Nghiên cứu thu nhận fucoidan từ lá rong mơ sargassum olygocystum

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VÕ THỊ HỒNG VY ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THU NHẬN FUCOIDAN TỪ LÁ RONG MƠ SARGASSUM OLYGOCYSTUM Giảng viên hướng dẫn : PGS.TS Vũ Ngọc Bội TS Đặng Xuân Cường Nha trang – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THU NHẬN FUCOIDAN TỪ LÁ RONG MƠ SARGASSUM OLYGOCYSTUM Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Vũ Ngọc Bội TS Đặng Xuân Cường Sinh viên thực : Võ Thị Hồng Vy Mã số sinh viên : 57132326 Nha trang – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình tơi nhiên cứu Các tài liệu trích dẫn theo nguồn công bố Kết nêu đề tài trung thực chưa công bố công trình TÁC GIẢ ĐỒ ÁN VÕ THỊ HỒNG VY i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án này, Trước hết em xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Thực phẩm, Lãnh đạo phòng Đào tạo Đại học biết ơn, niềm kính trọng lịng tự hào học tập năm vừa qua Sự biết ơn sâu sắc em xin giành cho thầy PGS TS Vũ Ngọc Bội Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm, cô Th.S Nguyễn Thị Mỹ Trang giảng viên môn Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Nha Trang tận tình hướng dẫn, động viên hỗ trợ kinh phí giúp đỡ em suốt q trình thực đồ án tốt nghiệp Xin cảm ơn TS Đặng Xn Cường- phịng Hóa phân tích Triển khai Cơng nghệ - Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang ThS Đặng Bửu Tùng Thiện - Trường Cao đẳng Kỹ thuật Công nghệ Nha Trang giúp đỡ tạo điều kiện cho em suốt trình thực đề tài Đặc biệt xin ghi nhớ tình cảm, giúp đỡ thầy giáo môn Công nghệ Thực phẩm, thầy cô giáo khoa Công nghệ Thực phẩm khoa khác Nhà trường tận tình dạy dỗ em suốt trình học trường Xin cảm ơn thầy cô phản biện cho em lời khun q báu để cơng trình nghiên cứu hồn thành có chất lượng Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè tạo điều kiện, động viên khích lệ tinh thần cho em vượt qua khó khăn suốt chặn đường học tập vừa qua Nha Trang, tháng 7năm 2019 Sinh viên thực Võ Thị Hồng Vy ii PHIẾU ĐÁNH GIÁ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên SV: Võ Thị Hồng Vy Lớp: 57TP3 Ngành: CÔNG NGHỆ TỰC PHẨM MSSV: 57132326 Tên đề tài: ‘’Nghiên cứu thu nhận fucoidan từ rong mơ S.oligocystum’’ Số trang: 84 Số chương: 03 Số tài liệu tham khảo: 58 Hiện vật: Quyển đề tài tốt nghiệp, đĩa CD NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Kết luận Nha Trang, ngày tháng năm 2019 Cán hướng dẫn iii MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH x LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 TÌM HIỂU VỀ LỒI RONG MƠ SARGASSUM 1.2 PHÂN LOẠI RONG MƠ SARGASSUM 1.2.1 Phân loại rong mơ Sargassum giới 1.2.2 Phân loại rong mơ Sargassum Việt Nam 1.3 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA RONG MƠ SARGASSUM 1.4 GIỚI THIỆU RONG MƠ SARGASSUM OLYGOCYSTUM 1.4.1 Hình thái phân loại 1.4.2 Một số thành phần hóa học rong mơ S oligocystum 10 1.5 TÌM HIỂU VỀ FUCOIDAN 11 1.6 CẤU TRÚC CỦA FUCOIDAN 13 1.7 TÍNH CHẤT HÓA LÝ CỦA FUCOIDAN 17 1.8 HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN 18 1.8.1 Hoạt tính chống đơng tụ máu chống huyết khối 18 1.8.2 Hoạt tính chống ung thư điều hòa miễn dịch 19 1.8.3 Fucoidan làm giảm lipid máu 20 1.8.4 Fucoidan giúp tăng cường chức gan 20 1.8.5 Hoạt tính chống virus 21 1.8.6 Hoạt tính chống oxy hóa 22 1.8.7 Chống viêm 22 1.8.8 Hoạt tính kháng khuẩn 22 1.8.9 Bảo vệ dày 23 1.8.10 Tác dụng giảm lượng đường huyết máu 23 iv 1.8.11 Bảo vệ thận 23 1.8.12 Các ứng dụng fucoidan 23 1.9 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU FUCOIDAN NGỒI NƯỚC 24 1.10 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU FUCOIDAN TRONG NƯỚC 25 1.11 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT FUCOIDAN 28 1.11.1 Cơ sở trình tách chiết 28 1.11.2 Một số phương pháp chiết 28 1.11.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết 29 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 34 2.1.1 Rong mơ S oligocystum 34 2.1.2 Các phụ gia: 34 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.2.1 Các phương pháp phân tích 34 2.2.2 Phương pháp đánh giá cảm quan 37 2.2.3 Các phương pháp phân tích vi sinh: 37 2.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 37 2.3.1 Cách tiếp cận nội dung nghiên cứu đồ án 37 2.3.2 Xác định thời gian chiết 39 2.3.3 Xác định nhiệt độ chiết 40 2.3.4 Xác định tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu 41 2.3.5 Xác định pH thích hợp 42 2.3.6 Xác định số lần chiết 43 2.4 HÓA CHẤT VÀ CÁC THIẾT BỊ ĐÃ SỬ DỤNG 44 2.4.1 Hóa chất 44 2.4.2 Thiết bị chủ yếu sử dụng 45 2.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 45 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 46 v 3.1 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP CHO Q TRÌNH CHIẾT RÚT FUCOIDAN TỪ LÁ RONG MƠ S OLIGOCYSTUM 46 3.1.1 Xác định thời gian chiết rút 46 3.1.2 Xác định nhiệt độ chiết 49 3.1.3 Xác định tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 53 3.1.4 Xác định pH dung môi chiết 56 3.1.5 Xác định số lần chiết 60 3.1.6 Đề xuất quy trình chiết rút fucoidan từ rong mơ S oligocystum thử nghiệm chiết fucoidan 63 3.1.6.1 Đề xuất quy trình chiết rút fucoidan từ rong mơ S oligocystum 63 3.1.6.2 Thử nghiệm chiết rút fucoidan từ rong mơ S oligocystum theo quy trình đề xuất đánh giá hiệu suất chiết 65 3.2 SO SÁNH ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG FUCOIDAN TINH KHIẾT CHIẾT XUẤT TỪ THÂN VÀ LÁ RONG MƠ S.OLYGOCYSTUM 65 3.3 THỬ NGHIỆM SẤY PHUN TẠO BỘT FUCOIDAN TỪ DỊCH CHIẾT LÁ RONG MƠ S.OLYGOCYSTUM 66 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 69 KẾT LUẬN 69 ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO 70 PHỤ LỤC 76 vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DM: dung môi NL: nguyên liệu TA : hoạt tính chống oxy hóa tổng RP : hoạt tính khử sắt DW : khối lượng rong khô C2 : Vị trí cacbon số FDA: Food and Drug Administration HIV: Human Immunodeficiency Virus HGF: Hepatocyte Growth Factor DNA: Acid Deoxyribo Nucleic vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Thành phần hố học (%) số lồi rong biển Bảng Thành phần hóa học số lồi rong 13 Bảng Sự phân bố trọng lượng phân tử fucoidan 17 Bảng Kết hàm lượng fucoidan thân rong mơ S oligocystum 65 Bảng Kết đánh giá tiêu lý hóa hoạt tính chống oxy bột sấy phun hợp chất sinh học tan nước từ rong mơ 66 Bảng 3 Kết đánh giá chất lượng cảm quan bột sấy phun hợp chất sinh học tan nước từ rong mơ 67 Bảng Kết kiểm tra tiêu vi sinh vật chế phẩm 67 Bảng Kết xác định hoạt tính oxy hóa dịch chiết rong mơ Sargassum oligocystum thời gian chiết khác 77 Bảng Kết xác định hoạt tính khử sắt dịch chiết rong mơ Sargassum oligocystum thời gian chiết khác 77 Bảng Kết xác định hàm lượng fucoidan dịch chiết rong mơ Sargassum oligocystum thời gian chiết khác 78 Bảng Kết xác định hoạt tính oxy hóa dịch chiết rong mơ Sargassum oligocystum nhiệt độ chiết khác 78 Bảng Kết xác định hoạt tính khử sắt dịch chiết rong mơ Sargassum oligocystum nhiệt độ chiết khác 78 Bảng Kết xác định hàm lượng fucoidan dịch chiết rong mơ Sargassum oligocystum nhiệt độ chiết khác 78 Bảng Kết xác định hoạt tính oxy hóa dịch chiết rong mơ Sargassum oligocystum tỉ lệ DM/NL khác 79 Bảng Kết xác định hoạt tính khử sắt dịch chiết rong mơ Sargassum oligocystum tỉ lệ DM/NL khác 79 Bảng Kết xác định hàm lượng fucoidan dịch chiết rong mơ Sargassum oligocystum tỉ lệ DM/NL khác 79 Bảng Kết xác định hoạt tính oxy hóa dịch chiết rong mơ Sargassum oligocystum pH khác 80 viii TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Hồ Việt Cường (2014), Nghiên cứu cấu trúc khảo sát hoạt tính sinh học fucoidan aginate từ hai loài rong nâu Sargassum henslowianun Sargassum swartzii Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Hóa học, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, Đặng Xuân Cường (2009), Nghiên cứu thu nhận dịch chiết có hoạt tính kháng khuẩn từ rong nâu Dictyota dichotoma Việt Nam, Luận văn thạc sĩ kỹ thuật, Trường Đại học Nha Trang Đặng Xuân Cường, Vũ Ngọc Bội, Trần Thị Thanh Vân (2012), “Tối ưu hóa q trình tách chiết Phlorotannin từ rong nâu (Sargassum vietnamense) thu mẫu Nha Trang - Khánh Hịa”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Thủy sản, Số 3/2012, Trường Đại học Nha Trang, Trang 83-87 Đặng Xuân Cường, Vũ Ngọc Bội, Trần Thị Thanh Vân, Đào Trọng Hiếu (2013), “Tối ưu hóa cơng đoạn chiết Phlorotannin từ rong nâu Sargassum aemulum”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nông thôn, Số 3+4/2013, Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, Trang 135-139 Nguyễn Hữu Đại (1997), Rong mơ (Sargassaceae) Việt Nam nguồn lợi sử dụng, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Thị Huyền (2012), Nghiên cứu hoàn thiện quy trình tách chiết Fucoidan từ rong Sargassum polycystum Khánh Hịa, Đồ án tốt nghiệp đại học Ngành Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nha Trang Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa (2004), Chế biến rong biển, Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội Bùi Minh Lý (2006), Nghiên cứu công nghệ thiết bị sản xuất fucoidan quy mô pilot từ số loài rong nâu Việt Nam Võ Thị Ngọc (2017), Nghiên cứu chiết rút fucoidan từ rong mơ Sargassum olygocystum thu mẫu Ninh Thuận, Đồ án tốt nghiệp đại học Ngành Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nha Trang 10 Nguyễn Duy Nhứt (2008), Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học polysacharide từ số loại rong nâu tỉnh Khánh Hòa 70 11 Phạm Đức Thịnh (2015), Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học fucoidan có hoạt tính sinh học từ số lồi rong nâu Vịnh Nha Trang, Luận án tiến sĩ Hóa học, Viện Hóa học, Hà Nội 12 Nguyễn Huyền Trang (2015), Nghiên cứu biến động sinh khối quần thể sargassum ringgoldianum tác động môi trường vùng biển Shimoda, Shizuoka, Nhật Bản, Luận án thạc sĩ, Trường Đại học Quốc gia Hà Nội 13 Nguyễn Thị Minh Tùy (2013), nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất fucoidan từ số loại rong nâu phổ biến Khánh Hòa, Luận văn thạc sĩ trường Đại học Nha Trang Tiếng Anh 14 Aisa Y., Miyakawa Y., Nakazato T (2004), "Fucoidan induces apoptosis of human HS-Sultan cells accompanied by activation of caspase-3 and down-regulation of ERK pathways", Am J Hematol, 78(1), 7–14 15 Anastyuk, S D., Imbs, T.M., Shevchenko, N.M., Dmitrenok, P.S., Zvyagintseva, T.N (2009), ‘’ ESIMS analysis of fucoidan preparations from Costaria costata’’ Chem Nat Comp., 45, 79-86 16 Anastyuk, S D., Shevchenko, N M., Nazarenko, E L., Dmitrenok, P S., and Zvyagintseva, T N (2009), ’’ Structural analysis of a fucoidan from the brown alga Fucus evanescens by MALDI-TOF and tandem ESI mass spectrometry’’ Carbohydrate Research., 344(6), 779-787 17 Anastyuk, S.D., Shevchenko, N.M., Nazarenko, E.L., Imbs, T.I., Gorbach, V.I., Dmitrenok, P.S., Zvyagintseva, T.N (2010), ’’ Structural analysis of a highly sulfated fucan from the brown alga Laminaria cichorioides by tandem MALDI and ESI mass spectrometry’’ Carbohydr Res., 345, 2206-2212 18 Anastyuk, S.D., Imbs, T.I., Dmitrenok, P.S., and Zvyagintseva, T.N (2014), ‘’Rapid Mass Spectrometric Analysis of a Novel Fucoidan, Extracted from the Brown Alga Coccophora langsdorfii’’ The ScientificWorld Journal., ID 972450, pages 19 Berteau O and Mulloy B (2003), ’’ Sulfated fucans, fresh perspectives, structures, functions, and biological properties of sulfated fucans and an overview of enzymes active toward this class of polysaccharide’’ Glycobiology., 13 (6), 29R-40R 71 20 Bilan, M.I., Grachev, A.A., Shashkov, A.S., Nifantiev, N.E., Usov, A.I (2006), ‘’Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus serratus L’’ Carbohydr Res., 341, 238-245 21 Bilan, M.I., Grachev, A.A., Ustuzhanina, N.E., Shashkov, A.S., Nifantiev, N.E.; Usov, A.I.(2004), ‘’A Highly regular fraction of a fucoidan from the brown seaweed Fucus distichus L’’.Carbohydr Res 339, 511-517 22 Bilan, M.I, Grachev A.A (2002), ‘’Ustuzhanina N.E Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus evanescens C Ag’’ Carbohydrate Research., 337, 719-730 23 Chevolot, L., Mulloy, B.; Racqueline, J (2001), ‘’A disaccharide repeat unit is the structure structure in fucoidans from two species of brown algae’’ Carbohydr Res., 330, 529-535 24 Choi, E.M., Kim, A.J., Kim, Y., Hwang, J.K (2005), ‘’Immunomodulating activity of arabinogalactan and fucoidan in vitro’’, J Med Food, 8, 446-453 25 Cumashi, A., Ushakova, N.A., Preobrazhenskaya, M.E., D'Incecco, A., Piccoli, A., Totani, L., Tinari, N., Morozevich, G.E., Berman, A.E., Bilan, M.I., Usov, A.I., Nadezhda E., Grachev, A.A., Sanderson, C.J., Kelly, M., Rabinovich, G.A., Iacobelli, S (2007),’’ A comparative study of the anti-inflammatory, anticoagulant, antiangiogenic, and antiadhesive activities of nine different fucoidans from brown seaweeds’’, Glycobiology, 17, 541-552 26 Daniel, R., Berteau, O., Chevolot, L., Varenne, A., Gareil, P and Goasdoue, N (2001), ’’ Regioselective desulfateion of sulfated L-fucopyranoside by a new sulfoesterase from the marine mollusk Pecten maximus: Application to the structural study of algal fucoidan (Ascophyllum nodosum)’’ European Journal of Biochemistry, 268, 5617-5626 27 Doh-ura, K., Kuge, T., Uomoto, M., Nishizawa, K., Kawasaki, Y., Iha, M (2007), ‘’Prophylactic effect of dietary seaweed fucoidan against enteral prion infection, Antimicrob’’ Agents Chemother, 51, 2274-2277 28 Dillon T., Kristensen, K and O'hEcoha, C (1953), ‘’ The seed mucilage of Ascophyllum nodosum’’, Proceedings of the Royal Irish Academy, Section B: Biological, Geological, and Chemical Science, 55, 189-194 72 29 Fu, X.Y., Xue, C.H., Ning, Y., Li, Z.J., Xu, J.C.(2004), ’’ Acute antihypertensive effects of fucoidan oligosaccharides prepared from Laminaria japonica on renovascular hypertensive rat’’ J Ocean Univ Qingdao, 34, 560-564 30 Hayashi, K., Nakano, T., Hashimoto, M., Kanekiyo, K.; Hayashi, T (2008), ‘’Defensive effects of a fucoidan from brown alga Undaria pinnatifida against herpes simplex virus infection’’, Int Immunopharmacol, 8(1), 109-116 31 Hemmingson, J.A., Falshaw, R., Furneaux, R.H., Thompson, K (2006),’’ Structure and antiviral activity of the galactofucan sunphates extracted from Undaria pinnatifida (Phaeophyta)’’, J Appl Phycol, 18, 185-193 32 Itsuko, K (1995), ’’ Antiulcer agent and adhesion inhibitor for Helicobacter pylori’’ Eur Pat EP0645143 33 Kawamoto, H., Miki, Y., Kimura, T., Tanaka, K., Nakagawa, T., Kawamukai, M., Matsuda, H (2006), ’’ Effects of fucoidan from Mozuku on human stomach cell lines’’ Food Sci Technol Res, 12, 218-222 34 Kawano, N., Egashira, Y., Sanada, H (2007),’’ Effect of dietary fiber in edible seaweeds on the development of D-galactosamine-induced hepatopathy in rats’’, J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo), 53, 446-450 35 Kima, M.H., Joo, H.G (2008), ‘’Immunostimulatory effects of fucoidan on bone marrowderived dendritic cells, Immunol’’ Lett, 115, 138-143 36 Kylin, H (1913), ‘’Zur biochemie der Meersalgen, Z Physiol’’ Chem, 83, 171 -197 37 Lee, J.B., Hayashi, K., Hashimoto, M., Nakano, T., Hayashi, T (2004),’’ Novel antiviral fucoidan from sporophyll of Undaria pinnatifida (Mekabu)’’, Chem Pharm Bull., 52, 1091-1094 38 Li, B., Xu, S.Y (2007), ‘’Structural investigation of oligosaccharides in partial acid hydrolyzed products of fucoidan isolated from Hizikia fusiforme’’, Nat Prod Res Dev, 19, 550-553 39 Li Bo, Fei Lu, Xinjun Wei and Ruixiang Zhao (2008), ‘’Fucoidan: Structure and Bioactivity, Molecules’’, 13, 1671-1695 73 40 Mandal, P., Mateu, C.G., Chattopadhyay, K., Pujol, C.A., Damonte, E.B., Ray, B (2007), ‘’Structural features and antiviral activity of sulphated fucans from the brown seaweed Cystoseira indica’’ Antivir, Chem Chemother, 18, 153-162 41 Marais, M.F and Joseleau, J.P (2001), ‘’A fucoidan fraction from Ascophyllum nodosum’’ Carbohydrate Research., 336, 155-159 42 Maruyamaa, H., Tamauchib, H., Iizuka, M., Nakano, T (2006), ‘’ The role of NK cells in antitumor activity of dietary fucoidan from Undaria pinnatifida Sporophylls (Mekabu)’’ Planta Med, 72, 1415-1417 43 Micheline, R.S., Cybelle, M.; Celina, G.D., Fernando, F.S., Hugo, O.R., Edda, L (2007), ‘’Antioxidant activities of sulfated polysaccharides from brown and red seaweeds’’ J Appl Phycol, 19, 153-160 44 Nishino, T., Nishioka, C., Ura, H and Nagumo (1994), ‘’T Isolation and partial characterization of a novel amino sugar-containing fucan sulfate from commercial Fucus vesiculosus fucoidan’’ Carbohydrate Research, 255, 213-224 45 Patankar, M.S., Oehninger, S., Barnett, T., Williams, R.L and Clark, G.F (1993), ’’ A revised structure for fucoidan may explain some of its biological activities’’ The Journal of Biological Chemistry, 268, 21770-21776 46 Percival, E.G.V and Ross, A.G (1950),’’ Fucoidin Part I: The isolation and purification of fucoidin from brown seaweeds’’ Journal of the Chemical Society, 717720 47 Ponce, N.M.A., Pujol, C.A., Damonte, E.B (2003), ‘’Fucoidans from the brown seaweed Adenocystis utricularis: extraction methods, antiviral activity and structural studies’’, Carbohydr Res, 338, 153-165 48 Saito, A., Yoneda, M., Yokohama, S., Okada, M., Haneda, M., Nakamura, K (2006), ’’ Fucoidan prevents concanavalin A-induced liver injury through induction of endogenous IL-10 in mice’’ Hepatol Res, 35(3), 190-198 49 Shibata, H., Kimura-Takagi, I., Nagaoka, M., Hashimoto, S., Aiyama, R., Iha, M., Ueyama, S., Yokokura (2000),’’ T Properties of fucoidan from Cladosiphon okamuranus tokida in gastric mucosal protection’’ BioFactors, 11, 235- 245 50 Shimizu, J., Wada-Funada, U., Mano, H., Matahira, Y., Kawaguchi, M., Wada, M (2005),’’ Proportion of murine cytotoxic T cells is increased by high 74 molecular-weight fucoidan extracted from Okinawa mozuku (Cladosiphon okamuranus)’’, J Health Sci, 51, 394-397 51 Wang, W.T., Zhou, J.H., Xing, S.T., Guan, H.S (1994), ‘’Immunomodulating action of marine algae sulfated polysaccharides on normal and immunosuppressed mice’’ Chin J Pharm Toxicol, 8, 199-202 52 Wu, X.W., Yang, M.L., Huang, X.L., Yan, J., Luo, Q (2003), ‘’Effect of fucoidan on splenic lymphocyte apoptosis induced by radiation’’ Chin J Radiol Med Prot., 23, 430-432 53 Wu, X.W., Yang, M.L., Huang, X.L., Yan, J., Luo, Q (2004), ’’ Effect of Laminaria japonica polysaccharides on radioprotection and splenic lymphocyte apoptosis’’ Med J Wuhan Univ, 25, 239-241 54 Yang, X.L., Sun, J.Y., Xu, H.N (1995), ’’An experimental study on immunoregulatory effect of fucoidan’’ Chin J Marine Drugs, 9-13 55 Yang, J.W., Se, Y.Y., Soo, J.O., Sang, K.K., Keon, W.K (2006), ’’ Bifunctional effects of fucoidan on the expression of inducible nitric oxide synthase’’ Biochem Biophys Res, 346, 345-350 56 Zhang, Q.B., Yu, P.Z., Zhou, G.F., Li, Z.E., Xu, Z.H (2003), ‘’Studies on antioxidant activities of fucoidan from Laminaria japonica’’ Chin Trad Herbal Drugs, 34, 824-826 Trang web tra cứu 57.http://www.barokthegreat.com/say-la-gi-cach-phan-loai-say-theo-nhieuphuong-phap-thuc-pham/ 58 https://www.slideshare.net/lanhnguyen564/chuong7-26581693 75 PHỤ LỤC Phụ lục Phương pháp định lượng fucoidan theo John Peter Paul (2014) Hút xác 1ml dịch fucoidan cho vào ống nghiệm làm lạnh dung dịch nước đá, thêm vào dung dịch 4,5ml axit sunfuric 0,5M (1V nước: 6V H2SO4), lắc Sau đó, hỗn hợp trước tiên nâng lên nhiệt độ 25oC giữ nhiệt độ 3-4 phút, sau tiếp nhúng vào nước sơi tục giữ phút Sau làm lạnh hỗn hợp nước máy Sau làm lạnh, cho vào hỗn hợp 0,1ml dung dịch cysteine hydrochlorid 5%, trộn đo độ hấp thụ quang hỗn hợp bước song 396nm 427nm Độ hấp thụ quang fucoidan tính cơng thức: Afucose = A396 – A427 Dựa vào đường chuẩn fucose tính tốn hàm lượng fucoidan theo công thức sau: Hàm lượng fucoidan tính theo cơng thức: Fucoidan = fucose*2 Phụ lục 2: Xác định hoạt tính chống oxy hóa tổng Cách pha đường chuẩn: pha dung dịch acid ascorbic 1mg/1ml sau lấy 10, 20, 30, 40, 50, 80, 90 (μl) bổ sung nước cất tương ứng cho đủ 1ml sau thêm 3ml dung dịch A vào giữ 90 phút 95oC Sau đo bước sóng 695nm Với kết đo vẽ đường chuẩn đưa phương trình So sánh kết mẫu chiết với đường chuẩn có hàm lượng tương ứng acid ascorbic Đường chuẩn: Phụ lục 3: Xác định hoạt tính khử sắt 76 Cách xác định đường chuẩn: pha dung dịch FeSO4 1g/100ml sau lấy 10, 20, 30, 40, 50, 80, 90 (μl), sau bổ sung 0,5ml đệm phosphate pH = 7,2 0,2ml K3[Fe(CN6] 1% Giữ hỗn hợp 20 phút 50oC Sau thêm vào 500μl CCl3COOH 10% bổ sung nước cất cho đủ 800μl 80μl FeCl3 0,1% Sau đo bước sóng 655nm Với kết đo vẽ đường chuẩn đưa phương trình So sánh kết mẫu chiết với đường chuẩn có hàm lượng tương ứng FeSO4 Đường chuẩn: Phụ lục Kết thí nghiệm Bảng Kết xác định hoạt tính oxy hóa dịch chiết rong mơ Sargassum oligocystum thời gian chiết khác Thời Độ hấp thụ gian bước sóng 695 nm TA (mg acid ascorbic/g DW) (phút) Lần Lần Lần Lần Trung bình 60 0.379 0.383 8.036 8.110 8.073±0.052 65 0.384 0.394 8.625 8.860 8.743±0.166 70 0.401 0.398 8.981 8.801 8.891±0.127 75 0.395 0.412 8.824 8.978 8.901±0.108 Bảng Kết xác định hoạt tính khử sắt dịch chiết rong mơ Sargassum oligocystum thời gian chiết khác Thời gian (phút) 60 Độ hấp thụ bước sóng 655 nm Lần Lần 0.425 0.423 RP (mg FeSO4/g DW) Lần 34.920 77 Lần 34.726 Trung bình 34.823±0.137 65 0.435 0.437 70 0.441 0.445 75 0.467 0.471 34.970 35.689 34.934 34.952±0.025 36.031 35.831 35.86±0.241 36.095 35.963±0.186 Bảng Kết xác định hàm lượng fucoidan dịch chiết rong mơ Sargassum oligocystum thời gian chiết khác Hàm lượng fucoidan (mg/g DW) Thời gian (phút) Lần Lần Trung bình 60 85 87 86±1.414 65 87 88 87.5±0.707 70 92 94 93±1.414 75 93 94 93.5±0.707 Phụ lục Bảng Kết xác định hoạt tính oxy hóa dịch chiết rong mơ Sargassum oligocystum nhiệt độ chiết khác Nhiệt độ(oC) Độ hấp thụ bước sóng 695 nm Lần Lần TA (mg acid ascorbic/g DW) Lần Lần Trung bình 65 0.390 0.382 8.064 8.476 8.27±0.291 70 0.401 0.398 8.801 8.981 8.891±0.127 75 0.393 0.395 8.043 8.085 8.064±0.029 80 0.389 0.383 7.771 7.649 7.709±0.086 Bảng Kết xác định hoạt tính khử sắt dịch chiết rong mơ Sargassum oligocystum nhiệt độ chiết khác Độ hấp thụ bước sóng 655 nm Lần Lần Lần Lần Trung bình 65 0.423 0.427 34.772 35.112 34.912±0.240 70 0.441 0.445 36.031 35.86±0.241 75 0.438 0.434 35.76 35.054 35.407±0.499 80 0.412 0.421 33.213 33.755 33.484±0.383 Nhiệt độ(oC) RP (mg FeSO4/g DW) 35.689 Bảng Kết xác định hàm lượng fucoidan dịch chiết rong mơ Sargassum oligocystum nhiệt độ chiết khác 78 Nhiệt độ (oC) Lần Hàm lượng Fucoidan (mg/g DW) Lần Trung bình 65 83 86 84.5±2.121 70 92 94 93±1.414 75 92 96 94±2.828 80 94.5 97.5 96±2.121 Phụ lục Bảng Kết xác định hoạt tính oxy hóa dịch chiết rong mơ Sargassum oligocystum tỉ lệ DM/NL khác Độ hấp thụ bước sóng 695 nm Lần Lần Lần Lần Trung bình 18/1 0.391 0.393 7.243 7.309 7.276±0.046 20/1 0.401 0.397 8.981 8.801 8.891±0.127 22/1 0.300 0.302 7.516 7.568 7.542±0.036 24/1 0.241 0.277 6.634 7.708 7.171±0.759 Tỉ lệ DM/NL TA (mg acid ascorbic/g DW) Bảng Kết xác định hoạt tính khử sắt dịch chiết rong mơ Sargassum oligocystum tỉ lệ DM/NL khác Độ hấp thụ bước sóng 655 nm Lần Lần Tỉ lệ DM/NL RP (mg FeSO4/g DW) Lần Lần Trung bình 18/1 0.378 0.379 34.000 34.040 34.02±0.028 20/1 0.441 0.445 35.689 36.031 35.86±0.241 22/1 0.335 0.337 33.693 33.873 33.783±0.127 24/1 0.278 0.296 32.712 32.854 32.783±0.100 Bảng Kết xác định hàm lượng fucoidan dịch chiết rong mơ Sargassum oligocystum tỉ lệ DM/NL khác Hàm lượng Fucoidan (mg/g DW) Tỉ lệ DM/NL Lần Lần Trung bình 18/1 87.5 90.5 89±2.121 20/1 92 94 93±1.414 22/1 83 87 85±2.828 79 24/1 83.5 84.5 84±0.707 Phụ lục Bảng Kết xác định hoạt tính oxy hóa dịch chiết rong mơ Sargassum oligocystum pH khác 1.8 Độ hấp thụ bước sóng 695 nm Lần Lần 0.401 0.398 Lần 8.981 Lần 8.801 Trung bình 8.891±0.127 2.0 0.445 0.447 10.431 10.477 10.454±0.032 2.2 0.441 0.439 10.035 9.537 9.768±0.352 2.4 0.395 0.415 8.884 9.366 9.125±0.340 pH TA (mg acid ascorbic/g DW) Bảng Kết xác định hoạt tính khử sắt dịch chiết rong mơ Sargassum oligocystum pH dung môi chiết khác pH 1.8 Độ hấp thụ bước sóng 655 nm Lần Lần 0.441 0.445 RP (mg FeSO4/g DW) Lần 35.689 Lần 36.031 Trung bình 35.86±0.241 2.0 0.466 0.456 41.72 40.896 41.308±0.582 2.2 0.399 0.443 34.592 38.416 36.504±2.703 2.4 0.387 0.401 33.956 33.79 33.873±0.117 Bảng Kết xác định hàm lượng fucoidan dịch chiết rong mơ Sargassum oligocystum pH dung môi chiết khác pH Lần Hàm lượng Fucoidan (mg/g DW) Lần Trung bình 1.8 92 94 93±1.414 2.0 102 99 100.5±2.121 2.2 88 91 89.5±2.121 2.4 87 89 88±1.414 Phụ lục Bảng Kết xác định hoạt tính oxy hóa dịch chiết rong mơ Sargassum oligocystum số lần chiết khác Số lần chiết Độ hấp thụ bước sóng 695 nm TA (mg acid ascorbic/g DW) 80 Lần Lần Lần Lần Trung bình lần 0.401 0.398 8.981 8.801 8.891±0.127 lần 0.406 0.401 12.338 12.471 12.404±0.094 lần 0.408 0.412 12.711 12.891 12.801±0.127 Bảng Kết xác định hoạt tính khử sắt dịch chiết rong mơ Sargassum oligocystum số lần chiết khác Số lần chiết Độ hấp thụ bước sóng 695 nm Lần Lần RP (mg FeSO4/g DW) Lần Lần Trung bình lần 0.441 0.445 35.689 36.031 35.86±0.241 lấn 0.415 0.403 52.26 50.882 51.571±0.974 lần 0.343 0.299 54.719 48.443 51.585±4.437 Bảng Kết xác định hàm lượng fucoidan dịch chiết rong mơ Sargassum oligocystum số lần chiết khác Số lần chiết Lần Hàm lượng Fucoidan (mg/g DW) Lần Trung bình lần 92 94 93±1.414 lần 125.6 141.4 133.5±11.172 lần 140 147 143.5±4.949 Phụ lục Bảng Bảng kết xác định hiệu suất chiết rong S.olygocystum Hàm lượng fucoidan(g/mgDW) Số lần chiết Lần Lần Trung bình lần 130 136 133±4.242 lần 185 181 183±2.828 81 QUY TRÌNH CHIẾT S.OLYGOCYSTUM XUẤT FUCOIDAN TỪ THÂN RONG Thân rong mơ s.olygocystum Xay nhỏ Chiết xuất fucoidan {m=30g, DM/NL= 20/1, t=70oC, T=70 phút} Lọc Bã Ly tâm dịch loại bỏ cặn Kết tủa fucoidan Ly tâm lấy tủa Sấy Fucoidan 82 MƠ QUY TRÌNH SẤY PHUN THU FUCOIDAN TỪ DỊCH CHIẾT LÁ RONG MƠ S.OLYGOCYSTUM Dịch chiết fucoidan từ rong mơ S.oligocystum Cô đặc Sấy phun Bột chế phẩm Bao gói Bảo quản Sản phẩm 83 MỘT SỐ HÌNH ẢNH Lá rong mơ s.olygocystum xay nhỏ Dịch chiết từ rong mơ Tủa fucoidan ướt Kết tủa fucoidan Tủa fucoidan sấy khô Bột fucoidan 84 ... lượng fucoidan dịch chiết fucoidan thu nhận từ rong mơ s .olygocystum 61 Hình 16 Quy trình chiết rút fucoidan từ rong mơ S oligocystum 64 Hình 17 Hình ảnh bột fucoidan chiết rút từ rong mơ. .. lượng fucoidan dịch chiết fucoidan thu nhận từ rong mơ s .olygocystum 54 Hình 10 Ảnh hưởng số pH chiết rút đến hoạt tính chống oxi hóa tổng dịch chiết fucoidan thu nhận từ rong mơ s .olygocystum. .. khử sắt dịch chiết fucoidan thu nhận từ rong mơ s .olygocystum 57 Hình 12 Ảnh hưởng số PH chiết rút đến khối lượng fucoidan dịch chiết fucoidan thu nhận từ rong mơ s .olygocystum