Thu nhận và tinh sạch enzyme urease từ mầm đậu nành

ðẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA - HỒ THỊ NGỌC NHUNG THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME UREASE TỪ MẦM ðẬU NÀNH Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm đồ uống TP.HỒ CHÍ MINH, tháng 08 năm 2010 CƠNG TRÌNH ðƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA ðẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học : TS TRẦN BÍCH LAM Cán chấm nhận xét : PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG Cán chấm nhận xét : TS PHAN NGỌC HỊA Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường ðại học Bách Khoa, ðHQG Tp HCM ngày 16 tháng năm 2010 ðẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA ðộc lập - Tự - Hạnh phúc Tp HCM, ngày 16 tháng năm 2010 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Hồ Thị Ngọc Nhung Phái : nữ Ngày, tháng, năm sinh: 27/2/1985 Nơi sinh : Thừa Thiên Huế Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm ðồ uống I- TÊN ðỀ TÀI: MSHV : 01108474 Thu nhận tinh enzyme urease từ mầm ñậu nành II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: − Khảo sát hoạt tính urease q trình nẩy mầm − Xác ñịnh ñiều kiện nẩy mầm tối ưu cho việc thu nhận urease − Nghiên cứu tách chiết thu nhận chế phẩm urease từ hạt mầm ñậu nành − So sánh tính chất urease trích ly từ mầm ñậu nành hạt ñậu nành nguyên liệu, ñậu rựa III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 01/02/2010 IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 30/7/2010 V- CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS Trần Bích Lam CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS Trần Bích Lam CN BỘ MƠN QL CHUN NGÀNH PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn LỜI CẢM ƠN Trong trình thực luận văn tơi gặp nhiều khó khăn nhờ có động viên giúp đỡ thầy cơ, bạn bè gia đình giúp tơi hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Trần Bích Lam người tận tâm giúp đỡ tơi suốt thời gian thực luận văn Cơ cho tơi lời khun thật hữu ích giúp tơi tiến hành thí nghiệm thuận lợi q trình hồn thành luận văn Tơi chân thành cảm ơn thầy phịng thí nghiệm giúp đỡ tơi trang thiết bị thí nghiệm ý kiến chun mơn liên quan đến thiết bị q trình thực luận văn Tơi chân thành cảm ơn bạn ñã hỗ trợ giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Cuối cùng, tơi muốn gửi lời cảm ơn châ thành đến gia đình tơi động viên ủng hộ tơi suốt trình thực luận văn Chân thành cảm ơn bố mẹ, thầy bạn bè giúp đỡ tơi suốt thời gian qua! Tp HCM, ngày 16 tháng 08 năm 2010 Hồ Thị Ngọc Nhung TÓM TẮT Đậu nành cho nảy mầm nhiệt độ 20oC, 24oC, 28oC, 32oC độ ẩm 75%, 80%, 85%, 90%, 95% sau khảo sát theo thời gian Nhiệt độ độ ẩm nảy mầm tốt thu để enzyme urease có hoạt tính cao 28oC, 80% ngày thứ nảy mầm Sau tiến hành khảo sát dịch đệm trích ly gồm hệ đệm phosphate, acetate tris-HCl; loại đệm bố trí theo hai hướng: thứ khơng bổ sung EDTA thứ hai có bổ sung EDTA; pH nghiên cứu từ pH 4.0 đến pH 9.0 Trong đệm phosphate có bổ sung EDTA pH = 7.0 có khả trích ly enzyme urease tốt Tiếp theo tiến hành tinh enzyme urease qua bước: tủa aceton 60%, sắc ký lọc gel qua cột sephadex G 200, cuối sephadex G 100 Mẫu urease thu có độ tinh 10.47, hoạt tính riêng 133.67 UI/mg, có nhiệt độ xúc tác tối ưu 50oC Urease từ mầm đậu nành có số Michaelis Km = 0.92 mM tốc độ phản ứng Vmax = 0.006 µmol/phút.mg MỤC LỤC Nội dung Số trang MỤC LỤC i DANH MỤC HÌNH iv DANH MỤC BẢNG iv MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG I TỔNG QUAN .3 1.1 Enzyme urease .3 1.1.1 Đặc tính 1.1.2 Chức urease trao đổi chất thực vật 1.1.3 Nguồn thu nhận 1.1.4 Ứng dụng 10 1.1.5 Các nghiên cứu thu nhận enzyme urease .10 1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình nẩy mầm 14 1.2.1 Mối quan hệ hấp thụ nước nẩy mầm 15 1.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến nẩy mầm 16 1.2.3 Những biến đổi enzyme hạt nẩy mầm 19 1.3 Những nghiên cứu enzym từ đậu nành 22 CHƯƠNG II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Vật liệu thí nghiệm 25 2.2 Nội dung thí nghiệm 25 2.2.1 Sơ đồ tiến trình nghiên cứu 25 2.2.2 Phương pháp thực 26 2.3 Phương pháp phân tích 32 2.3.1 Phương pháp định lượng protein hòa tan 32 i 2.3.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme urease 32 2.3.3 Phương pháp khảo sát tính chất động học enzyme urease 32 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .34 3.1 Nguyên liệu 34 3.2 Xác định thời gian nẩy mầm thu enzym urease 34 3.2.1 Sự biến đổi hàm lượng protein hòa tan 35 3.2.2 Sự biến đổi hoạt tính urease 40 3.3 Thu nhận enzyme urease 46 3.3.1 Sự biến đổi hàm lượng protein theo pH dịch đệm trích ly .46 3.3.2 Sự biến đổi hoạt tính enzyme theo pH dịch đệm trích ly 49 3.4 Tinh enzyme urease từ mầm đậu nành 53 3.4.1 Các bước tinh .54 3.4.1.1 Xác định nồng độ aceton để thu hồi enzyme .54 3.4.1.2 Tinh sắc ký lọc gel 56 3.4.2 So sánh khả tinh qua bước 58 3.5 So sánh tính chất enzyme urease từ mầm đậu nành, hạt đậu nành enzyme urease thương mại 60 3.5.1 So sánh tính chất enzyme urease từ mầm đậu nành hạt đậu nành 60 3.5.1.1 Thông số động học .60 3.5.1.2 Ảnh hưởng nhiệt độ .63 3.5.2 So sánh tính chất enzyme urease từ mầm đậu nành urease thương phẩm (Urease M) 65 3.5.2.1 Thông số động học .65 3.5.2.2 So sánh hoạt tính thay đổi theo nhiệt độ 68 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70 4.1 Kết luận 70 ii 4.2 Kiến nghị 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 PHỤ LỤC 82 iii DANH MỤC HÌNH Nội dung Số trang Hình 1.1 Phản ứng phân hủy urea Hình 1.2 Sự chuyển hóa urease thực vật Hình 1.3 Ba pha hấp thu nước 16 Hình 1.4 Ảnh hưởng nhiệt độ nẩy mầm đến hoạt tính phytase trình nẩy mầm đại mạch .17 Hình 1.5 Ảnh hưởng nhiệt độ nẩy mầm đến hoạt tính enzyme hai giống đậu nành .18 Hình 1.6 Ảnh hưởng nhiệt độ nẩy mầm đến hoạt tính enzyme 19 Hình 3.1 Diễn biến hàm lượng protein mầm đậu nành phụ thuộc độ ẩm nhiệt độ nẩy mầm 37 Hình 3.2 Diễn biến hoạt tính enzyme urease mầm đậu nành phụ thuộc độ ẩm nhiệt độ nẩy mầm 42 Hình 3.3 Hàm lượng protein hoạt tính enzyme urease hạt đậu ban đầu mầm đậu nành 47 Hình 3.4: Ảnh hưởng pH dịch đệm đến hàm lượng protein trích ly 48 Hình 3.5 Ảnh hưởng pH loại đệm đến hoạt tính urease dịch trích .50 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn OD bước sóng 490nm 595nm phân tích hoạt tính urease, hàm lượng protein qua cột sephasex G200 .57 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn OD bước sóng 490nm 595nm phân tích hoạt tính hàm lượng protein qua cột sephasex G100 .57 Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn biến đổi vận tốc thuỷ phân enzym urease iv mầm đậu nành thay đổi nồng độ chất ure 61 Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc 1/V 1/[S] urease mầm đậu nành 62 Hình 3.10 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme urease mầm đậu nành 64 Hình 3.11 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme urease hạt đậu nành theo nghiên cứu Dezhong Liu cộng (1995) .64 Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn biến đổi vận tốc thuỷ phân enzym urease đậu rựa thay đổi nồng độ chất urea 66 Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc 1/V 1/[S] urease đậu rựa 67 Hình 3.14 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme urease đậu rựa 69 v 36 H Nakano, S Takenishi, Y.Watanabe, 1984 Purification properties of urease from Brevibactenium ammoniagenes Agric Biol Chem 48: 1495– 1502 37 H.G Sung, H.T Shin, J.K Ha, H.-L Lai, K.-J Cheng, J.H Lee, 2005 Effect of germination temperature on characteristics of phytase production from barley Bioresource Technology 96, 1297–1303 38 Hatfield .1 L & Egli D B, 1974 Effect of temperature on the rate of hypoeotyl elongation field emergenee - Crop Sci 14: 423-426 39 Hongzu Ren, James T Madison, John F Thompson, 1993 Identification of an ethanol-soluble protein as β-amylase its purification from soybean seeds Phytochemistry, Volume 33: 535-539 40 Isobel J Rosenstein, Jeremy M Hamiltonmiller, William Brumfitt, 1981 Role of Urease in the Formation of Infection Stones:Comparison of Ureases from Different Sources Infection Immunity: 32-37 41 J Schneider, H Kaltwasser, Arch, 1984 Microbiol 139: 355–360 42 Janaina Nicanuzia dos Prazeres, CarmenVeríssima Ferreira, HiroshiAoyama, 2004 Acid phosphatase activities during the germination of Glycine max seeds Plant Physiology Biochemistry 42: 15–20 43 Jean Tia Gonnety, Sébastien Niamké, Betty Meuwiah Faulet, Eugène JeanParfait, N’guessan Kouadio Lucien Patrice Kouamé, 2006 Purification characterization of three low-molecular-weight acid phosphatases from peanut (Arachis hypogaea) seedlings African Journal of Biotechnology Vol 5: 035-044 44 Jenshinn Lin, Yeong-Shenn Lin, Sho-Tin Kuo, Chii-Ming Jiang, MingChang Wu, 2009 Purification of soybean amylase by superparamagnetic particles Food Chemistry, Volume 117: 94-98 Page 76 45 Kakimoto, S., Sumino, Y., Akiyama, S., Nakao, Y., 1989 Purification characterization of acid urease from Lac-tobacillus reuteri Agric Biol Chem 53: 1119–1125 46 Kakimoto, S., Sumino, Y., Kawahara, K., Yamazaki, E., Nakatui, I., 1990 Purification characterization of acid urease from Lactobacillus fermentum Appl Microbiol Biotechnol 32: 538–543 47 Karoly Tihanyi, Brian Talbot, Ryszard Brzezinski, Jean-Paul Thirion, 1989 Purification characterization of alcohol dehydrogenase from soybean Phytochemistry, Volume 28:1335-1338 48 Karssen, C M., Zagórsky, S., Kepczynski, J., Groot, S P C, 1989 Key role for endogenous gibberellins in the control of seed germination Annals of Botany 63: 71-80 49 Katsuro Miyagawa, Motoo Sumida, Masahiro Nakao, Masami Harada, Hiroshi Yamamoto, Takaaki Kusumi, Kiyoshi Yoshizawa, Teruo Amachi, Toru Nakayama, 1999 Purification, characterization, application of an acid urease from Arthrobacter mobilis Journal of Biotechnology, Volume 68: 227-236 50 Kayastha, A.M., Srivastava, P.K., 2001 Pigeonpea (Cajanus cajan L.) urease immobilized on glutaraldehyde-activated chitosan beads its analytical applications Appl Biochem Biotechnol 96: 41–49 51 Kerr, P S., Blevins, D G., Rapp, B J Rall, D D, 1983 Soybean leaf urease: Comparison with seed urease Fhysiol Plant 57: 339-345 52 Lê Thị Phú, Nguyễn Thị Cẩm Vi, 2007 Xác định phân tử lượng thông số động học urease từ đậu nành hạt vàng Việt nam Tạp chí phát triển KH&CN, Tập 10, Số 05 53 Lee C K, Karunanithy R, 1990 Effects of germination on the chemical composition of Glycine Phaseolus beans J Sci Food Agric 51: 437-445 Page 77 54 Leubner-Metzger, G, 2001 Brassinosteroids gibberellins promote tobacco seed germination by distinct pathways Planta 213: 758-763 55 Lineweaver, H., Burke, D., J Am, 1934 Chem Sot, 56: 658 56 Lu-qiang Yang, Properties, Song-hua Wang Ya-ping Tian, 2008 Purification, Application of a Novel Acid Urease from Enterobacter sp Applied Biochemistry Biotechnology 57 M S Rahman, N K Sana, M M Hasan, M E Huque1 R K Shaha, 2008 Enzyme activities degradation of nutrients in chickpea (Cicer Arietinum L.) seeds during germination J Bio-sci 16: 29-34 58 M.M Mostafa, E.H Rahma, A.H Rady Chemical nutritional changes in soybean during germination Food Chemistry, Volume 23, Issue 4, 1987, Pages 257-275 59 M.W Lubbers, S.B Rodriguez, N.K Honey, R.J Thornton, Can J, 1996 Microbiol 42: 132–140 60 M.Y Kamel, R.R Hamed, 1975 Acta Biol Med Ger 34: 971–979 61 Matsumoto T, M Yatazawa, Y Yamamoto, 1977 Distribution change in the content of allantoin allantoic acid in developing nodulating nonnodulating soybean plants Plant Cell Physiol 18: 353-359 62 Minari, O Zilversmit, D.B, 1963.Analyt Biochem., - 320 63 Ming-Ching Hsieh, Terrence L Graham, 2001 Partial purification characterization of a soybean β-glucosidase with high specific activity towards isoflavone conjugates Phytochemistry, Volume 58: 995-1005 64 Mobley, H L T., & Hausinger, R P, 1989 Microbial ureases: significance, regulation, molecular characterization Microbiol Rev, 53, 85 65 Mobley, H.L., Isl, M.D & Hausinger, R.P, 1995 Molecular biology of microbial ureases Microbiol Rev 59, 451-480 Page 78 66 Nelson Carvajal, Mlreya Fernez, Juan Pablo Rodriguez Margarita Donoso, 1982 Urease of Spirulina maxima Phytochemistry, Vol 21: 2821-2823 67 Neveen S.I Geweely, 2006 Purification Characterization of Intracellular Urease Enzyme isolated from Rhizopus oryzae Biotechnology (3): 358364 68 Nilanjana Das, Arvind M ayastha, Punit K Srivastava, 2002 Purification characterization of urease from dehusked pigeonpea (Cajanus cajan L.) seeds Phytochemistry 61: 513–521 69 Om Prakash, Mahe Talat, S.H Hasan, Rajesh K Pey, 2008 Factorial design for the optimization of enzymatic detection of cadmium in aqueous solution using immobilized urease from vegetable waste Bioresource Technology 99: 7565–7572 70 P.K.J.P.D Wanasundara, F Shahidi, M.E Brosnan, 1999 Changes in flax (Linum usitatissmum) seed nitrogenous compounds during germination Food Chemistry 65: 289-295 71 P.T Smith, A.D King Jr., N Goodman, J Gen, 1993 Microbiol 139: 957–962 72 Polacco, J.C & Holl, M.A, 1993 Roles of urease in plant cells; in International Review of Cytology (Jeon, K.W & Jarvik, J., eds.) vol 145: 65-103 73 Polacco, J.C & Holl, M.A, 1994 Genetic control of plant ureases; in Genetic Engineering (Setlow, J.K., ed.) vol 16: 33-48 74 Polacco, J.C., Havir, E.A., 1979 Comparisons of soybean urease isolated from seed tissue culture J Biol Chem 254, 1707–1715 75 R H Sammour, 2005 Purification Partial Characterisation of an Acid Lipase in Germinating Lipidbody Linseedlings Turk J Bot 29, 177-184 Page 79 76 Rainbird, A L., A G Low, T Zebrowska, 1984 Effect of guar gum on glucose water absorption from isolated loops of jejunum in conscious growing pigs Br J Nutr 52:489–498 77 Rajamma Usha Manoranjan Singh, 1996 Proteases of germinating wingedbean (Psophocarpus tetragonolobus) seeds : purification characterization of an acidic protease Biochem J 313, 423±429 78 Ranajit Kumar Shara, N.K Sana, N Roy, K.K Biswas Abdullad Mamun, 2002 Partial Purification Characterisation of Protease from Germinating Wheat Seeds (Triticum aestivum L.) Pakistan Journal of Biological Sciences 5(3): 317-320 79 Riddles, P.W., Whan, V., Blakeley, R.L & Zerner, B, 1991 Cloning sequencing of a jac bean urease-encoding cDNA Gene 108, 265- 267 80 S Fujinawa, G Burns, Pete De La Teja, 1990 Application of Acid Urease to Reduction of Urea in Commercial Wines Am J Enol Vitic 41:4:350354 81 Saleh A Mohamed, Abdulrahman L Al-Malki Taha A Kumosani, 2009 Partial Purification Characterization of Five á-amylases from a Wheat Local Variety (Balady) During Germination Australian Journal of Basic Applied Sciences, 3(3): 1740-1748 82 Samimy C & LaMotte C E, 1976 Anomalous temperature dependenee of seedling development in some soybean (Gly-cine max [L.] Merr.) eultivars Plant Physiol 58: 786-789 83 Sasha Englard Sam Seifter 1990 Precipitation techniques Methods in Enzymology, vol 182 Page 80 84 Seung Yong Cho, Yu Nam Lee, Hyun Jin Park, 2009 Optimization of ethanol extraction further purification of isoflavones from soybean sprout cotyledon Food Chemistry, Volume 117: 312-317 85 Shawn Doonan 1996 Bulk Purification by Fractional Precipitation Methods in Molecular Biology, vol 59 86 Shin-Ichi Okuda, Jun Kaneko, Toshiya Ogawa, Takuya Yamaguchi, Kazuo Izaki Hajime Takahashi, 1987 Increase in Enzyme Activities in Embryonic Axes of Soybean Seeds during Germination Agricultural Biological Chemistry, Vol.51: 109-113 87 Sibel Sungur Murat Elch, 1992 Studies on immobilization of urease in gelatin by cross-linking Epartment of Chemistry, Ankara University: 795800 88 Srivastava, P.K., Kayastha, A.M., Srinivasan, 2001 Characterisation of gelatin-immobilized pigeonpea urease preparation of a new urea biosensor Biotechnol Appl Biochem 34, 55–62 89 Stebbins, N., Holl, M.A., Cianzio, S.R., Polacco, J.C., 1991 Genetic tests of the roles of the embryonic ureases of soybean Plant Physiol 97: 1004–1010 90 Steber, C M., McCourt, P., 2001 A role for brassinosteroids in germination in Arabidopsis Plant Physiology 125: 763-769 91 Stitt, M., 1999 Nitrate regulation of metabolism growth Curr Opin Plant Biol 2, 178-186 92 Subramaniam Mahadevan, Frank D Sauer James D Erfle, 1977 Purification Properties of Urease from Bovine Rumen Biochem J 163: 495-501 Page 81 93 Tarek M Mohamed, Magda A Mohamed, Saleh A Mohamed, Afaf S Fahmy, 1999 Purification of urease from water melon seeds for clinical diagnostic kits Bioresource Technology 68: 215-223 94 Thompson, J.F., 1980 Arginine synthesis, proline synthesis, related processes In: Miflin, B.J (Ed.), In: The Biochemistry of Plants, vol.5: 375– 402 95 V.P Dia, W Wang, V.L Oh, B.O.de Lumen, E Gonzalez de Mejia, 2009 Isolation, purification characterisation of lunasin from defatted soybean flour in vitro evaluation of its anti-inflammatory activity Food Chemistry, Volume 114: 108-115 96 Valéria Monteze Guimarães, Sebastião Tavares de Rezende, Maurilio Alves Moreira, Everaldo Gonỗalves de Barros Carlos Roberto Felix, 2001 Characterization of α-galactosidases from germinating soybean seed their use for hydrolysis of oligosaccharides Phytochemistry, Volume 58: 167-73 97 Vineet Kumar, Anita Rani, Vimal Pey, G.S Chauhan, 2006 Changes in lipoxygenase isozymes trypsin inhibitor activity in soybean during germination at different temperatures Food Chemistry, Volume 99: 563568 98 Viraj Beri, K.P Goswami S.S Brar, 1978 Urease activity its Michaelis constant for soil systems Plant and soil 49, 105-115 Page 82 PHỤ LỤC Phụ lục Xây dựng đường chuẩn cơng thức tính protein hịa tan Hố chất: Dung dịch protein chuẩn: cân 5mg albumin, định mức đến 50ml nước cất dung dịch có nồng độ 0.1mg/ml Dung dịch thuốc thử Bradford: • Coomassie Brilliant Blue – G250: mg • Ethanol tuyệt đối: 50 ml • Acid phosphoric 85%: 100ml Phẩm màu hòa tan ethanol, bổ sung acid phosphoric định mức đến 1000 ml nước cất Lọc chân không, cho vào chai tối, bảo quản 4oC Cách tiến hành: Hút 0.05ml dung dịch có chứa protein vào ống nghiệm khô, thêm nước cất để 1ml Sau thêm vào 5ml thuốc thử Bradford, lắc đều, để ổn định 15 phút Đo mật đô quang mẫu thí nghiệm ODx mẫu trắng ODo (thay nước cất) bước sóng 595 nm máy UV – Vis Tính giá trị: ∆OD = ODx - ODo Page 83 Hàm lượng protein dung dịch xác định dựa vào phương trình hồi quy đồ thị chuẩn Sau đó, vẽ đồ thị biểu diễn mối quan hệ tương quan phân đoạn (các ống) giá trị ∆OD, ghi nhận peak tạo thành Xây dựng đường chuẩn: Sử dụng dung dịch protein chuẩn biết trước nồng độ Lấy ống nghiệm đánh số thứ tự 0, 1, 2, 3, 4, Bổ sung thành phần vào ống nghiệm theo bảng sau: TT Ống nghiệm Dung dịch BSA (µl) 80 160 240 320 400 Dung dịch đệm (µl) 800 720 640 560 480 400 Thuốc thử Bradford (ml) 4 4 4 Lượng protein (µg) 16 24 32 40 Lắc ống nghiệm, để yên 15 phút, tiến hành đo mật độ quang dung dịch bước sóng 595nm máy UV – Vis Lập đường chuẩn: Page 84 Xác định hàm lượng protein Hàm lượng protein mg/g mg/g Hàm lượng protein tổng Pt = P *Vt mg Pt = P *mt mg Page 85 Hàm lượng protein dịch thu từ số phân đoạn sau qua cột sắc ký P: hàm lượng protein phân đoạn sau qua cột sắc ký(mg/ml) P1 Pn : lượng protein ống suy từ đường chuẩn (mg) V1 Vn: thể tích ống (ml) y: giá trị hiệu mật độ quang đo (A) F: độ pha loãng mẫu m: khối lượng mẫu thử nghiệm (mg) mt : tổng khối lượng mẫu (mg) Vt : tổng thể tích dịch (ml) a, b : hệ số phương trình đường chuẩn NH3 Phụ lục Dựng dường chuẩn công thức tính hoạt tính enzyme Dựng đường chuẩn NH3 Chuẩn bị dung dịch gốc NH4Cl chứa 10µg NH3/ml: cân 0,3089g NH4Cl, định mức lên 100ml, rút 1ml dung dịch tiếp tục định mức 100ml Page 86 Lấy ống nghiệm, đánh số thứ tự từ đến Cho vào ống nghệm dung dịch theo trình tự sau: Ống Dung dịch NH4Cl (ml) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 Lượng NH3 (µg) 10 15 20 25 30 35 40 Nước cất (ml) 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 Thuốc thử Nessler (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Để mẫu ổn định màu 15 phút, sau lắc đo mật độ quang bước sóng 490 nm Vẽ đường chuẩn NH3 với trục tung mật độ quang (A), trục hoành hàm lượng NH3 Page 87 Xác định hoạt tính Pha dung dịch urea 2%: cân 2g urea, định mức 100ml đệm phosphate 1/15 M, pH Lấy ống nghiệm khô, cho vào: 0.4ml nước cất + 0.5ml dung dịch urea 2% o Giữ ống nghiệm bể điều nhiệt đến đạt 30 C o Khi ống nghiệm đạt 30 C, bổ sung 0.1ml dung dịch urease, lắc đều, để phản o ứng 30 C vòng 10 phút Thêm vào ống nghiệm 0.5ml HCl 1N để khử hoạt tính urease làm ngừng phản ứng Làm đồng thời mẫu trắng: thay dung dịch urea 2% nước cất hay khử hoạt tính urease 0.5ml HCl 1N trước cho urea vào Xác định lượng NH3 tạo thành: lấy 0.5 ml dung dịch sau phản ứng, bổ sung thêm 5.0 ml nước cất 0.5ml thuốc thử Nessler, lắc đều, để ổn định màu 15 phút Đo mật độ quang mẫu thử mẫu trắng bước sóng 490nm Tính: ∆OD = ODmt - ODmtr Dựa vào đường chuẩn NH3, suy hàm lượng NH3 tạo thành Hoạt tính chế phẩm: A= y − b 1.5 1 × × × × × F (UI/mg) a 0.5 0.1 17 ×10 m Page 88 Tổng hoạt tính: At = A × m (UI) Hoạt tính riêng: AP = y: At (UI/mg protein) mP mật độ quang (A) a, b : hệ số phương trình đường chuẩn NH3 m: khối lượng enzyme urease sử dụng (mg) mP : khối lượng protein chế phẩm (mg) F: thể tích dung dịch enzyme urease sau hòa tan (ml) Phụ lục Cách pha dịch đệm a Cách pha dịch đệm phosphate Dung dịch dinatri hydrophosphate 1/15M (a): 23,9g Na2HPO4.12H2O hòa tan định mức lên 1000 ml Dung dịch kali dihydrophosphate 1/15M (b): 9,07g KH2PO4 hòa tan định mức lên 1000 ml Dung dịch đệm có pH khác phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) số ml dung dịch (b) Page 89 a b pH a b pH 10 990 5,0 372 628 6,6 18 982 5,2 492 508 6,8 30 970 5,4 612 388 7,0 49 951 5,6 726 274 7,2 79 921 5,8 818 182 7,4 121 879 6,0 885 115 7,6 184 816 6,2 936 64 7,8 264 736 6,4 969 31 8,0 b Cách pha dịch đệm acetate Dung dịch acid acetic 0,2M (a): 11,55 ml CH3COOH đặc định mức đến 1000 ml Dung dịch natri acetate 0,2M (b): 16,4g CH3COONa cân 27,2 g CH3COONa.3H2O đuợc hòa tan định mức đến 1000 ml Dung dịch đệm có pH khác phụ thuộc vào X ml dung dịch (a) Y ml dung dịch (b) định mức đến 100 ml a b pH a b pH 46,3 3,7 3,6 20,0 30,0 4,8 44,0 6,0 3,8 14,8 35,2 5,0 41,0 9,0 4,0 10,5 39,5 5,2 36,8 13,2 4,2 8,8 41,2 5,4 30,5 19,5 4,4 4,8 45,2 5,6 25,5 24,5 4,6 Page 90 ... khả tinh qua bước 58 3.5 So sánh tính chất enzyme urease từ mầm đậu nành, hạt đậu nành enzyme urease thương mại 60 3.5.1 So sánh tính chất enzyme urease từ mầm đậu nành hạt đậu nành. .. phẩm urease sau thu nhận xác định tiêu để so sánh tính chất urease thu nhận từ mầm đậu nành Page 31 enzyme urease hạt đậu nành (các nghiên cứu trước đây), enzyme urease hạt đậu rựa (enzyme urease. .. Page 25 Đậu nành Nẩy mầm Khảo sát điều kiện nẩy mầm để thu nhận urease Trích ly urease Khảo sát dịch đệm trích ly urease Tinh So sánh tính chất urease trích ly từ mầm đậu nành hạt đậu nành nguyên