Polyphosphat trong mẫu thủy sản được chiết tách bằng nước cất khử ion. Dịch chiết được làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên cột chiết pha rắn C18. Hàm lượng polyphosphat có trong dịch chiết được xác định trên thiết bị sắc ký ion sử dụng hệ thống phản ứng sau cột với các chất phản ứng là sắt (III) nitrat trong axit percloric và detector UV tại bước sóng 330 nm theo phương pháp ngoại chuẩn.
TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 8353 : 2010 THUỶ SẢN VÀ SẢN PHẨM THUỶ SẢN ( XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MUỐI POLYPHOSPHAT ( PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ION Fish and fishery products − Determination of polyphosphate content − Method using ion chromatography Lời nói đầu TCVN 8353 : 2010 Cục Chế biến, Thương mại nông lâm thuỷ sản nghề muối biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp xác định hàm lượng muối polyphosphat bao gồm ortophosphat (monophosphat), pyrophosphat (diphosphat), tripolyphosphat thủy sản sản phẩm thủy sản sắc ký ion Nguyên tắc Polyphosphat mẫu thủy sản chiết tách nước cất khử ion Dịch chiết làm phương pháp chiết pha rắn (SPE) cột chiết pha rắn C18 Hàm lượng polyphosphat có dịch chiết xác định thiết bị sắc ký ion sử dụng hệ thống phản ứng sau cột với chất phản ứng sắt (III) nitrat axit percloric detector UV bước sóng 330 nm theo phương pháp ngoại chuẩn Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích sử dụng nước cất loại ion nước có độ tinh khiết tương đương, trừ có quy định khác 3.1 Metanol 3.2 Sắt (III) nitrat (Fe(NO3)3.9H2O) 3.3 Dung dịch axit percloric, % Hoà tan 28,5 ml axit percloric đậm đặc (70 %, d = 1,75 g/ml) nước bình định mức 000 ml định mức đến vạch 3.4 Natri phosphat ngậm phân tử nước (NaH2PO4.H2O) chuẩn, sản phẩm hãng EM Science loại tương đương 3.5 Natri pyrophosphat ngậm mười phân tử nước (Na 4P2O7.10H2O) chuẩn, sản phẩm hãng Aldrich loại tương đương 3.6 Natri tripolyphosphat (Na5P3O10) chuẩn, sản phẩm hãng Monsanto loại tương đương 3.7 Dung dịch chuẩn gốc, 000 µg/ml Tuỳ theo hàm lượng chuẩn giấy chứng nhận chất chuẩn (3.4, 3.5 3.6) để chuẩn bị dung dịch chuẩn có hàm lượng 000 µg/ml nước Bảo quản dung dịch chuẩn gốc chai PE nhiệt độ phòng tháng 3.8 Dung dịch chuẩn làm việc 3.8.1 Dung dịch chuẩn làm việc ortophosphat Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc ortophosphat có nồng độ từ 10 µg/ml đến 100 µg/ml từ dung dịch chuẩn gốc ortophosphat 000 µg/ml (3.7) cách pha loãng với nước Chỉ sử dụng dung dịch chuẩn làm việc ortophosphat chuẩn bị ngày 3.8.2 Dung dịch chuẩn làm việc pyrophosphat Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc pyrophosphat có nồng độ từ 0,5 µg/ml đến 50 µg/ml từ dung dịch chuẩn gốc pyrophosphat 000 µg/ml (3.7) cách pha loãng với nước Chỉ sử dụng dung dịch chuẩn làm việc pyrophosphat chuẩn bị ngày 3.8.3 Dung dịch chuẩn làm việc tripolyphosphat Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc tripolyphosphat có nồng độ từ 10 µg/ml đến 500 µg/ml từ dung dịch chuẩn gốc tripolyphosphat 000 µg/ml (3.7) cách pha loãng với nước Chỉ sử dụng dung dịch chuẩn làm việc tripolyphosphat chuẩn bị ngày 3.9 Dung dịch pha động (dung dịch axit nitric 70 mM) Hòa tan 4,82 ml axit nitric đậm đặc (65 %, d = 1,41 g/ml) bình định mức 000 ml (4.8), pha loãng nước đến vạch Đuổi khí hòa tan cách đặt vào bể siêu âm (4.10) khoảng 10 đến 15 trước chạy thiết bị sắc ký ion Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường cụ thể sau: 4.1 Cân phân tích, cân xác đến 0,1 mg 4.2 Chai nhựa chứa mẫu, dung tích 100 ml 4.3 Máy lắc mẫu 4.4 Máy ly tâm, có khả làm việc tốc độ 000 r/min 4.5 Màng lọc mẫu, 0,45 µm, loại nylon chịu dung môi 4.6 Xilanh, làm thủy tinh nhựa, dung tích 100 ml 4.7 Cột chiết pha rắn C18, loại chứa 300 mg C18 4.8 Bình định mức, dung tích 100 ml 000 ml 4.9 Cột sắc ký tách anion Dionex IonPac AS7, đường kính mm, dài 250 mm, tiền cột IonPac NG1, đường kính mm, dài 50 mm, loại tương đương 4.10 Bể siêu âm 4.11 Hệ thống thiết bị sắc ký ion, có detector UV 4.12 Hệ thống phản ứng sau cột, gắn sau cột sắc ký; ống phản ứng teflon dung tích 0,5 ml Sơ đồ lắp đặt hệ thống phản ứng sau cột, xem Hình Hình − Sơ đồ lắp đặt hệ thống phản ứng sau cột Cách tiến hành 5.1 Chuẩn bị mẫu thử Cân 0,5 g mẫu thuỷ sản sản phẩm thuỷ sản đồng nhất, xác đến 0,1 mg, vào chai nhựa dung tích 100 ml (4.2) Thêm 50 ml nước vào chai lắc mạnh 30 máy lắc mẫu (4.3) Sau đó, ly tâm chai 10 tốc độ 000 r/min máy ly tâm (4.4) Lọc dịch chiết qua màng lọc 0,45 µm (4.5) 5.2 Chuẩn bị mẫu trắng Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống chuẩn bị mẫu thử thay 0,5 g thủy sản 0,5 ml nước cất khử ion 5.3 Làm dịch chiết 5.3.1 Chuẩn bị cột Nối cột chiết pha rắn C18 (4.7) vào đầu xilanh thủy tinh 100 ml (4.6) Thêm 10 ml metanol (3.1), 10 ml nước vào xilanh thuỷ tinh Loại bỏ dung dịch chảy qua cột 5.3.2 Làm dịch chiết Cho dịch chiết thu (5.1) (5.2) vào cột C18 chuẩn bị (5.3.1) Sau cho dịch chiết vào cột, bỏ ml dịch đầu khỏi cột thu dịch vào bình định mức 100 ml (4.8) Sau đó, tráng rửa bình chứa lần, lần ml nước Cho nước tráng qua cột gom dịch qua cột vào bình định mức Định mức nước đến vạch 5.4 Tiến hành phân tích thiết bị sắc ký ion 5.4.1 Điều kiện phân tích 5.4.1.1 Chế độ làm việc thiết bị sắc ký ion – cột sắc ký ion (4.9); – nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng; – pha động: dung dịch axit nitric 70 mM (3.9); – tốc độ dòng: 0,5 ml/min; – bước sóng cài đặt cho detector UV: 330 nm; – thể tích tiêm: 100 µl 5.4.1.2 Điều kiện hệ thống phản ứng sau cột – tác nhân (dung dịch phản ứng sau cột): g/l sắt (III) nitrat (3.2) axit percloric % (3.3) với tốc độ dòng 0,5 ml/min; – nhiệt độ phản ứng ống teflon: nhiệt độ phòng 5.4.2 Ổn định cột sắc ký Ổn định cột sắc ký 30 dung dịch pha động (3.9) 5.4.3 Dựng đường chuẩn Tiêm dung dịch chuẩn (3.8) vào thiết bị sắc ký Mỗi dung dịch tiêm lần, tính diện tích pic trung bình Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ chiều cao pic thu nồng độ loại phosphat theo quan hệ tuyến tính Đường chuẩn loại phosphat phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan hồi quy tuyến tính (R2) phải lớn 0,99 Khoảng tuyến tính: – ortophosphat: từ 10 µg/ml đến 100 µg/ml; – pyrophosphat: từ 0,5 µg/ml đến 50 µg/ml; – tripolyphosphat: từ 10 µg/ml đến 500 µg/ml 5.4.4 Xác định muối polyphosphat Tiêm dung dịch mẫu thử dung dịch mẫu trắng làm (xem 5.3.2) vào hệ thống sắc ký, mẫu lần Tính kết Hàm lượng muối phosphat có mẫu, C, tính microgam gam ((µg/g) theo công thức sau: Y hiệu số diện tích pic dịch chiết diện tích pic có mẫu trắng tiêm vào máy, tính theo đơn vị diện tích; a, b hệ số đường chuẩn xác định 5.4.3, x tính theo microgam milinit; V thể tích dịch chiết thu sau làm (xem 5.3.2), tính milimit (ml) m khối lượng mẫu sử dụng (xem 5.1), tính gam (g) Độ lặp lại Độ lệch chuẩn lặp lại (CVS) tính theo diện tích pic sắc ký lần tiêm dung dịch chuẩn pyrophosphat 10 µg/ml 25 µg/ml phải nhỏ 1,2 % Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) thông tin cần thiết việc nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; c) phương pháp thử sử dụng viện dẫn tiêu chuẩn này; d) thao tác không quy định tiêu chuẩn này, điều coi tự chọn, chi tiết có ảnh hưởng tới kết quả; e) kết thử nghiệm thu THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Determination of tripolyphosphate and related hydrolysis products in processed shrimp, National Forensic Chemistry Center, U.S Food and Drug Administration, Cincinnati, Ohio ... dịch qua cột vào bình định mức Định mức nước đến vạch 5.4 Tiến hành phân tích thiết bị sắc ký ion 5.4.1 Điều kiện phân tích 5.4.1.1 Chế độ làm việc thiết bị sắc ký ion – cột sắc ký ion (4 .9); – nhiệt... tiến hành 5.1 Chuẩn bị mẫu thử Cân 0,5 g mẫu thuỷ sản sản phẩm thuỷ sản đồng nhất, xác đến 0,1 mg, vào chai nhựa dung tích 100 ml (4 .2) Thêm 50 ml nước vào chai lắc mạnh 30 máy lắc mẫu (4 .3) Sau... – tripolyphosphat: từ 10 µg/ml đến 500 µg/ml 5.4.4 Xác định muối polyphosphat Tiêm dung dịch mẫu thử dung dịch mẫu trắng làm (xem 5.3.2) vào hệ thống sắc ký, mẫu lần Tính kết Hàm lượng muối phosphat