Luận văn dược sĩ (HOÀN CHỈNH) nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

ĐẶT VẤN ĐỀ Vitamin nhóm chất thiết yếu sống mà thể người tự tổng hợp tổng hợp lượng không đủ đáp ứng với nhu cầu Các vitamin cần phải cung cấp từ nguồn ngoại sinh Vì phối hợp vitamin nhằm cung cấp số vitamin cần thiết cho nhu cầu sinh lý bệnh lý thiếu thể trở thành cách sử dụng thuốc quen thuộc Hiện thị trường, có số lượng lớn đa dạng phong phú chế phẩm hỗn hợp vitamin (multivitamin) Việc đảm bảo chất lượng nhóm chất trở thành nhu cầu cấp thiết Việc phân tích vitamin tan dầu nước thực thành công sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Tuy nhiên vitamin D việc phân tích vấn đề khó khăn Vitamin D có hoạt lực sinh học mạnh nên có hàm lượng nhỏ, mức tạp so với vitamin khác chế phẩm hỗn hợp Ở nồng độ phân tích vitamin D hàm lượng tá dược tạp phân huỷ vitamin khác nhiều tương đương với vitamin D Thực tế định lượng chế phẩm vitamin D đơn có hàm lượng cao cịn với chế phẩm hỗn hợp với hàm lượng vitamin D thấp định tính Vì để định lượng chế phẩm hỗn hợp với hàm lượng thấp đòi hỏi phải có giai đoạn xử lý đặc biệt để làm làm giàu mẫu Trong luận văn đề cập đến việc ứng dụng kỹ thuật chiết pha rắn (solid phase extraction) để làm làm giàu mẫu trước tiến hành định lượng phương pháp HPLC Syro Patarvit ví dụ phối hợp vitamin tan dầu với vitamin tan nước dạng bào chế syro thuốc Công thức cho ml : Vitamin B1 2mg Vitamin B2 1mg Vitamin B6 1mg Nicotinamid 5mg Vitamin A 1.000 UI Vitamin D3 200UI Lysine 100mg Trong tiêu chuẩn sở sản phẩm quy định định tính khơng định lượng vitamin D Vì tiến hành đề tài "Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin D syro thuốc Patarvit sắc ký lỏng hiệu cao" với mục tiêu sau: • Nghiên cứu kỹ thuật chiết pha rắn để làm làm giàu vitamin D syro thuốc • Xây dựng quy trình HPLC để định lượng vitamin D • Áp dụng định lượng vitamin D syro thuốc Patarvit PHẦN TỔNG QUAN 1.1 VITAMIN D [1, 2, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 16 ] 1.1.1 Công thức cấu tạo - Vitamin D2 C27H44O (M= 384,6) Tên khoa học : ergocalciferol - Vitamin D3 C27H44O (M= 384,6) Tên khoa học : Cholecalciferol 1.1.2 Nguồn gốc Vitamin D có chủ yếu thức ăn từ động vật trứng, sữa, thịt … Trong thể vitamin D tổng hợp tế bào da nhờ ánh sáng tử ngoại Vitamin D cịn có nguồn gốc tổng hợp 1.1.3 Tính chất Tinh thể hình kim, khơng màu, khơng mùi, khơng tan nước, dễ tan dung môi hữu ethanol, cloroform, ether chất béo Không bền với nhiệt độ, khơng khí, ánh sáng 1.1.4 Tác dụng dược lý chế tác dụng Tham gia vào trình tạo xương: làm tăng hấp thu calci phosphat ruột, tăng tái hấp thu calci ống lượn gần, tham gia vào q trình calci hố sụn tăng trưởng Vì vitamin D cần thiết cho phát triển bình thường trẻ em Điều hồ nồng độ calci máu: Nếu trình không cung cấp đủ calci, làm nồng độ calci máu giảm vitamin D (kết hợp với hormon tuyến cận giáp) huy động calci từ xương Ngoài vitamin D cịn tham gia biệt hố tế bào biểu mô gần nghiên cứu tác dụng ức chế tăng sinh tế bào ung thư Vì thiếu vitamin D, ruột không hấp thu đủ calci phospho làm giảm calci huyết, calci bị huy động từ xương nên hậu trẻ em chậm lớn, cịi xương, chậm biết đi, chậm kín thóp Người lớn bị loãng xương, xốp xương 1.1.5 Chỉ định Phòng điều trị còi xương thiếu vitamin D Phịng điều trị lỗng xương, dễ gãy xương Chống co giật suy tuyến cận giáp Hạ calci huyết Một số bệnh ngồi da chứng xơ cứng bì 1.1.6 Vitamin D chế phẩm multivitamin Vitamin D thường phối hợp với vitamin tan dầu vitamin tan nước Một số chế phẩm phối hợp liệt kê bảng 1.1 Bảng 1.1: Một số chế phẩm phối hợp vitamin D Tên sản Dạng bào phẩm Enpovid chế Nang mềm Vitamin A-D Nang mềm Thành phần Hàm lượng Nhà sản A, D D (U.I) 400 xuất Cty TNHH 500 SPM XNLHD Hậu A, D Giang Hydrosol Hỗn dịch A, D, B1, B2, E, B6, PP, B5 B1, B2, B6, Patarvit Homtamin 500 UI/ml Roche 40 UI/ml Syro PP, A, D, Patar Lab Viên nang B12 A, D, B1, B2 LTD Hàn Quốc 400 UI mềm 1.1.7 Các phương pháp định lượng vitamin D - Phương pháp hóa học [2, 7, 12, 13] + Nguyên tắc: Vitamin D tạo màu vàng với thuốc thử antimon clorid Đem đo quang 500 550nm, tiến hành song song với mẫu chuẩn + Nhận xét: Quy trình thực phức tạp, bao gồm giai đoạn xà phịng hóa điều kiện tránh oxi hóa, chiết tách tinh chế qua cột sắc ký bán điều chế sử dụng chất nhồi đất tẩy màu dùng cho sắc ký đất silic dùng cho sắc ký, sau tạo màu đo quang Do tiến hành qua nhiều giai đoạn nên làm giảm độ xác - Phương pháp sinh học [2, 7, 12, 13] + Nguyên tắc: Hoạt lực vitamin D đánh giá thông qua xác định mức độ vơi hóa xương thỏ chuột + Nhận xét: Phương pháp tiến hành phức tạp Kết phụ thuộc nhiều vào cá thể đòi hỏi người thử nghiệm phải đào tạo kỹ lưỡng - Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao [1, 2, 7, 11, 12, 16] + Nguyên tắc: Dựa phân bố khác vitamin D pha động pha tĩnh so với thành phần hoạt chất khác + Nhận xét: Đây phương pháp đại, ngày áp dụng phổ biến Tuy nhiên áp dụng trực tiếp với chế phẩm đơn đa thành phần vitamin D có hàm lượng cao (>500 UI/1 đơn vị phân liều) cịn với chế phẩm có hàm lượng D thấp địi hỏi phải có biện pháp xử lý mẫu phù hợp để làm làm giàu mẫu 1.2 KỸ THUẬT CHIẾT PHA RẮN [5, 14, 15] Đây kỹ thuật chiết ứng dụng ngày nhiều Ngày nay, thực hành phân tích, dần thay phương pháp chiết lỏng-lỏng cổ điển Phương pháp chiết pha rắn sử dụng cột nhồi chất rắn khác nhau, có chế tương tác chất phân tích với dung mơi pha rắn giống sắc ký lỏng Do chế chiết tách mà chất pha rắn sử dụng giống pha tĩnh sắc ký lỏng 1.2.1 Phân loại kiểu chiết - Kiểu hấp phụ: Không cần pha liên kết mà sử dụng nhóm chức bề mặt nguyên liệu hấp phụ Về bản, sử dụng điều kiện sắc ký pha thuận Chất hấp phụ hay dùng silicagel, magnesi silicat, nhôm oxyd - Kiểu phân bố pha liên kết: Bề mặt chất hấp phụ thay đổi, gắn thêm nhóm chức hố học đóng vai trị kiểu tương tác phân bố, bao gồm kiểu điều kiện sắc ký sau: • Pha thuận: pha tĩnh phân cực giữ lại chất phân cực cho phép chất không phân cực qua cột Thông thường kiểu sử dụng dung môi khơng phân cực • Pha đảo: pha tĩnh không phân cực, kiểu ngược lại kiểu pha thuận • Pha đảo tạo cặp ion: pha tĩnh không phân cực, mẫu phân cực có chứa phân tử cần phân tích dạng ion kết hợp với ion trái dấu thêm vào mẫu, trở thành phân tử trung hoà lưu giữ lại cột rửa giải theo chế pha đảo • Trao đổi ion: bề mặt chất hấp phụ thay đổi, gắn với nhóm chức ion hố Cơ chế tách chiết kỹ thuật giống sắc ký trao đổi ion Các nhóm chức gồm nhóm trao đổi anion mạnh yếu nhóm trao đổi cation mạnh yếu 1.2.2 Thực hành chiết, làm làm giàu mẫu qua bước • Bước 1: Chọn loại cột pha rắn Có thể sử dụng cột 1ml, 2ml 5ml phụ thuộc vào: thể tích mẫu, mức độ tạp chất, tính phức tạp mẫu, lượng chất phân tích quan tâm, tính chất dung mơi mẫu tính chất tương tác chất phân tích với pha rắn • Bước 2: Luyện cột Luyện cột nhằm hoạt hoá cột chuẩn bị tiếp nhận mẫu cần chiết loại số tạp chất cột Thông thường sau luyện cột phải rửa tiếp cột dung môi giống dung môi dùng để chuẩn bị mẫu • Bước 3: Chuyển mẫu vào cột chiết Chuyển xác lượng mẫu cần chiết vào cột, sử dụng pipet micropipet Cần lưu ý, để tránh tắc cột, cần phải ly tâm lọc mẫu trước chiết Sau chuyển toàn mẫu, sử dụng máy hút chân khơng áp lực đẩy • Bước 4: Rửa Nếu hợp chất cần quan tâm lưu cột, rửa để loại bỏ chất không mong muốn, tạp chất không lưu cột dung dịch dùng để chuẩn bị mẫu dung dịch khác mà khơng rửa giải hợp chất cần quan tâm • Bước 5: Rửa giải hợp chất cần thiết Sử dụng lượng nhỏ thể tích dung mơi hữu mà rửa giải hay chiết hợp chất quan tâm để lại tạp chất khơng loại q trình rửa Dịch rửa giải thu hồi để tiếp tục phân tích 1.2.3 Ưu nhược điểm ứng dụng chiết pha rắn Chiết pha rắn phương pháp chiết thuận tiện, khơng đắt, tiết kiệm thời gian thay cho chiết lỏng-lỏng Kỹ thuật dùng để làm làm giàu mẫu phân tích Thêm vào đó, giảm đáng kể lượng dung mơi hữu sử dụng Hình 1.1: Sơ đồ miêu tả kỹ thuật chiết pha rắn phân tích 1.3 KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO [3, 4, 6, 16] 1.3.1 Khái niệm - Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phương pháp tách hoá lý dựa vào lực khác chất khác với hai pha tiếp xúc không đồng tan với nhau, pha động pha tĩnh Pha động chất lỏng chảy qua cột với tốc độ định pha tĩnh chứa cột chất rắn phân chia dạng tiểu phân chất lỏng phủ lên chất mang rắn hay chất mang biến đổi liên kết hố học với nhóm hữu Quá trình sắc ký xẩy chế : hấp phụ, phân bố, trao đổi ion rây phân tử - Nguyên tắc trình sắc ký cột: Pha tĩnh yếu tố quan trọng định chất trình sắc ký loại sắc ký Nếu pha tĩnh chất hấp phụ ta có sắc ký hấp phụ, pha tĩnh chất trao đổi ion ta có sắc ký trao đổi ion, pha tĩnh chất gắn pha liên kết ta có sắc ký phân bố, pha tĩnh gel ta có sắc ký gel hay sắc ký rây phân tử Quyết định hiệu tách tổng hợp tương tác: ChÊt ph©n tÝch (A+ B+C) F2 F1 Pha tÜnh Pha ®éng F3 Tổng tương tác định chất rửa giải trước tiên lực lưu giữ nhỏ ngược lại 1.3.2 Các đại lượng đặc trưng • Thời gian lưu thể tích lưu Thời gian lưu chất thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến chất khỏi cột đạt giá trị cực đại cho pic sắc ký đồ: Bảng 2.6: Kết khảo sát hiệu suất chiết Mẫu chuẩn Lần Mẫu thử Diện tích pic Hiệu suất Nồng độ: 100 UI/ml 132,1 97,7% Diện tích pic: 135,15 131,4 97,0% TB 129,8 96,8% 97,2% 2.2.3 Lựa chọn điều kiện sắc ký - Viamin D chất không phân cực, qua tham khảo số tài liệu chọn kiểu sắc ký pha đảo - Lựa chọn pha động: qua tham khảo tài liệu thực nghiệm lựa chọn pha động methanol- ethyl acetat- nước tỷ lệ (90: 7: 3) - Lựa chọn cột : loại cột pha đảo, chọn cột C18-loại cột dùng phổ biến nước ta - Lựa chọn bước sóng: chúng tơi lựa chọn bước sóng 265 nm cực đại hấp thu vitamin D - Lựa chọn tốc độ dòng: qua khảo sát chúng tơi lựa chọn tốc độ dịng: 1,5 ml/phút phù hợp để thu pic có thời gian lưu vừa phải Tóm lại: Sau q trình thực nghiệm, lựa chọn điều kiện sắc ký để định lượng vitamin D sau: - Máy sắc ký lỏng hiệu cao - Cột Lichrosorb RP18 (250x4 mm; 10µm) - Detector UV đặt bước sóng 265 nm - Pha động: methanol- ethyl acetat- nước (90: 7: 3) - Tốc độ dòng 1,5 ml/phút - Thể tích mẫu tiêm: 20µm - Nhiệt độ phịng 2.2.4 Khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký Khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký cách sử dụng dung dịch chuẩn, tiến hành tiêm lặp lại lần Kết luận tính thích hợp hệ thống sắc ký dựa giá trị sai số tương đối thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết độ cân xứng píc - Pha dung dịch chuẩn: Cân xác khoảng 10 mg dầu vitamin D (1.000.000 UI/g) cho vào bình định mức 50 ml, hồ tan methanol vừa đến vạch Hút xác ml dung dịch cho vào bình định mức 10 ml thêm methanol đến vạch Ta dung dịch chuẩn có nồng độ 100 UI/ml Lọc qua màng lọc 0,45 µm Tiến hành tiêm sắc ký lặp lại lần dung dịch chuẩn điều kiện chọn, ghi lại giá trị thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết, hệ số đối xứng Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống trình bày bảng 2.5, 2.6, 2.7 Bảng 2.5: Giá trị trung bình số đại lượng đặc trưng Số đĩa lý thuyết 2870 Hệ số cân xứng 0,81 Bảng 2.6: Giá trị thời gian lưu vitamin D Lần tiêm Thời gian lưu Số liệu thống kê (phút) 4,873 4,864 4,798 4,832 4,784 4,855 x= 4,802 S= 0,027 ε% = 0,39% n=6 =0,05 Bảng 2.7: Diện tích pic vitamin D Lần tiêm Diện tích pic 135,6 Số liệu thống kê x= 136,417 137,1 S= 0,699 136,8 ε% = 0,53% 135,8 n=6 136,0 =0,05 137,2 Nhận xét: Từ kết cho thấy: - Sai số tương đối giá trị thời gian lưu diện tích pic nhỏ Giá trị đại lượng đặc trưng số đĩa lý thuyết, hệ số cân xứng giới hạn cho phép Điều chứng tỏ hệ thống có tính thích hợp cao 2.2.5 Khảo sát độ tuyến tính phương pháp Chúng tơi tiến hành khảo sát phụ thuộc tuyến tính nồng độ với diện tích pic vitamin D chuẩn vitamin D Pha dãy dung dịch chuẩn vitamin D có nồng độ biến thiên từ: 40-240 UI/ml Tiến hành: Cân xác khoảng 0,1g dầu vitamin D (1000.000 UI/g) cho vào bình định mức 50 ml, hồ tan methanol đến vạch ta dung dịch chuẩn gốc nồng độ 2000 UI/ml Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng methanol để dung dịch chuẩn có nồng độ vitamin D từ 40-240 UI/ml Tiến hành chạy sắc ký dung dịch điều kiện sắc ký chọn Kết khảo sát độ tuyến tính vitamin D trình bày bảng 2.8 Bảng 2.8:Kết khảo sát độ tuyến tính nồng độ diện tích pic vitamin D Nồng độ vitamin D Diện tích pic (UI/ml) 40 Khoảng nồng độ khảo sát: 52,8 80 108,7 120 162,2 160 216,5 240 325,1 40 – 240 UI Phương trình hồi quy: y = 1,359x - 0.8982 Hệ số tương quan: r = 0.9996 The linked image cannot be displayed The file may have been moved, renamed, or deleted Verify that the link points to the correct file and location Hình 2.6: Đồ thị biểu diễn phụ thuộc tuyến tính nồng độ diện tích píc vitamin D - Nhận xét: Trong khoảng biến thiên nồng độ từ 40-240 UI/ml, diện tích pic thu sắc ký đồ tỷ lệ thuận với nồng độ vitamin D với hệ số tương quan gần (0,9996) chứng tỏ tương quan tuyến tính chặt chẽ nồng độ diện tích pic 2.2.5 Định lượng vitamin D syro Patarvit ♦Mẫu chuẩn: Cân xác khoảng 10 mg dầu vitamin D (1000.000 UI/g) cho vào bình định mức 50 ml Hồ tan methanol vừa đến vạch Hút xác ml cho vào bình định mức 10 ml pha lỗng methanol vừa đến vạch ta dung dịch chuẩn nồng độ 100 U.I/ml ♦Mẫu thử: - Hút xác ml syro, pha loãng với ml methanol ml nước Cho tất qua cột SPE C18 (200 mg x ml) áp suất hút chân khơng - Chiết theo quy trình đưa ta ml dịch rửa giải - Thổi khí nitơ để bốc dung mơi nhiệt độ 40-60 OC Vì dịch rửa giải cịn it nước nên gần cạn thêm ml aceton tiếp tục bốc hoàn toàn - Hoà tan cắn 0,5 ml methanol ta mẫu thử làm làm giàu lần so với ban đầu Chuẩn bị cho hệ thống sắc ký chạy ổn định với pha động khoảng 30 phút Tiêm mẫu thử mẫu chuẩn vào hệ thống sắc ký tiến hành sắc ký điều kiện chọn Hàm lượng vitamin D syro đựơc tính tốn dựa vào diện tích pic mẫu chuẩn mẫu thử theo công thức: H= St.Cc Sc.4 Trong đó: H : Hàm lượng vitamin D (UI/ml) Sc : Diện tích pic dung dịch chuẩn St : Diện tích pic dung dịch thử Cc : Nồng độ dung dịch chuẩn (UI/ml) Làm lần để lấy giá trị trung bình Bảng 2.8 Kết định lượng syro Patarvit Mẫu chuẩn Mẫu thử Hàm lượng vitamin D syro Patarvit (UI/ml) Diện tích píc: Lầ S pic 135,126 n 197,117 193,224 197,612 TB 196,851 36,50 35,78 36,96 36,41 The linked image cannot be displayed The file may have been moved, renamed, or deleted Verify that the link points to the correct file and location Hình 2.7 Sắc ký đồ mẫu chuẩn vitamin D (100 UI.ml), Cột C18 (250 mm x mm, µ m), tốc độ 1,5 ml/phút The linked image cannot be displayed The file may have been moved, renamed, or deleted Verify that the link points to the correct file and location Hình 2.8 Sắc ký đồ mẫu thử- Cột C18 (250 mm x mm, µ m), tốc độ 1,5 ml/phút 2.2.6.Đánh giá độ xác - Mẫu chuẩn: tiến hành tương tự cách pha dung dịch chuẩn phần định lượng Dung dịch chuẩn có nồng độ 100 UI/ml - Mẫu thử: tiến hành tương tự phần định lượng Làm mẫu Đem tiêm sắc ký mẫu chuẩn mẫu thử điều kiện Ghi lại diện tích pic tính hàm lượng vitamin D syro theo cơng thức: H= St.Cc Sc.4 Bảng 2.9 Kết đánh giá độ xác kết phân tích ST Hàm lượng (UI/ml) Thống kê T 36,45 x=36,47 35,79 S=0,633 37,12 ε% =0,32% 37,31 n=6 35,85 =0,05 36,30 Nhận xét: Ta thấy kết phân tích có sai số tương đối nhỏ chứng tỏ phương pháp có độ xác cao 2.2.7 Đánh giá độ phương pháp thêm Thêm vào mẫu thử xác định hàm lượng lượng xác chất chuẩn cho tổng nồng độ chúng nằm khoảng tuyến tính khảo sát Độ phương pháp xác định từ tỉ lệ thu hồi chất chuẩn thu từ kết định lượng so với lượng chất chuẩn thêm vào - Dung dịch chuẩn : Tiến hành tương tự phần định lượng Dung dịch chuẩn có nồng độ 100 UI/ml - Mẫu thử: Hút xác ml syro, pha loãng với ml methanol ml nước thêm xác 0,5 ml dung dịch chuẩn Khuấy đồng cho qua cột SPE Chiết theo quy trình nêu Cơ cạn dung mơi hồ tan cắn ml methanol ta có mẫu thử Làm lần Đem tiêm sắc ký mẫu chuẩn mẫu thử điều kiện Tỉ lệ thu hồi chất chuẩn tính dựa diện tích píc hàm lượng mẫu chuẩn mẫu thử theo công thức: 3 St.Cc − 2.H Sc T= 100 50 Trong đó: T : Tỷ lệ thu hồi (%) St : Diện tích píc dung dịch thử Sc : Diện tích píc dung dịch chuẩn Cc : Nồng độ dung dịch chuẩn H : Hàm lượng vitamin D syro Patarvit Bảng 2.10: Kết đánh giá độ phương pháp thêm STT Chuẩn thêm vào Chuẩn tìm thấy Tỷ lệ thu hồi 50 48.6 (%) 97,2 50 48,8 97,6 50 47,9 95,8 50 48.5 97,0 50 48,3 96,6 50 48,7 97,4 x = 96,8 ε% = 0,63 % Nhận xét: Từ kết bảng cho ta thấy tỷ lệ tìm lại vitamin D đạt trung bình 96,8% Như phương pháp có độ cao 2.2.8 Khảo sát giới hạn phát giới hạn định lượng Tiến hành thí nghiệm với điều kiện HPLC chọn để định lượng vitamin D Tiêm dung môi pha mẫu methanol thu sắc đồ mẫu trắng (Hình 2.9), lấy độ lớn nhiễu lớn thời gian lưu vitamin D khoảng 10 phút (lấy từ đến 11 phút) có pic nhiễu lớn với diện tích khoảng 0,5 Thay giá trị Y = 0,5 vào phương trình hồi quy Y = 1,539X – 0,898 Ta tính X0 = (0,5 + 0,898)/1,539 = 2,59 UI/ml Hiệu suất chiết khảo sát 97,2 %, nên X X = 2,59/97,2x100 = 2,66 UI/ml - Giới hạn phát tính lần độ lớn nhiễu LOD = 2,66x3 = 7,99 UI/ml; - Giới hạn định lượng tính 10 lần độ lớn nhiễu LOQ = 2,66x10 = 26,6 UI/ml Sau tiến hành thí nghiệm tiếp tục: Pha dung dịch vitamin D chuẩn methanol có nồng độ giới hạn định lượng, tiến hành đo diện tích pic dung dịch lần, tính độ lặp lại RSD diện tích pic, kết sau: Bảng 2.11 Kết khảo sát giới hạn định lượng STT Diện tích pic 40,040 39,252 38,954 41,420 40,013 Giá trị thống kê độ lặp lại Tb = 39,932 RSD = 2,406 % Với nồng độ vitamin D 26,6 UI/ml, kết đo độ lặp lại chấp nhận Vì LOQ = 26.6 UI/ml giới hạn định lượng phương pháp định lượng vitamin D The linked image cannot be displayed The file may have been moved, renamed, or deleted Verify that the link points to the correct file and location Hình 2.9 Sắc ký đồ mẫu trắng 2.3 Bàn luận SPE kỹ thuật chiết có nhiều ưu điểm Ta sử dụng kỹ thuật để làm làm giàu mẫu Điều quan trọng với chất có hàm lượng nhỏ hỗn hợp đa thành phần SPE thay cho HPLC việc tinh chế chất Để tinh chế mẫu vitamin D theo quy trình ta cần 11ml methanol, 5ml acetonitril, 10 ml hexan, sử dụng chiết lỏnglỏng HPLC để tinh chế lượng dung mơi tốn nhiều Các giai đoạn tiến hành đơn giản, hoạt chất không chịu nhiều tác động nên hạn chế mát Điều quan trọng với chất không bền, dễ bị phân hủy Hơn cột SPE có giá thành khơng cao, hồi phục để dùng lại nhiều lần Để sử dụng lại cột phải lưu ý rửa thật cột sau chiết Trong mẫu syro Patarvit, sau rửă giải vitamin D cột cịn vitamin A (Hình 2.6 cho thấy thời gian lưu vitamin A lớn) Nếu ta khơng loại hồn tồn vitamin A lần chiết sau vitamin A sớm lẫn vào dịch rửa giải Hiện nay, bên cạnh dược phẩm, thực phẩm có bổ xung vitamin D xuất ngày nhiều Đó mẫu phức tạp hàm lượng vitamin D thường thấp Trong trường hợp dùng SPE để tinh chế mẫu trước phân tích The linked image cannot be displayed The file may have been moved, renamed, or deleted Verify that the link points to the correct file and location Hình 2.10: Sắc ký đồ mẫu chuẩn vitamin A (200 UI.ml), Cột C18 (250 mm x mm, µ m), tốc độ 1,5 ml/phút PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 3.1 Kết luận Trong q trình thực khố luận thu kết sau: - Biết cách tiến hành nghiên cứu hoàn thiện đề tài, biết cách tra cứu tìm hiểu tài liệu tham khảo phục vụ cho trình thực đề tài nghiên cứu khoa học - Rèn luyện tác phong phương pháp nghiên cứu khoa học - Xây dựng quy trình chiết vitamin D cho mẫu syro thuốc - Hiểu sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu cao chiết pha rắn - Biết vận hành sử dụng số thiết bị đại kiểm nghiệm thuốc - Xây dựng chương trình sắc ký để định lượng vitamin D sau: + Máy sắc ký lỏng hiệu cao + Cột Lichrosorb RP18 (250x4 mm; 10µm) + Detector UV đặt bước sóng 265 nm + Pha động: methanol- ethyl acetat- nước (90: 7: 3) + Tốc độ dịng 1,5 ml/phút + Thể tích mẫu tiêm: 20µm + Nhiệt độ phịng - Ứng dụng quy trình chiết chương trình sắc ký xây dựng để định lượng vitamin syro thuốc Patarvit 3.2.Đề xuất Sau thực khoá luận này, em xin đề xuất số ý kiến sau: - Kính mong nhà trường môn tạo điều kiện cho sinh viên tiếp cận thực hành nhiều với máy móc đại máy đo quang phổ, sắc ký lỏng hiệu cao - Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin D số dạng bào chế khác thuốc multivitamin thực phẩm có bổ xung vitamin D - Ứng dụng chiết pha rắn để tinh chế chất có hàm lượng nhỏ hỗn hợp phức tạp ... tài "Nghiên cứu ứng d? ??ng chiết pha rắn để định lượng vitamin D syro thuốc Patarvit sắc ký lỏng hiệu cao" với mục tiêu sau: • Nghiên cứu kỹ thuật chiết pha rắn để làm làm giàu vitamin D syro thuốc. .. phổ, sắc ký lỏng hiệu cao - Tiếp tục nghiên cứu ứng d? ??ng chiết pha rắn để định lượng vitamin D số d? ??ng bào chế khác thuốc multivitamin thực phẩm có bổ xung vitamin D - Ứng d? ??ng chiết pha rắn để. .. tích với dung mơi pha rắn giống sắc ký lỏng Do chế chiết tách mà chất pha rắn sử d? ??ng giống pha tĩnh sắc ký lỏng 1.2.1 Phân loại kiểu chiết - Kiểu hấp phụ: Không cần pha liên kết mà sử d? ??ng nhóm