 4,5      Máy đo pH Máy đo quang phổ khả kiến Cuvet thủy tinh Bình định mức 50 ml Pipet chia vạch, có dung tích thích hợp 3 Phương pháp nghiên cứu 11 PHƯƠNG PHÁP pH VI SAI Dựa công thức định luật Lambert-Beer Io = ε l.C (1) Đặc trưng cho mức I độ ánh sáng yếu dần qua dung dịch hay lg Trong đó: gọi mật độ quang, I ký hiệu A lg I: Cường độ ánh sáng I sau qua dung dịch; I0: Cường độ ánh sáng chiếu vào dung dịch;  Hàm lượng anthocyanin dịch trích ly quy theo cyanidin-3-glucoside A × MW × DF ×103 add (mg / l ) = ε ×l (2) add: hàm lượng anthocyanin dịch trích ly (mg/l) A = (Aλmax – A700nm)pH 1.0 – (Aλmax – A700nm)pH 4.5 C: Nồng độ chất nghiên cứu, mol/l; l: Chiều dày lớp dung dịch mà ánh sáng qua; MW = 449.2 g/mol : KLPT cyanidin-3-glucosdie ε: Hệ số hấp thụ phân tử, mol -1 cm-1 DF: độ pha loãng l: bề dày cuvet (cm) -1 -1 ε = 26900: Hệ số hấp thu phân tử (l.mol cm ) 12 Từ tính anthocyanin theo phần trăm % Anthocyanin tồn phần = (3) Trong đó: a: Lượng anthocyanin tính theo công thức (2), g; m: Khối lượng nguyên liệu ban đầu, g; w: Độ ẩm nguyên liệu, % 13 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Xác định bước sóng hấp thu cực đại Hình: Phổ hấp thụ dịch chiết giàu anthocyanin từ nguyên liệu: file0: Bắp cải tím; file1: dâu; file2: tía tơ; file3: trà đỏ 14 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Xác định bước sóng hấp thu cực đại Lấy ml dịch chiết pha loãng với dung dịch đệm pH = 1,0 bình định mức 25 ml, quét phổ hấp thụ vùng khả kiến (l = 450 – 720 nm) máy quang phổ UV – ViS Bảng1: Bước sóng hấp thụ cực đại độ hấp thụ bước sóng cực đại mẫu nghiên cứu Mẫu Quả dâu ta Trà đỏ Bắp cải tím Lá tía tơ Vỏ nho Vỏ cà tím λmax (nm) 513,5 519,5 523 524 523,5 523,5 Aλmax 1,465 1,170 1,134 0,973 1,231 0,698 Chỉ tiêu Bảng 3: Mật độ quang bước sóng hấp thụ cực đại 700nm dung dịch đệm pH=1,0 pH=4,5 hàm lượng anthocyanin mẫu pH = 1,0 pH = 4,5 Hàm lượng anthocyanin λmax λ = 700 nm λmax λ = 700 nm (%) Quả dâu ta 1,465 0,012 0,224 0,028 1,188 Bắp cải tím 1,134 0,015 0,172 0,025 0,909 Lá tía tơ 0,973 0,047 0,143 0,046 0,397 Trà đỏ 1,170 0,050 0,353 0,057 0,335 Vỏ nho 1,231 0,025 0,217 0,027 0,564 Vỏ cà tím 0,698 0,002 0,085 0,013 0,441 Mẫu Đo mật độ quang mẫu nghiên cứu bước sóng hấp thụ cực đại 700nm, pH = 1,0 pH = 4,5, từ áp dụng cơng thức (2) (3), ta tính hàm lượng anthocyanin loại nguyên liệu 16 Hàm lượng anthocyanin có mẫu nguyên liệu nghiên cứu, biểu diễn dạng biểu đồ 1,200 Hàm lượng anthocyanin (%) 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 Quaídáu ta Bàõ p caíi têm Lạtia tä Trâ Vnho 17 Vctêm KẾT LUẬN  Kết cho thấy độ hấp thụ cực đại dịch chiết từ dâu bước sóng λmax= 513,5nm; bắp cải tím 523nm; tía tơ 524nm; trà đỏ (đài hoa hibicus) 519,5nm; vỏ nho 523,5nm; vỏ cà tím 523,5nm  Hàm lượng anthocyanin dâu: 1,188% > bắp cải tím: 0,909% > vỏ nho: 0,564% > vỏ cà tím: 0,441% > tía tơ: 0,397% > trà đỏ: 0,335%  Từ kết lựa chọn nguyên liệu để nghiên cứu sâu chiết tách, làm hợp chất màu anthocyanin, ứng dụng chúng chế biến sản phẩm thực phẩm 18 ... anthocyanin ? Ph ơng ph p pH vi sai Ph ơng ph p pH vi sai Dựa nguyên tắc: chất màu anthocyanin thay đổi theo pH Tại pH = anthocyanin tồn dạng oxonium flavium có độ hấp thụ cực đại, pH = 4,5 chúng... NaCH3COO.3H2O, 0,4 M pH= 4,5      Máy đo pH Máy đo quang ph khả kiến Cuvet thủy tinh Bình định mức 50 ml Pipet chia vạch, có dung tích thích hợp 3 Ph ơng ph p nghiên cứu 11 PH ƠNG PH P pH VI SAI Dựa... hấp thu cực đại Lấy ml dịch chiết pha loãng với dung dịch đệm pH = 1,0 bình định mức 25 ml, quét ph hấp thụ vùng khả kiến (l = 450 – 720 nm) máy quang ph UV – ViS Bảng1: Bước sóng hấp thụ cực