Thu nhận và tinh sạch enzym bromelin từ dứa cayenne

ĐẠI HỌC QUỐ C GIA TP HỒCHÍ MINH TRƯỜ NG ĐẠI HỌC BÁ CH KHOA LÊHỮ U Ý THU NHẬ N VÀTINH SẠCH ENZYM BROMELIN TỪDỨ A CAYENNE CHUYÊ N NGÀ NH: KHOA HỌC & CÔ NG NGHỆTHỰC PHẨ M MÃSỐNGÀ NH: 2.11.00 LUẬ N VĂ N THẠC SĨ TP HỒCHÍ MINH, THÁ NG 07 NĂ M 2006 CÔ NG TRÌNH ĐƯC HOÀ N THÀ NH TẠI TRƯỜ NG ĐẠI HỌC BÁ CH KHOA ĐẠI HỌC QUỐ C GIA TP HỒCHÍ MINH Cán bộhướng dẫn khoa học: TS HOÀ NG KIM ANH Chữký Cán bộchấm nhận xét 1: TS TRẦ N BÍCH LAM Chữký Cán bộchấm nhận xét 2: TS LÊTHỊPHÚ Chữký Luận văn bả o vệtại HỘ I ĐỒ NG CHẤ M BẢ O VỆLUẬ N VĂ N THẠC SĨ, Trường Đại học Bá ch Khoa Tp HồChí Minh Ngày 09 thá ng 08 năm 2006 TR NG HỊA XÃ H I CH NGH A VI T NAM C L P T DO H NH PHÚC NG I H C BÁCH KHOA PHÒNG ÀO T O S H Tp HCM, ngày tháng n m 200 NHI M V LU N V N TH C S tên h c viên: LÊ H U Ý Ngày, tháng, n m sinh: 12/05/1980 Chuyên ngành: Khoa h c công ngh th c ph m Phái: Nam i sinh: Sông Bé MSHV: 01104307 I- TÊN TÀI: THU NH N VÀ TINH S CH ENZYME BROMELAIN T CAYENNE D A II- NHI M V VÀ N I DUNG: Kh o sát hàm l ng protein ho t tính bromelain q trình phát tri n c a qu d a Cayenne Ch n nguyên li u- ph ph m c a công nghi p ch bi n d a thu nh n enzyme t t a enzyme, tinh s ch b ng s c ký l c gel Xác nh m t s tính ch t c a enzyme thu c (t0opt, pHopt, thông s ng c) III- NGÀY GIAO NHI M V : 06/02/2006 IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHI M V : 06/07/2006 V- CÁN B H NG D N (Ghi rõ h c hàm, h c v , h , tên): TS HOÀNG KIM ANH CÁN B H NG D N (H c hàm, h c v , h tên ch ký) CN B MÔN QL CHUYÊN NGÀNH TS HOÀNG KIM ANH i dung c ng lu n v n th c s ã cH i ng chuyên ngành thơng qua Ngày TR NG PHỊNG T S H TR tháng n m NG KHOA QL NGÀNH Tôi xin chân thành m ơn: TS Hoàng Kim Anh Viện Sinh học nhiệt đới TP HồChí Minh Đãtận tình hướng dẫn, động viên, tạo điều kiện vàđóng góp nhiều ýkiến q báu suốt quátrình nghiên cứu PGS TS Đống ThịAnh Đào Bộmôn Hóa Thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa TP HồChí Minh Đãgiúp đỡ, động viên đểLuận văn hoàn thành cách tốt đẹp TS LêVăn Việt Mẫn Chủnhiệm Bộmôn Hóa Thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa TP HồChí Minh Đãgiúp đỡtrong quátrình thực Luận văn Xin chân thành m ơn sựgiú p đỡ, hỗtrợcủ a: Thầy Văn Đứ c Chín, Bộmôn Sinh hóa , trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP HồChí Minh Anh Nguyễn Duy Tân, học viên lớp K15 trường Đại học Bách Khoa TP HồChí Minh ChịPhạm Kim Phụng, học viên lớp K15 trường Đại học Bách Khoa TP HồChí Minh Các Anh, Chị, bạn bèlớp K15 trường Đại học Bách Khoa TP HồChí Minh Em Nguyễn Thị Thanh Bình, sinh viên trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP HồChí Minh MỤC LỤC DANH MỤC BAÛ NG I DANH MỤC HÌNH II TRÍCH YẾ U IV MỞĐẦ U TỔ NG QUAN TÀ I LIEÄ U 2.1 ĐẶ C ĐIỂ M SINH HỌC CỦ A DỨ A [17] 2.1.1 Reã 2.1.2 Thaân 2.1.3 Laù 2.1.4 Hoa 2.1.5 Quaû 2.1.6 Haït 2.2 Ứ NG DỤNG CỦ A DỨ A 2.2.1 Nguồn thực phẩm cho người 2.2.2 Món ăn chữa bệnh 2.2.3 Thức ăn cho vật nuôi 10 2.2.4 Các ứng dụng khác 10 2.3 TÌNH HÌNH PHÁ T TRIỂ N CỦ A NGÀ NH CÔ NG NGHIỆ P CHẾBIẾ N DỨ A TẠI VIỆ T NAM VÀTRÊ N THẾGIỚ I 10 2.4 ENZYME BROMELAIN TRONG DỨ A 13 2.4.1 Tính chất vật lývàcấu tạo hóa học 13 2.4.2 Caáu trúc không gian 15 2.4.3 Hoạt tính bromelain 16 2.4.4 Cơ chếtác động bromelain 17 2.4.5 Các yếu tốảnh hưởng đến hoạt tính bromelain 19 2.4.6 Các ứng dụng cuûa bromelain 20 2.5 MỘ T SỐPHƯƠNG PHÁ P THU NHẬ N ENZYME BROMELAIN 23 2.5.1 Sơ đồ chung 23 2.5.2 Phương pháp phávỡtếbào thu enzyme 23 2.5.3 Thu nhận enzyme dựa đặc điểm hòa tan 24 2.5.4 Thu nhận enzyme phương pháp hấp phụ 25 2.5.5 Thu nhận enzyme phương pháp siêu lọc 25 2.5.6 Tinh enzyme phương pháp sắc kyù 26 NGUYÊ N VẬ T LIỆ U VÀ PHƯƠNG PHÁ P NGHIÊ N CỨ U 29 3.1 NGUYÊ N VẬ T LIỆ U 29 3.2 PHƯƠNG PHÁ P NGHIÊ N CỨ U 32 3.2.1 Sô đồnghiên cứu 32 3.2.2 Qui trình thu nhận enzyme bromelain 33 3.2.3 Ly trích bromelain 33 3.2.4 3.2.5 3.2.6 3.2.7 3.2.8 3.2.9 Kết tủa protein 34 Khảo sát điều kiện kết tủa enzyme bromelain 34 Tinh saïch bromelain sắc kýlọc gel 35 Xác định sốtính chất chếphẩm enzyme thu 35 Các phương pháp phân tích 37 Xửlýsốliệu 37 KEÁ T QUẢVÀ BÀ N LUẬ N 38 4.1 KHẢ O SÁ T HÀ M LƯNG PROTEIN HÒ A TAN VÀHOẠT TÍNH BROMELAIN TRONG QUÁTRÌNH PHÁ T TRIỂ N CỦ A QUẢDỨ A CAYENNE 38 4.1.1 Sự biến động hàm lượng protein hòa tan vàhoạt tính bromelain trình phát triển quảdứa Cayenne 38 4.1.2 Sựphân bốhàm lượng protein hòa tan vàhoạt tính bromelain phận quảdứa Cayenne 42 4.2 LỰA CHỌN NGUYÊ N LIỆ U THU NHẬ N ENZYME 44 4.2.1 Chọn nguyên liệu vàthời điểm thu nhận enzyme 44 4.2.2 So sánh số số khối lượng, hàm lượng protein hoạt tính bromelain ởdứa Cayenne vàdứa Queen 47 4.3 THU NHẬ N VÀTINH SẠCH BROMELAIN 50 4.3.1 Khaûo sát tác nhân kết tủa 50 4.3.2 Xác định nồng độamonium sulfate bão hòa 51 4.3.3 Xác định điều kiện tủa thích hợp 52 4.3.4 Tinh bromelain phương pháp sắc kýlọc gel 56 4.4 KHAÛ O SÁ T MỘ T SỐ TÍNH CHẤ T CỦ A CHẾ PHẨ M ENZYME BROMELAIN 58 4.4.1 Khảo sát nhiệt độtối thích vàpH tối thích chếphẩm 58 4.4.2 Xác định sốMichaelis-Menten vàvận tốc phản ứng cực đại 59 KẾ T LUẬ N 62 TÀ I LIỆ U THAM KHAÛ O 64 PHUÏLUÏC 67 i DANH MỤC BẢ NG Bảng 1.1 Vị trí dứa bảng phân loại thực vật Bảng 2.1 Thành phần hóa học quảdứa Bảng 2.2 Các quốc gia sản xuất dứa chủyếu Bảng 2.3 Một sốthông sốvật lýcủa bromelain Bảng 2.4 Thành phần amino acid vàcác nhóm khác bromelain Bảng 2.5 Hoạt tính phân giải casein bromelain Bảng 2.6 Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide (BAA) bromelain Bảng 2.7 Hằng sốMichaelis chất tổng hợp khác Bảng 4.1 Hàm lượng protein vàhoạt tính chung (HTC) ởlõi, thịt quảvàvỏdứa Queen vàCayenne Bảng 4.2 So sánh khối lượng, tổng hàm lượng protein, tổng hoạt tính vàhoạt tính riêng ởlõi-vỏvàthịt quảdứa Queen vàCayenne Bảng 4.3 So sánh kết quảtủa bromelain tác nhân kết tủa khác Bảng 4.4 Kết quảtủa enzyme amonium sulfate ởcác độbão hòa khác Bảng 4.5 Bảng kết quảkhảo sát hàm lượng protein vàhoạt tính bromelain ởcác chếđộtủa khác với tác nhân (NH4)2SO4 bão hòa Bảng 4.6 Thông sốcủa quátrình tinh chếphẩm bromelain Bảng 4.7 Hoạt tính chếphẩm enzyme theo nhiệt độ Bảng 4.8 Hoạt tính chếphẩm enzyme theo pH ii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Những thay đổi quátrình phát triển quảdứa Hình 2.2 Cấu trúc phần carbohydrate bromelain Hình 2.3 Một sốsản phẩm thuốc cóchứa bromelain Hình 3.1 Dứa Cayenne ởđộtuổi 80 ngày và110 ngày (tính từngày xửlýbằng đất đèn) Hình 3.2 Các bộphận quảdứa Cayenne ởđộtuổi 110 ngày Hình 3.3 Sơ đồnghiên cứu Hình 3.4 Qui trình thu nhận enzyme bromelain Hình 3.5 Hình minh họa phương pháp Lineweaver et Burk Hình 4.1 Sự biến động hàm lượng protein hòa tan vàhoạt tính chung ởlátheo ngày tuổi Hình 4.2 Sự biến động hàm lượng protein hòa tan vàhoạt tính bromelain ởchồi theo ngày tuổi Hình 4.3 Sự biến động hàm lượng protein hòa tan vàhoạt tính bromelain cuống theo ngày tuổi Hình 4.4 Sự biến động hàm lượng protein hòa tan vàhoạt tính bromelain ởlõi theo ngày tuổi Hình 4.5 Sự biến động hàm lượng protein hòa tan vàhoạt tính bromelain ởthịt quảtheo ngày tuổi Hình 4.6 Sự biến động hàm lượng protein hòa tan vàhoạt tính bromelain ởvỏ quảtheo ngày tuổi Hình 4.7 Sự phân bốtổng hàm lượng protein hòa tan ởcác phần khác quảdứa Cayenne Hình 4.8 Sựphân bốtổng hoạt tính bromelain ởcác phần khác dứa Cayenne Hình 4.9 So sánh hàm lượng protein vàhoạt tính chung (HTC) ởlõi, thịt quảvà vỏdứa Queen vàCayenne Hình 4.10 So sánh khối lượng lõi, thịt quảvàvỏdứa Queen vàCayenne Hình 4.11 So sánh tổng protein vàtổng hoạt tính (THT) ởlõi, vỏvàthịt quảdứa Queen vàCayenne Hình 4.12 Đồthịbiểu diễn phương trình hồi qui hoạt tính bromelain theo thông sốnhiệt độvàpH Hình 4.13 Đồthịbiểu diễn hàm lượng protein vàhoạt tính enzyme thu nhận theo thời gian phương pháp sắc kýlọc gel iii Hình 4.14 Sựthay đổi hoạt tính chếphẩm theo nhiệt độ Hình 4.15 Sựthay đổi hoạt tính chếphẩm theo pH Hình 4.16 Đường biểu diễn vận tốc phản ứng theo nồng độcơ chất Hình 4.17 Đường thẳng xây dựng theo phương pháp Lineweaver et Burk 65 18 Trần Thị Hường (2003), Thu nhận bromelin vàthửnghiệm dùng chếphẩm bromelin đểlàm phomat tươi, Luận văn Thạc só Khoa học Công nghệthực phẩm, Đại học Bách khoa TP HồChí Minh 19 Trịnh Xuân Vũ(1976), Sinh lýthực vật, Nhàxuất Nông thôn 20 VũCông Hậu (1987), Cây ăn quảmiền Nam, Nhàxuất Nông nghiệp 21 G Sarlot (1978), Các phương pháp hóa phân tích, tập 2, Nhàxuất Đại học vàtrung học chuyên nghiệp, HàNội 22 V L Kretovits – V L Iarovenko (1982), Sửdụng chếphẩm enzym công nghiệp thực phẩm, Nhàxuất Khoa học vàKỹthuật 23 A Braith Waite, Chromatographic methods, Kluwer Academic Publishers, Boston, London 24 Alan Wiseman (2000), Handbook of enzyme biotechnology, 3rd edition, Ellis Horwood 25 Ballis (Zud) (1941), Eng Chem-33, 150 26 Berndt (W) (1968), Castroenterol 6,3, Chem Abs 27 Coveca (2002), Comision veracruzana de comercializacion agropecuaria Gobierno del Estado de Veracruz, Mexico 28 David, Harvey (2000), Modern Analytical Chemistry, McGraw- Hill Companies, Inc 29 Doi E., et al (1974), Carboxypeptidase in commercial Bromelain powder, partial purufication and some properties of pineapple carboxypeptidase, Biochem 75, 5, p 1063-1071 30 Dominic W S Wong (2001), Food enzymes structure and mechanism, Chapman & Hall 31 Gastronomía (2004) htpp://www.peru.com /gastronomia/docs2/ 32 Geo coppens (2001), http://www.ciat.cgiar.org/ipgri/fruits_from_americas/frutalesGeo 33 Marin (LA), Chem, Abs-53 34 Maurer, H.R., Review- Bromelain: biochemistry, pharmacology and medical use 35 Morton, J (1987), Fruits of warm climates, Creative Resource Systems, Inc NC, p.18-28 36 Mundogar (2004) http://www.mundogar.com 37 Py C.y M Tisseau (1969), La pina tropical, Ed Blume Barcelona, p.278 38 Rodney F Boyer (1993), Modern experimental biochemistry, The Benjamin/Cummings Publishing Company Inc 39 Ruyssen and A Lauwers, 1978, Pharmaceutical Enzymes- properties and assay methods, Story Scientia P.V.B.A, p 107-117 66 40 Sanewski, G and Scott, C (2000), The Australian pineappl industry, In: Subhadrabandhu, S and Chairidchai, P (eds), Proceedings of the Third International Pineapple Symposium International Society for Horticultural Science, Pattaya, Thailand, p.53-55 41 Sidney P Colowick, Nathan O Kaplan, Methods in enzymololy, vol2, McCollum, Pratt Institute, the Jonh Hopkins University, Baltimore, Maryland 42 Su (YuanChi) (1967), Spec ISS, Dec 42-54 Chem Abs 69 43 www.baobinhdinh.com.vn 44 www.chromatography.amershambiosciences.com 45 www.cpv.org.vn 46 www.hort.purdue.edu/newcrop/morton/pineapple.html 47 www.fao.org/inpho/content/compend/text/ch33/AE614e01.htm 48 www.news.bbc.co.uk/1/hi/health/4697739.stm 49 www.nhandan.com.vn 50 www.vnanet.vn 67 PHUÏLUÏC PHỤLỤC 1: CÁ C DUNG DỊCH ĐỆ M SỬDỤNG TRONG CÁ C PHÉ P PHÂ N TÍCH [3] DUNG DỊCH ĐỆ M PHOSPHATE (PH 5,7-8,0) a Dung dịch monosodium orthophosphate 0,2 m (dung dịch a): Cân 27,8 g NaH2PO4 hòa tan vàdẫn nước đến 1000 ml b Dung dịch disodium hydrophosphate (dung dịch b): Cân 53,05 g Na2HPO4.7H2O 71,7 g Na 2HPO4.12H2O hòa tan vàdẫn nước đến 1000 ml c Pha dung dịch đệm phosphate: Dung dịch đệm phosphate cópH khác phụ thuộc vào sốml dung dịch (a) vàsốml dung dịch (b), dẫn nước đến 200 ml a (ml) b (ml) pH a (ml) b (ml) pH 93,5 6,5 5,6 45,0 55,0 6,9 9,2 8,0 5,8 39,0 61,0 7,0 90,0 10,0 5,9 33,0 67,0 7,1 87,7 12,3 6,0 28,0 72,0 7,2 85,0 15,0 6,1 23,0 77,0 7,3 81,5 18,5 6,2 19,0 81,0 7,4 77,5 22,5 6,3 16,0 84,0 7,5 73,5 26,5 6,4 13,0 87,0 7,6 68,5 31,5 6,5 10,5 89,5 7,7 62,5 37,5 6,6 8,5 91,5 7,8 56,5 43,5 6,7 7,0 93,0 7,9 51,0 49,0 6,8 5,3 94,7 8,0 68 DUNG DỊCH ĐỆ M CITRATE (PH 3,0-6,2) a Dung dịch citric acid (dung dịch a): Hòa tan 21,01 g C6H8O7.H2O vào nước vàđịnh mức đến 1000 ml b Dung dịch trisodium citrate: Hòa tan 29,41 g C6H5O7Na 2H2O vào nước vàđịnh mức đến 1000 ml c Pha dung dịch đệm citrate: Dung dịch đệm citrate cógiátrị pH khác phụ thuộc vào sốml dung dịch (a) vàsốml dung dịch (b) theo bảng sau: a (ml) b (ml) pH a (ml) b (ml) pH 46,5 3,5 3,0 23,0 27,0 4,8 43,8 6,2 3,2 20,5 29,5 5,0 40,0 10,0 3,4 18,0 32,0 5,2 37,0 13,0 3,6 16,0 34,0 5,4 35,0 15,0 3,8 13,7 36,3 5,6 33,0 17,0 4,0 11,8 38,2 5,8 31,0 19,0 4,2 9,5 40,5 6,0 28,0 22,0 4,4 7,2 42,8 6,2 25,5 24,5 4,6 PHUÏLUÏC 2: SỰBIẾ N ĐỘ NG CỦ A HÀ M LƯNG PROTEIN HÒ A TAN ỞCÁ C THÀ NH PHẦ N KHÁ C NHAU CỦ A QUẢDỨ A CAYENNE THEO NGÀ Y TUỔ I Hàm lượng protein (mg/g bộphận) Ngày tuổi Lá Chồi 80 1,53 ± 0,85 3,95 ± 0,27 90 4,07 ± 1,45 100 Cuống Lõi Thịt Vỏ 5,65 ± 0,61 22,72 ± 2,44 8,56 ± 2,07 3,44 ± 0,22 4,20 ± 0,18 5,74 ± 0,88 15,77 ± 1,49 7,29 ± 1,22 4,17 ± 1,10 4,48 ± 1,10 6,15 ± 0,24 6,47 ± 0,65 7,91 ± 0,73 10,94 ± 0,19 4,56 ± 0,65 110 10,66 ± 0,83 7,54 ± 0,75 9,82 ± 1,81 16,12 ± 1,20 11,16 ± 1,50 6,35 ± 1,34 120 13,92 ± 1,18 6,60 ± 0,80 13,09 ± 1,56 14,98 ± 2,36 11,68 ± 1,07 9,11 ± 1,57 130 13,83 ± 1,72 12,50 ± 1,08 13,95 ± 1,36 12,69 ± 0,72 9,20 ± 0,83 9,80 ± 1,34 140 8,31 ± 0,77 13,01 ± 1,59 10,82 ± 1,39 13,32 ± 0,57 14,17 ± 2,47 11,24 ± 1,75 150 5,57 ± 0,88 1,87 ± 0,57 5,61 ± 0,79 69 7,58 ± 0,96 6,57 ± 1,59 6,06 ± 1,34 PHỤLỤC 3: SỰBIẾ N ĐỘ NG CỦ A HOẠT TÍNH CHUNG CỦ A BROMELAIN ỞCÁ C THÀ NH PHẦ N KHÁ C NHAU CỦ A QUẢDỨ A CAYENNE THEO NGÀ Y TUỔ I Hoạt tính chung (UI/g bộphận) Ngày tuổi Lá Chồi Cuống Lõi Thịt Vỏ 80 46,02 ± 2,18 69,30 ± 0,56 73,02 ± 0,60 255,32 ± 1,03 143,38 ± 4,31 161,27 ± 0,96 90 74,12 ± 2,22 95,01 ± 0,51 79,14 ± 0,19 134,87 ± 5,23 42,19 ± 0,72 207,14 ± 5,78 100 80,94 ± 2,35 80,28 ± 0,62 95,21 ± 1,24 92,91 ± 0,60 87,48 ± 0,81 69,82 ± 0,94 110 123,04 ± 10,72 90,63 ± 1,36 94,33 ± 1,43 161,34 ± 1,14 65,37 ± 1,35 45,01 ± 1,03 120 481,35 ± 4,28 90,19 ± 3,20 525,52 ± 5,71 512,08 ± 7,39 244,25 ± 1,66 100,11 ± 2,22 130 353,66 ± 4,24 155,07 ± 1,31 165,90 ± 3,11 120,81 ± 0,82 245,18 ± 2,32 92,26 ± 0,80 140 366,17 ± 3,73 137,84 ± 2,27 246,34 ± 2,89 176,36 ± 1,26 470,61 ± 2,07 280,34 ± 4,53 150 184,26 ± 2,80 48,22 ± 1,54 71,55 ± 1,51 85,10 ± 1,21 80,19 ± 2,13 133,07 ± 2,57 70 71 PHỤLỤC 4: SỰBIẾ N ĐỘ NG CỦ A HOẠT TÍNH RIÊ NG CỦ A BROMELAIN ỞCÁ C THÀ NH PHẦ N KHÁ C NHAU CỦ A QUẢDỨ A CAYENNE THEO NGÀ Y TUỔ I Hoạt tính riêng (UI/mg protein) Ngày tuổi Lá Chồi Cuống Lõi Thịt Vỏ 80 29,69±1,28 17,40±0,26 12,93±0,60 11,27±0,66 16,57±0,80 9,34±0,16 90 18,39±1,12 22,53±0,86 13,76±0,49 9,89±0,11 100 17,69±0,71 13,03±0,86 14,64±0,41 11,67±0,47 7,99±0,80 15,10±0,56 110 11,59±0,55 11,83±0,57 5,74±0,60 120 34,50±0,56 130 25,50±0,36 12,43±1,06 11,73±1,10 140 43,97±0,70 10,47±0,76 22,77±0,45 13,20±0,60 24,87±0,71 33,13±0,42 150 33,10±0,40 25,90±0,60 12,70±0,75 11,23±0,49 12,03±0,57 22,01±0,86 9,63±0,61 8,41±2,64 9,97±0,38 5,78±0,37 7,07±0,41 8,59±0,41 30,12±16,9 34,21±0,95 20,97±0,55 10,87±0,59 9,43±0,15 26,60±0,60 9,45±0,61 PHỤLỤC 5: TRỌNG LƯNG CÁ C BỘPHẬ N CỦ A QUẢDỨ A CAYENNE THEO NGÀ Y TUỔ I Ngày tuổi Trọng lượng (g) Lá Chồi Cuống Lõi Thịt Vỏ 80 46,13 19,32 67,00 29,46 101,59 66,70 90 53,20 52,56 66,51 44,09 196,93 99,80 100 35,50 135,76 57,37 69,40 455,68 186,85 110 46,08 112,21 56,74 68,95 482,74 201,04 120 41,95 152,13 50,86 66,77 513,77 192,10 130 31,70 143,7 55,02 99,00 551,85 237,45 140 50,03 240,10 65,00 115,01 575,12 275,00 150 53,93 274,30 63,05 175,98 687,85 218,27 72 PHỤLỤC 6: SỰBIẾ N ĐỘ NG CỦ A TỔ NG HÀ M LƯNG PROTEIN Ở CÁ C BỘPHẬ N KHÁ C NHAU CỦ A QUẢDỨ A CAYENNE THEO NGÀ Y TUỔ I Tổng protein (mg) Ngày tuổi Lá Chồi Cuống Lõi Thịt Vỏ 80 70,51 ± 39,38 76,28 ± 5,22 378,52 ± 40,61 669,40 ± 71,99 869,80 ± 210,53 229,42 ± 14,89 90 216,62 ± 77,29 220,91 ± 9,67 381,84 ± 58,33 695,23 ± 65,47 1435,61 ± 240,87 416,05 ± 110,20 100 159,02 ± 39,02 835,54 ± 33,02 370,88 ± 37,10 548,98 ± 50,40 4985,52 ± 85,97 851,91 ± 121,94 491,21 ± 38,19 846,01 ± 84,49 556,89 1111,75 ± 82,69 5387,95 ± 723,78 1275,99 110 ± 268,92 120 583,95 1003,97 ± 49,30 ± 121,37 665,71 999,99 ± 79,22 ± 157,75 5999,63 ± 551,32 1750,05 ± 302,38 130 438,29 1796,54 ± 54,42 ± 154,64 767,50 ± 74,97 1256,45 ± 70,84 7443,2 ± 671,12 2327,89 ± 317,45 140 415,50 3122,08 ± 38,62 ± 382,34 703,49 ± 90,26 1531,55 ± 65,89 8146,41 ± 269,16 3092,02 ± 246,79 150 511,59 300,37 ± 47,54 ± 157,46 353,92 1334,03 ± 49,69 ± 168,87 4515,9 ± 109,48 1322,92 ± 293,14 ± 50,89 73 PHUÏLUÏC 7: SỰBIẾ N ĐỘ NG TỔ NG HOẠT TÍNH ỞCÁ C BỘPHẬ N QUẢ KHÁ C NHAU CỦ A QUẢDỨ A CAYENNE THEO NGÀ Y TUỔ I Tổng hoạt tính (UI) Ngày tuổi Lá Chồi Cuống Lõi Thịt Vỏ 80 2126,35 ± 12,79 1327,55 ± 2,08 4883,37 ± 3,70 7533,36 ± 3,82 14498,37 ± 41,55 10709,10 ± 6,16 90 3930,05 ± 11,86 4979,84 ± 2,43 5234,69 ± 6,02 5920,28 ± 23,28 8293,64 ± 14,45 20609,32 ± 56,66 100 2827,87 10889,07 ± 7,58 ± 8,27 5439,92 ± 7,02 6396,65 ± 4,22 39833,07 ± 36,92 12841,35 ± 16,86 110 5688,32 10042,41 ± 4,69 ± 14,47 5333,81 11080,87 ± 8,14 ± 9,89 31182,94 ± 73,38 9000,15 ± 19,34 120 20161,05 28864,60 26700,70 34132,42 125592,96 ± 19,95 ± 48,28 ± 12,64 ± 22,86 ± 82,19 19052,62 ± 21,36 130 11178,68 22280,38 ± 6,85 ± 19,23 90,59 11858,18 197975,67 ± 16,88 ± 8,38 ± 181,45 21891,35 ± 19,13 140 18276,21 32879,96 15995,89 20243,97 269974,88 ± 18,63 ± 64,44 ± 18,65 ± 17,90 ± 117,49 76920,24 ± 67,43 150 9933,08 13228,85 ± 15,07 ± 40,20 4501,25 14981,05 ± 7,18 ± 19,12 54776,42 ± 154,92 29080,59 ± 13,35 74 PHỤLỤC 8: QUI TRÌNH THỰC HIỆ N PHƯƠNG PHÁ P BRADFORD [3] Chuẩn bị hó a chất: Dung dịch albumin 0,1 mg/ml: cân 10 mg albumin pha vào ml nước cất Lắc cho tan Giữởnhiệt độlạnh Khi dùng pha loãng 100 lần, dung dịch albumin 0,1 mg/ml Dung dịch thuốc thửBradford: Lấy 0,002 g phẩm màu Coomassie Briliant Blue hòa tan 4,7 g ethanol 99%, sau đóbổsung 8,5 g phosphoric acid 85% vàchỉnh đến 100 ml nước cất Tiến hành thí nghiệm: Chuẩn bị dãy ống nghiệm với hóa chất theo bảng sau: Ố ng nghiệm số Nồng độalbumin (µg/ml) Dung dịch albumin 0,1 (mg/ml) Nước cất (ml) 0 0,0 1,0 10 0,1 0,9 20 0,2 0,8 30 0,3 0,7 40 0,4 0,6 50 0,5 0,5 Tiến hành lôthí nghiệm, lô6 ống nghiệm đánh sốtheo thứtự: Thí nghiệm Thí nghiệm 0a 0b 1a 1b 2a 2b 3a 3b 4a 4b 5a 5b Sửdụng đồng hồbấm giây, canh thời gian phút Cho ml dung dịch thuốc thửBradford vào ống nghiệm 0a Lắc đều, đểyên Ởthời điểm phút, cho ml dung dịch thuốc thửvào ống nghiệm 0b Lắc vàđểyên Thực bổsung ml dung dịch thuốc thửlần lượt vào ống 1a, 1b, …5a, 5b ởcác thời điểm cách phút Đến thời điểm 11 phút, cho ml thuốc thửvào ống 5b Lắc đều, đểyên Tính thời gian ống 0a 20 phút, tiến hành đo độhấp thu dung dịch ởbước sóng 595 nm (OD595 nm) Tính thời gian ống 0b 21 phút, tiến hành đo OD595 nm Tuần tự tiến hành đo OD595 nm ống lại thời điểm cách phút Đến thời điểm 31 phút tiến hành đo cho ống 5b Lấy giátrị trung bình hai ống a vàb 75 Lấy OD595 nm ống thửthật (cóprotein) trừđi OD595 nm ống thửkhông (không cóprotein) ta ∆OD595 Vẽ đường tuyến tính nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang ∆OD595 Việc đo mẫu tiến hành tương tự với thời gian phản ứng là20 phút Mẫu đo với thểtích cho OD595 nm nằm khoảng OD595 nm đường chuẩn Từlượng protein tính dung dịch đem đo, suy tổng lượng protein cótrong 100 g mẫu nguyên liệu ban đầu Tính kết : mg protein = a.10-3.n.V với a: nồng độprotein mẫu suy từđường chuẩn (µg/ml); n: hệsố pha loãng; V: thểtích dịch chiết từ100 g nguyên liệu ban đầu (ml) 76 PHỤLỤC 9: QUI TRÌNH THỰC HIỆ N PHƯƠNG PHÁ P ANSON CẢ I TIẾ N [13] Chuẩn bị hó a chất: Thuốc thửFolin, Na2CO3 6%, HCl 0,2 N, TCA 5%, dung dịch casein 1% đệm phosphate pH 8, dung dịch chứa enzyme protease, dung dịch tyrosin chuẩn 1µmol Tiến hành thí nghiệm: Xây dựng đường chuẩn tyrosin: Chuẩn bị8 ống nghiệm sau: Ố ng nghiệm Dd Tyrosine 1µmol/ml (ml) 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,5 HCl 0,2N (ml) 4,9 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 3,5 Nồng độTyrosine (µmol/ml) 0,02 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,30 Laáy 1ml nồng độtrên cho vào ống nghiệm vàcho thêm ống 5ml Na 2CO3 6% và1ml thuốc thửFolin, lắc Giữhỗn hợp phản ứng 20 phút, sau đóđo mật độquang hỗn hợp dung dịch ởbước sóng 660nm Biểu diễn biến thiên mật độ quang (OD) theo nồng độ tyrosine µmol/ml Xác định lượng tyrosine tương ứng với lượng sản phẩm proteolytic tạo thành: Đối vớ i ống thí nghiệm: Cho vào ống nghiệm 2ml chất Đặt vào bểổn nhiệt ở37oC Sau 10 phút thêm vào 2ml dung dịch enzyme (cũng ở37oC), lắc trộn để10 phút ở37oC Cho vào ống nghiệm 4ml dung dịch TCA Lắc trộn nhanh đểprotein dư hợp chất cao phân tửkhác kết tủa, giữống nghiệm ở37oC thêm 20 phút lọc lấy dịch Lấy 1ml dịch và5ml Na2CO3 6%, trộn vàthêm 1ml thuốc thử Folin Sau 20 phút phản ứng, dung dịch cómàu xanh đậm Đo mật độquang bước sóng 660nm 77 Đối vớ i ống kiểm tra (tiến hành song song vớ i ống thí nghiệm): Lấy 2ml dung dịch enzyme ở37oC, thêm 4ml dung dịch TCA Tiến hành phản ứng 10 phút ở37oC Tiếp tục cho thêm 2ml dung dịch chất vàgiữ20 phút ở37 oC Sau đótiến hành tương tựnhư ống thí nghiệm Lấy hiệu sốOD ống thí nghiệm vàống kiểm tra Dựa vào đường chuẩn tyrosine xác định lượng tyrosine tương ứng Tính kết : Hoaùt ủoọprotease = àM ì V ì L (UI) t×v V: tổng thểtích hỗn hợp sau kết tủa với TCA, ml v: thểtích lọc đem phân tích, ml t: thời gian thủy phân, phút L: độpha loãng mẫu µM: lượng tyrosine (µmol) tương ứng với ml dịch enzyme (suy từđường chuẩn) 78 PHỤLỤC 10: CÁ C ĐƯỜ NG CHUẨ N SỬDỤNG CHO CÁ C PHƯƠNG PHÁ P BRADFORD VÀANSON CẢ I TIẾ N Nồng độalbumin (µg/ml) OD595nm 10 20 30 40 50 0,000 0,017 0,037 0,065 0,093 0,103 y = 0.0021x 0.12 OD 595nm 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 10 20 30 40 50 60 Nồng độalbumin (µg/ml) Đường chuẩn Albumin (sửdụng cho phương phá p Bradford) Nồng độtyrosine (µmol/ml) 0,000 0,020 0,040 0,080 0,120 0,160 0,200 0,300 OD660nm 0,000 0,033 0,068 0,124 0,194 0,260 0,319 0,478 y = 1.5995x 0.600 OD 660nm 0.500 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 Nồng độtyrosine (µmol/ml) Đường chuẩn tyrosine (sửdụng cho phương phá p Anson i tiến) TÓ M TẮ T LÝLỊCH Họvàtên: LÊHỮ U Ý Phái: Nam Ngày tháng năm sinh: 12/05/1980 Nơi sinh: t nh Sông Bé Nguyên quán: xãAn Điền, huyện Bến Cát, tỉnh Sông Bé Dân tộc: Kinh Tôn giáo: Không Địa chỉthường trú: 33/3 tổ3, khu 1, ấp Chánh Lộc, xãChánh Mỹ, thị xãThủ Dầu Một, t nh Bình Dương QUÁTRÌNH ĐÀ O TẠO Đại học: Chếđộhọc: quy Thời gian học: từ09/1998 đến 01/2004 Nơi học: trường Đại học Bách Khoa Tp HồChí Minh Đềtài Luận văn tốt nghiệp: Thiết kếNhàmáy sản xuất xúc xích, thịt nguội Ngày vànơi bảo vệLuận văn tốt nghiệp: tháng 01/2003 trường Đại học Bách Khoa TP HồChí Minh Người hướng dẫn: KS ĐINH TRẦ N NHẬ T THU Sau đại học: Chếđộhọc: quy Thời gian học: từ09/2004 đến 08/2006 Nơi học: trường Đại học Bách Khoa Tp HồChí Minh Đề tài Luận văn tốt nghiệp: Thu nhận vàtinh enzym bromelin từdứa Cayenne Ngày vànơi bảo vệLuận văn tốt nghiệp: tháng 08/2006 trường Đại học Bách Khoa TP HồChí Minh Người hướng dẫn: TS HOÀ NG KIM ANH QUÁTRÌNH CÔ NG TÁ C Từ06/2003 đến 06/2004: công tác Công ty TNHH CNTP LIWAYWAY VIỆ T NAM Từ08/2004 đến 02/2006: công tác Công ty Cổphần KI DO ... thành vàphân bố enzyme bromelain bộphận qu? ?dứa Cayenne, bước đầu thu nhận chếphẩm enzyme từphếliệu công nghiệp chếbiến dứa phương pháp kết tủa , sắc kýlọc gel…, hy vọng dự án trồng vàchếbiến dứa Cayenne. .. protein vàhoạt tính chung (HTC) ởlõi, thịt quảvàv? ?dứa Queen v? ?Cayenne Bảng 4.2 So sánh khối lượng, tổng hàm lượng protein, tổng hoạt tính vàhoạt tính riêng ởlõi-vỏvàthịt qu? ?dứa Queen v? ?Cayenne. .. P THU NHẬ N ENZYME BROMELAIN 23 2.5.1 Sơ ñoà chung 23 2.5.2 Phương pháp phávỡtếbào thu enzyme 23 2.5.3 Thu nhận enzyme dựa đặc điểm hòa tan 24 2.5.4 Thu nhận enzyme