Trắc nghiệm, bài giảng pptx các môn chuyên ngành Y dược hay nhất có tại “tài liệu ngành Y dược hay nhất”; https://123doc.net/users/home/user_home.php?use_id=7046916. Slide bài giảng môn hóa phân tích ppt dành cho sinh viên chuyên ngành Y dược. Trong bộ sưu tập có trắc nghiệm kèm đáp án chi tiết các môn, giúp sinh viên tự ôn tập và học tập tốt môn hóa phân tích bậc cao đẳng đại học ngành Y dược và các ngành khác
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO High Performance Liquid Chromatography Bài giảng pptx môn ngành Y dược hay có “tài liệu ngành dược hay nhất”; https://123doc.net/users/home/user_home.php? use_id=7046916 MỤC TIÊU Trình bày cấu hình máy HPLC Trình bày thơng số đặc trưng HPLC Phân biệt kỹ thuật HPLC phạm vi áp dụng loại Đánh giá qui trình phân tích kỹ thuật HPLC DÀN BÀI Cấu hình máy HPLC Các thơng số đặc trưng HPLC Các kỹ thuật HPLC Xử lý mẫu phân tích Rửa bảo quản cột Đánh giá qui trình phân tích kỹ thuật HPLC KHÁI NIỆM VỀ HPLC Hệ HPLC Waters 600E HITACHI L-2000 HITACHI LACHROM ELITE HTA SYSTEM Năm 1967- 1968: Huber, Hulsman, Giddinngs công bố PP sắc ký lỏng có tên SK lỏng tốc độ cao (HSLC), hiệu lực cao (HELC) hay áp suất cao ngày mang tên thức HPLC HPLC hay Sắc ký lỏng hiệu cao kỹ thuật sắc ký tách hỗn hợp cột nhồi đầy hạt có kích thước ≤ 10 μm Do phải dùng bơm có áp suất cao (high pressure) ≈ 300atm để đẩy pha động (Mobile Phase) MP qua cột với tốc độ dòng khoảng vài ml/phút cho phép phân giải nhanh (High Performance) lượng mẫu nhỏ cỡ 20 μg Quá trình cho chất lỏng qua cột gọi rửa giải (ELUTION) Trong trình này, chất tan vận chuyển mơi trường phân tách dịng chất lỏng hay chất khí gọi chất rửa giải (ELUANT) Dung dịch sau qua cột có chứa chất tan gọi dung dịch rửa giải (ELUATE) ELUANT in Chất rửa giải vào COLUMN CỘT ELUATE out Dung dịch rửa giải Pha tĩnh tác động lên chất tan bằng: - Cơ chế hấp phụ trường hợp oxyt nhôm hoạt hố, silicagel, nhựa trao đổi ion - Cơ chế phân bố pha tĩnh pha động trường hợp chất lỏng tẩm hay phủ lên bề mặt chất mang pha tĩnh - Trong thực tế hai chế tác động lên trình phân tách Để tiến hành có kết tốt HPLC điều quan trọng phải hiểu thấu đáo chất thành phần hệ sắc ký gồm : Chất tan ( chất cần phân tích), pha tĩnh pha động Trong trình tách riêng chất tan, lực tương tác phân tử tham gia vào việc thiết lập cân ba thành phần Lực tương tác phân tử mơ tả cách định tính độ phân cực tương đối ba thành phần Chất cần phân tích có độ phân cực tăng lên theo nhóm chức: Hydrocarbon < ether < ester < Cetone < aldhehyde < amide < amine < Alcohol< H2O CÁC THÀNH PHẦN CƠ BẢN CỦA HPLC 2.1 BÌNH CHỨA DUNG MƠI PHA ĐỘNG - Dùng loại thủy tinh trung tính, rửa tích từ 100ml lít - Dùng bình thủy tinh màu chứa chất nhạy cảm với ánh sáng - Dùng nắp đậy thích hợp để tránh bay dung mơi - Bình gắn với ống polytetrafluoroetylen (d=1-3mm) để dẫn pha động từ bình chứa đến bơm Xử lý dung mơi động Lọc qua màng lọc thích hợp tùy theo loại dung môi Dung môi nước: cellulose nitrat hay cellulose acetat KT 0,45 0,22µ Hỗn hợp dung mơi hữu nước: RC (regenerated cenlulose) hay polyamid nylon Dung môi hữu cơ: lọc qua màng lọc teflon Đầu lọc dung mơi: Thường có kích thước 10µm cần phải thường xuyên làm vệ sinh (ngâm dung dịch acid nitric 5% methanol+ đánh siêu âm khoảng 15’, rửa lại nước cất lọc qua màng lọc 0,45µm Đuổi khí dung mơi Lọc áp suất giảm Đuổi khí dung mơi siêu âm (Ultrasonic) Đuổi khí dung mơi sạc khí helium Nước rửa cột HPLC: nước cất hai lần, phải lọc qua màng lọc 0,45µm đánh siêu âm để đuổi khí hồ tan hay khí dạng treo (sức kháng trở 18MΩ) 4.1.2.2 Điều kiện thực nghiệm HPLC 4.1.2.3 Tối ưu hóa pha động RP-HPLC MẪU “DỄ” ACN/H2O → k’ theo %ACN → % ACN cho Rs > 1,5 MẪU “TRUNG BÌNH” MeOH/H2O → k’ theo %MeOH → % MeOH cho Rs > 1,5 THF/H2O → k’ theo %THF → % THF cho Rs > 1,5 MeOH MẪU “KHÓ” Xác định k’ lần chảy thăm dò theo tam giác ACN H2O THF Sắc ký đồ tách steroid Cột: Zorbax C8 (15x0,46cm) Pha động: 49%MeOH/H2O; 30%ACN/H2O 22%THF/H2O Pha Pha động Pha động Pha ñoäng ñoäng 1 1 1 1 Saéc ký đồ tách steroid Cột: Zorbax C8 (15x0,46cm) Pha động: 11%ACN, 12%THF, H2O 4.1.2.4 Đánh giá qui trình phân tích Kiểm tra tính thích hợp ( tương thích) hệ tho Mục đích: xác định độ phân giải độ lặp lại hệ thống phân tích sắc ký thích hợp với phương pháp phân tích thực - Tính tương thích qui trình phân tích xác định giá trị độ lặp lại thông số kỹ thuật hệ thống tiến hành thực qui trình mẫu đối chiếu mẫu thử với lần tiêm mẫu liên tiếp - Các thông số sắc ký: thời gian lưu, diện tích đỉnh, chiều cao đỉnh, độ phân giải, hệ số bất đối, số đóa lý thuyết, hệ số dung lượng, hệ số chọn lọc * Giá trị trung bình lệch chuẩn tương đối n X = ∑ Xi i =1 n SD = Độ lệch chuẩn ∑(X n i =1 i −X ( n − 1) ) Độ SD RSD = × 100 X Yêu cầu: qui trình đạt tính tương thích hệ thống thông số sắc ký hai mẫu mẫu đối chiếu mẫu thử có RSD ≤ 2% Nevirapin Lamivudin Stavudin Nevirapin Lamivudin Stavudin Sắc ký đồ mẫu chuẩn điều kiện Sắc ký đồ mẫu huyết tương chứa chất chuẩn điều kiện Sắc ký đồ mẫu huyết tương chứa chất chuẩn điều kiện Sắc ký đồ mẫu chuẩn điều kiện Sắc ký đồ mẫu thử (chế phẩm Emri) điều kiện Sắc ký đồ mẫu HT chứa chất chuẩn điều kiện VD: Các thông số sắc ký ứng với mẫu thử QT định lươ Lần thử Thời gian lưu Diện tích đỉnh Hệ số dung lượng Hệ số bất đối Số đóa lý thuyết 2,550 372.481 0,82 1,45 1.772 2,547 372.065 0,82 1,40 1.864 2,539 371.267 0,81 1,40 1.925 2,535 372.158 0,81 1,40 1.939 2,540 372.852 0,81 1,38 1.997 2,523 374.335 0,80 1,37 1.992 2,539 372.526 0,81 1,40 1.915 SD 0,01 1.030 0,008 0,028 0,085 RSD 0,38% 0,28% 0,93% 1,97% 0,004% X tb Nhaän xét: RSD < 2% Qui trình đạt tính tương thích hệ thống để định lượng c 5.1 Đánh giá peak phương pháp định lư So sánh trực tiếp (chuẩn ngoại điểm) Xây dựng đường chuẩn (chuẩn ngoại nhiều điểm) Chuẩn nội Thêm chuẩn ỨNG DỤNG HPLC TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐ Nguyên tắc chung: dựa so sánh chiều cao đỉnh diện tích đỉnh mẫu thử với hay nhiều mẫu chuẩn Ta có phương pháp định lượng sau: 5.1 So sánh trực tiếp (chuẩn ngoại điểm) Phân tích chiều cao đỉnh: hx thử hT DT P Cx = xCo caoHàmlượng ho: Chiều đỉnh chuẩn, h : xChiều cao hoạtchất ( mg ) = x xaxC % đỉnh x ho hc DC m Phân tích diện tích đỉnh: ST S T DT P xCc Hàmlượng hoạtchất (mg) = x x xaxC% S C S c SDC: Diện m Diện tích đỉnh chuẩn, tích CT = So: thử x đỉnh 5.2 Định lượng PP xây dựng đường cong - Pha loạt dd chuẩn có nồng độ khác tiêm mẫu chuẩn vào máy đỉnh tương ứng - Xây dựng đường cong chuẩn độ diện tích đỉnh theo lượng nồng độ 5.3 Định PP chuẩn nội Dựa vào đườg chuẩn suy nồng Dùng chấtcong chuẩn thứđộ hai thêm vào chất độ CT biết ST mẫu thử chuẩn ngoại - Trong điều kiện chất chuẩn nội có TR gần với TR chất cần phân tích Được tách hoàn toàn có nồng độ với chất cần phân tích - PP cần xác định yếu tố hiệu chỉnh F s chất chuẩn nội chất chuẩn ngoại Giả sử: Cs: nồng độ dd chuẩn ngoại Ci: nồng độ dd chuẩn nội Hệ số hiệu F Nồng Cx mẫu thử c Ss: làchỉnh diện tích đỉnhđộ chuẩn ngoại làSdiện tích đỉnh củaS x SSi:xC C x = C i.F s F s = chuaån nội Si S sxCi i 5.4 Định lượng phương pháp thêm - Thêm lượng xác định chất chuẩn vào - Nồng độ Cx mẫu thử có Sx - Thêm ∆C vào làm tăng ∆S - PP áp dụng có ảnh hưởng ∆C Cx = Sx ∆S Coät C18 Coät phenyl Coät cyano Aûnh hưởng việc thay đổi cột sắc ký việc phân tích số dược phẩm A cortison; B dexamethason; C corticosteron; D orthonitrophenol; E flourobenzen Bước sóng phát hiện: 254 nm ... bố PP sắc ký lỏng có tên SK lỏng tốc độ cao (HSLC), hiệu lực cao (HELC) hay áp suất cao ngày mang tên thức HPLC HPLC hay Sắc ký lỏng hiệu cao kỹ thuật sắc ký tách hỗn hợp cột nhồi đầy hạt có kích... SẮC KÝ 3.3.1 TIỀN CỘT (PRE-COLUMN, GUARD COLUMN, SCAVENGER C) - Hấp phụ, giữ lại tiểu phân tạp kích thước nhỏ gây nghẹt hay phá hủy cột sắc ký nhằm kéo dài tuổi thọ cột - Trong sắc ký lỏng- lỏng, ... giản, hiệu lực cao Hạn chế thể tích cột Khuyết điểm: Độ lặp lại không cao Tắt kim Ngưng dòng chảy Kiểu van loop Hay sử dụng Thể tích thay đổi: – 100 µl Dùng áp suất cao tự động hóa