Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng metyltestosteron (17β)17hydroxy17methylandrost4ene3one và dietylstilbestrol 4,4(3E)hex3ene3,4diyldiphenol trong sản phẩm thủy sản bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ khối phổ (LCMSMS). Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,5 µgkg. Giới hạn định lượng là 1,5 µgkg. 2. Nguyên tắc Mẫu được thủy phân với subtilin để giải phóng metyltestosteron và dietylstilbestrol. Metyltestosteron và dietylstilbestrol tự do được chiết tách khỏi mẫu bằng tertbutyl metyl ete. Dịch chiết được loại chất béo bằng quá trình chiết lỏnglỏng với nhexan và sau đó làm sạch bằng cách chiết pha rắn. Hàm lượng metyltestosteron và dietylstilbestrol trong dịch giải hấp được xác định bằng LCMSMS.
TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8374 : 2010 THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG FLORFENICOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) Fish and fishey products – Determination of florfenicol content by high performance liquid chromatographic method (HPLC) Lời nói đầu TCVN 8374 : 2010 Cục Quản lý Chất lượng Nông Lâm sản Thuỷ sản biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố TCVN 8374 : 2010 THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG FLORFENICOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) Fish and fishey products – Determination of florfenicol content by high performance liquid chromatographic method (HPLC) Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp xác định hàm lượng florfenicol (FF) thuỷ sản sản phẩm thủy sản sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Giới hạn phát phương pháp 0,020 mg/kg Nguyên tắc FF chiết tách từ mẫu thủy sản etyl axetat Dịch chiết thổi khô làm chiết lỏng - lỏng với n-hexan dung dịch đệm Hàm lượng FF có dịch đo máy HPLC với đầu dò UV-VIS DAD bước sóng 220 nm Mẫu có hàm lượng vượt ngưỡng dư lượng tối đa cho phép (MRL= mg/kg) khẳng định lại đầu dò DAD đảm bảo phổ hấp thụ phải đạt cực đại bước sóng 225 nm Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích sử dụng nước cất loại dùng cho HPLC, trừ có quy định khác 3.1 FF chuẩn, biết độ tinh khiết 3.2 n-Hexan 3.3 Etyl axetat 3.4 Amoni axetat 3.5 Pha động A: dung dịch đệm amoni axetat, pH 4,8 ± 0,05 Cân 1,54 g amoni axetat (3.4) vào cốc thủy tinh 000 ml, hòa tan với khoảng 950 ml nước cất, trộn điều chỉnh đến pH 4,8 ± 0,05 axit axetic, lọc màng lọc nylon, đường kính 45 mm, kích thước lỗ lọc 0,2 µm, siêu âm 15 Pha dung dịch hàng ngày trước sử dụng 3.6 Pha động B: axetonitril Cho l axetonitril (loại dùng cho HPLC) vào bình đựng dung môi máy HPLC, siêu âm 15 Dung dịch sử dụng trực tiếp, tránh tác động làm đảo trộn dung môi chiết rót, đổi bình 3.7 Hỗn hợp pha động Hút 25 ml axetonitril 75 ml dung dịch đệm amoni axetat, pH 4,8 ± 0,05 (3.5) cho vào bình định mức 100 ml, lắc 3.8 Dung dịch chuẩn gốc, nồng độ mg/ml Cân xác 50 mg ± 0,1 mg FF chuẩn (3.1) cho vào bình định mức 50 ml, hòa tan axetonitril, lắc đến tan hoàn toàn định mức đến vạch Dung dịch bền năm bảo quản nhiệt độ không lớn oC 3.9 Dung dịch chuẩn trung gian, nồng độ 100 µg/ml Hút ml dung dịch chuẩn gốc mg/ml (3.8) cho vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch axetonitril Dung dịch bền tháng bảo quản nhiệt độ từ oC đến oC 3.10 Dung dịch chuẩn trung gian, nồng độ 10 µg/ml Hút ml dung dịch chuẩn trung gian (3.9) cho vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch axetonitril Dung dịch bền tháng bảo quản nhiệt độ từ oC đến oC 3.11 Dung dịch chuẩn làm việc, nồng độ 0; 0,1; 0,5; 1; 2,5 µg/ml Hút µl, 10 µl, 50 µl, 100 µl, 250 µl, 500 µl dung dịch chuẩn trung gian 100 µg/ml (3.9) vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch hỗn hợp pha động (3.7) Pha dung dịch chuẩn làm việc trước dùng Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường cụ thể sau: 4.1 Ống ly tâm nắp xoáy, dung tích 15 ml 4.2 Màng lọc mẫu, nylon, PTFE đường kính 13 mm, kính thước lỗ lọc 0,2 µm 4.3 Bơm tiêm, dung tích ml 4.4 Pipet pasteur 4.5 Lọ đựng mẫu, dung tích 1,5 ml 4.6 Máy lắc vortex 4.7 Hệ thống thổi khí nitơ có điều nhiệt 4.8 Máy ly tâm, tốc độ 000 r/min 4.9 Hệ thống HPLC với đầu dò UV-VIS/DAD, sử dụng bước sóng 220 nm, cột tách pha đảo C8, µm, 150 mm x 4,6 mm Cách tiến hành 5.1 Chuẩn bị mẫu 5.1.1 Xử lý mẫu Tách thịt thuỷ sản từ vị trí khác mẫu Cắt phần mẫu vừa lấy thành miếng nhỏ từ cm đến 30 cm Cho phần mẫu vừa cắt (khoảng 100 g) vào máy xay mẫu, xay đến mẫu đồng Giữ mẫu oC đến 18 oC thấp phân tích 5.1.2 Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng mẫu thủy sản, sản phẩm thủy sản xác định không chứa FF Cân 3,0 g ± 0,1 g mẫu xay nhuyễn vào ống ly tâm dung tích 15 ml (4.1) 5.1.3 Chuẩn bị mẫu kiểm soát, nồng độ FF mg/kg Cân 3,0 g ± 0,1 g mẫu trắng xay nhuyễn vào ống ly tâm dung tích 15 ml (4.1) Thêm 0,3 ml dung dịch chuẩn 10 µg/ml (3.10) Để yên 20 trước phân tích 5.1.4 Chuẩn bị mẫu thử Cân 3,0 g ± 0,1 g mẫu xay nhuyễn vào ống ly tâm dung tích 15 ml (4.1) 5.2 Xác định Cho ml nước cất vào ống ly tâm chứa mẫu trắng (5.1.2), mẫu kiểm soát (5.1.3) mẫu thử (5.1.4), đậy nắp, lắc Thêm tiếp ml etyl axetat (3.3), lắc khoảng máy lắc (4.6) sau ly tâm tốc độ 000 r/min Hút ml lớp cho vào ống ly tâm dung tích 15 ml (4.1) làm khô dung dịch hệ thống thổi khí nitơ nhiệt độ 50 oC Hoà tan phần cặn ml n-hexan, sau cho tiếp ml hỗn hợp pha động (3.7) vào, lắc khoảng máy lắc (4.6), ly tâm tốc độ 000 r/min Hút bỏ lớp n-hexan trên, lấy lớp lọc qua màng lọc mẫu (4.2) cho vào lọ dung tích 1,5 ml (4.5) đem phân tích thiết bị HPLC 5.3 Điều kiện phân tích HPLC thứ tự tiêm: tiêm dãy chuẩn, mẫu trắng, mẫu kiểm soát, mẫu thử thể tích tiêm: 100 µl tốc độ dòng: 1,0 ml/min thời gian chạy: 10 tỷ lệ pha động: axetonitril : đệm amoni axetat = 25 : 75 (thể tích) CHÚ THÍCH Cân cột sắc ký với pha động 30 trước tiêm mẫu chuẩn CHÚ THÍCH Sau hoàn thành việc chạy mẫu, rửa cột hệ thống HPLC với pha động nước cất pha động axetonitril với lưu lượng ml/min theo tỉ lệ 35 : 65 60 Tính kết Hàm lượng FF mẫu thử, C, tính miligam kilogam sản phẩm (mg/kg) theo công thức: C = Cx x (V3 x V1) / (m x V2) C = Cx x f đó: Cx hàm lượng FF tính từ đường chuẩn, tính microgam mililit (µg/ml); V1 thể tích etyl axetat ban đầu cho vào để chiết tách mẫu, tính mililit (ml); V2 dung dịch chiết tách mẫu lấy đem làm khô, tính mililit (ml); V3 thể tích pha động cho vào để hoà tan cặn, tính mililit (ml); m khối lượng mẫu, tính gam (g); f hệ số pha loãng mẫu, xác định theo công thức F = (V3 x V1) / (m x V2) Trong trường hợp f = 0,5 (ml/g) Độ chụm 7.1 Độ tuyến tính: R2 > 0,99 khoảng 0,1 mg/kg đến mg/kg 7.2 Độ lặp lại: sr = 0,049 mg/kg; CV % = 4,9 % 7.3 Độ thu hồi - mẫu tôm thêm chuẩn FF mg/kg: Rm = 75 % - mẫu cá thêm chuẩn FF mg/kg: Rm = 71 % CHÚ THÍCH Có thể dựng đường chuẩn mẫu trắng để tăng độ thu hồi Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: - thông tin cần thiết việc nhận biết đầy đủ mẫu thử; - phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; - phương pháp thử sử dụng viện dẫn tiêu chuẩn này; - thao tác không quy định tiêu chuẩn này, điều coi tự chọn, chi tiết có ảnh hưởng đến kết quả; - kết thử nghiệm thu PHỤ LỤC A (tham khảo) MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ TIÊU BIỂU A.1 Sắc ký đồ mẫu trắng đáp ứng Thời gian Hình A.1 – Sắc ký đồ mẫu trắng (mẫu tôm), thời gian lưu 6,9 A.2 Sắc ký đồ mẫu cá thêm chuẩn FF mg/kg đáp ứng Thời gian Hình A.2 – Sắc ký đồ mẫu cá thêm chuẩn mg/kg, thời gian lưu 6,875 A.3 Sắc ký đồ mẫu tôm thêm chuẩn FF mg/kg đáp ứng Thời gian Hình A.3 – Sắc ký đồ mẫu tôm thêm chuẩn mg/kg, thời gian lưu 6,920 THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] United States Department of Agriculture Food Safety and Inspection Service, Office of Public Health Science - Determination of Florfenicol by HPLC - CLG-FLOR1.02 – 24/07/2006 [2] United States Department of Agriculture Food Safety and Inspection Service, Office of Public Health Science - Confirmation of Florfenicol by GC/MS CLG-FLOR2.02 – 08/07/2006 ... A.1 – Sắc ký đồ mẫu trắng (mẫu tôm), thời gian lưu 6,9 A.2 Sắc ký đồ mẫu cá thêm chuẩn FF mg/kg đáp ứng Thời gian Hình A.2 – Sắc ký đồ mẫu cá thêm chuẩn mg/kg, thời gian lưu 6,875 A.3 Sắc ký đồ... phân tích 5.1.2 Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng mẫu thủy sản, sản phẩm thủy sản xác định không chứa FF Cân 3,0 g ± 0,1 g mẫu xay nhuyễn vào ống ly tâm dung tích 15 ml (4.1) 5.1.3 Chuẩn bị mẫu kiểm... dẫn tiêu chuẩn này; - thao tác không quy định tiêu chuẩn này, điều coi tự chọn, chi tiết có ảnh hưởng đến kết quả; - kết thử nghiệm thu PHỤ LỤC A (tham khảo) MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ TIÊU BIỂU A.1 Sắc ký