Thử nghiệm tạo chế phẩm bacteriocin sinh tổng hợp từ lactobacillus acidophilus và ứng dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh trên nhóm rau ăn sống

TÊN ĐỀ TÀI: Thử nghiệm tạo chế phẩm bacteriocin sinh tổng hợp từ Lactobacillus acidophilus và ứng dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh trên nhóm rau ăn sống.. Từ những nguyên nhân t

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN ĐĂNG KHOA

THỬ NGHIỆM TẠO CHẾ PHẨM BACTERIOCIN SINH

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Cán bộ chấm nhận xét 2: PGS.TS Phan Ngọc Hòa

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM Ngày 21 tháng 07 năm 2018

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

1 PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên – Chủ tịch Hội đồng

2 TS Hoàng Anh Hoàng – Thư ký Hội đồng

3 PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng - Ủy viên Phản biện 1

4 PGS.TS Phan Ngọc Hòa - Ủy viên Phản biện 2

5 TS Võ Đình Lệ Tâm - Ủy viên Hội đồng

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên GS.TS Phan Thanh Sơn Nam

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Nguyễn Đăng Khoa MSHV: 7140071

Ngày, tháng, năm sinh: 30/05/1990 Nơi sinh: Kiên Giang

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số: 60 42 02 01

I TÊN ĐỀ TÀI: Thử nghiệm tạo chế phẩm bacteriocin sinh tổng hợp từ

Lactobacillus acidophilus và ứng dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh trên nhóm

rau ăn sống

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Khảo sát quá trình sinh tổng hợp và đặc tính bacteriocin từ chủng Lactobacillus

acidophilus

- Tạo chế phẩm, và đánh giá chế phẩm bacteriocin dạng bột từ dịch nuôi cấy

Lactobacillus acidophilus bằng phương pháp sấy thăng hoa

- Ứng dụng chế phẩm ức chế vi sinh vật gây bệnh trên mô hình trung gian giá đỗ gây nhiễm trong phòng thí nghiệm

- Ứng dụng chế phẩm ức chế vi sinh vật gây bệnh trên rau xà lách

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 15/01/2018

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 22/06/2018

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành luận văn này, em xin được gởi lời cám ơn chân thành đến các thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học Đại học Bách Khoa TP-HCM đã giúp

em chuẩn bị hành trang kiến thức từ những ngày đại học

Xin cám ơn cô Hương, vì sự quan tâm, giúp đỡ trong quá trình học tập, làm việc, nghiên cứu, đồng thời xin lỗi cô vì đã làm cô lo lắng trong suốt thời gian dài

Xin cám ơn sự hỗ trợ của các thầy cô, anh/chị cán bộ phòng thí nghiệm, cộng sự,

và các em khóa dưới đã giúp đỡ rất nhiều trong thời gian nghiên cứu ở bộ môn Xin cám ơn bạn bè và gia đình vì sự quan tâm, động viên và tin tưởng

Trân trọng

Nguyễn Đăng Khoa

TÓM TẮT

Đề tài thử nghiệm tạo chế phẩm bacteriocin từ chủng Lactobacillus acidophilus

DSM 20079 và ứng dụng chế phẩm ức chế vi sinh vật gây bệnh trên nhóm rau ăn sống, đại diện là rau xà lách Kết quả cho thấy: sấy thăng hoa có thể tạo chế phẩm với

hoạt tính cao,1280 AU/mL, từ dịch nuôi cấy Lb acidophilus sau 3 ngày lên men Chế

phẩm ức chế các chủng gây bệnh khảo sát với nồng độ ức chế tối thiểu là: 20 AU/mL

đối với 2 chủng Bacillus cereus ATCC 11778, và Staphylococcus aureus ATCC 25923; 40 AU/mL đối với Salmonella typhimurium ATCC 14028, và 80 AU/mL đối với Escherichia coli ATCC 25922 Chế phẩm có hoạt tính ổn định khi bảo quản ở

4oC, thời gian khảo sát 3 tháng Nồng độ bacteriocin 80 AU/mL và thời gian xử lý 15 phút được ứng dụng trên mẫu rau xà lách, giúp giảm mật độ vi sinh vật trên mẫu rau

sau xử lý: 91,67 % ÷ 92,98 % đối với E coli và Salmonella; 96,15 % ÷ 100 % đối với B cereus và S aureus, mà không gây ra sự khác biệt về cảm quan trên mẫu

ABSTRACT

Development of bacteriocin powder produced by Lactobacillus aciodphilus and application of this powder for the inhibition of some foodborn pathogens

associated with fresh vegetables

In this paper, bacteriocin powder was produced from Lactobacillus acidophilus

DSM 20079 culture and applied to control some foodborn pathogens on fresh vegetables, which lettuce was representative sample The results showed that: freeze

dried bacteriocin powder from 3-day cultivation of Lb acidophilus has 1280 AU/mL

of inhibitory activity, and ability to inhibit the growth of vegetables indicator pathogens The minimum inhibitory concentrations were 20 AU/mL against 2 strains:

Bacillus cereus ATCC 11778 and Staphylococcus aureus ATCC 25923; 40 AU/mL against Salmonella typhimurium ATCC 14028, and 80 AU/mL against Escherichia coli ATCC 25922 Inhibitory activity was stable during 3 months of storage at 4oC

15 minutes and 80 AU/mL of bacteriocin powder concentration were effective to process vegetable samples, reducing the level of foodborn pathogens on processed

lettuce samples: 91,67 % ÷ 92,98 % against E coli and Salmonella; 96,15 % ÷ 100 % against B cereus and S aureus without changing sensory attributes of samples

❖ Một phần kết quả nghiên cứu liên quan được trình bày ở các bài báo:

1 Nguyễn Đăng Khoa, Nguyễn Thị Ái Hồng, Nguyễn Thúy Hương, 2018 “Ứng dụng chế phẩm bacteriocin để kiểm soát vi sinh vật gây bệnh trên rau xà lách ăn sống”,

Tạp chí Khoa học Đại học Sư Phạm TP.HCM ISSN: 1859-3100, tập 15(6) trang 170 -178

2 Nguyễn Đăng Khoa, Nguyễn Võ Anh Khoa, Quách Đức Tính, Nguyễn Thúy

Hương, 2013 “Khảo sát độ bền hoạt tính của bacteriocin được Lactobaillus acidophilus tổng hợp” Hội nghị khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc, Nhà xuất

bản khoa học tự nhiên và công nghệ, Trung tâm hội nghị quốc gia, Hà Nội, trang 275

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình

TP.HCM, ngày… tháng… năm…

Nguyễn Đăng Khoa

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

LỜI CAM ĐOAN iv

DANH MỤC VIẾT TẮT vii

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Bacteriocin của chủng LAB 3

1.1.1 Định nghĩa và lược sử nghiên cứu 3

1.1.2 Phân loại, đặc điểm quá trình sinh tổng hợp và cơ chế tác động 4

1.1.3 Phổ kháng khuẩn và đặc điểm lý hóa của bacteriocin 18

1.1.4 Ứng dụng của bacteriocin và tình hình nghiên cứu trong ngoài nước 19

1.2 Rau sống và mối nguy vi sinh 24

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 28

2.1 Địa điểm thời gian thực hiện 28

2.2 Vật liệu 28

2.2.1 Các chủng giống vi sinh 28

2.2.2 Hóa chất dụng cụ và môi trường nuôi cấy 28

2.3 Phương pháp và nội dung thực hiện 28

2.3.1 Sơ đồ tổng quát nội dung thực hiện 28

2.3.2 Thuyết minh sơ đồ nội dung nghiên cứu 30

2.3.3 Phương pháp thực hiện 38

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 43

3.1 Giống Lactobacillus acidophilus 43

3.2 Quá trình sinh tổng hợp và đặc tính bacteriocin 44

3.2.1 Quá trình sinh tổng hợp bacteriocin 44

3.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ, pH, và enzyme đến hoạt tính bacteriocin 46

3.3 Chế phẩm bacteriocin 49

3.4 Đánh giá chế phẩm bacteriocin 52

3.4.1 Khả năng ức chế các chủng vi khuẩn gây bệnh 52

3.4.2 Nồng độ ức chế tối thiểu 53

3.4.3 Độ ổn định hoạt tính chế phẩm theo thời gian 54

3.5 Ứng dụng chế phẩm kiểm soát vi sinh vật gây bệnh trên mô hình trung gian giá đỗ 56

3.5.1 Gây nhiễm đơn từng chủng gây bệnh 56

3.5.2 Gây nhiễm hỗn hợp các chủng gây bệnh 60

3.6 Ứng dụng chế phẩm trên mẫu rau xà lách thực tế 62

3.6.1 Đánh giá vi sinh mẫu rau sau xử lý 62

3.6.2 Đánh giá cảm quan mẫu rau sau xử lý 65

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67

4.1 Kết luận 67

4.2 Kiến nghị 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

DANH MỤC VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại bacteriocin của vi khuẩn Gram dương 5

Bảng 1.2 Một số mối nguy vi sinh trên rau sống 26

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, enzyme đến hoạt tính dịch bacteriocin 47 Bảng 3.2 Chế phẩm bacteriocin 50

Bảng 3.3 Đường kính vòng kháng khuẩn 52

Bảng 3.4 Nồng độ ức chế tối thiểu của chế phẩm với các chủng khảo sát 53

Bảng 3.5 Mật độ vi khuẩn gây bệnh trên rau trước và sau xử lý bacteriocin 63

Bảng 3.6 Đánh giá cảm quan mẫu rau xà lách bằng phép thử tam giác 66

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ trình tự amino acid của các lantibiotic 7

Hình 1.2 Sơ đồ tổ chức cụm gen và các bước chỉnh sửa lantibiotic 9

Hình 1.3 Sơ đồ điều hòa sinh tổng hợp lantibiotic 10

Hình 1.4 Mô hình tạo lỗ trên màng 12

Hình 1.5 Sơ đồ sinh tổng hợp bacteriocin lớp II 14

Hình 1.6 Protein vận chuyển ABC có vùng liên kết protease ở đầu N 15

Hình 1.7 Cơ chế tác động của bacteriocin 16

Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 29

Hình 2.2 Thí nghiệm khảo sát sinh tổng hợp bacteriocin 30

Hình 2.3 Thí nghiệm khảo sát đặc tính bacteriocin 31

Hình 2.4 Thí nghiệm tạo chế phẩm bacteriocin 33

Hình 2.5 Thí nghiệm đánh giá chế phẩm bacteriocin 34

Hình 2.6 Thí nghiệm ứng dụng trên mô hình trung gian giá đỗ 36

Hình 2.7 Thí nghiệm ứng dụng trên mẫu rau xà lách 37

Hình 2.8 Thiết bị sấy thăng hoa FDU-2100 41

Hình 3.1 Quá trình sinh tổng hợp bacteriocin 44

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính dịch bacteriocin 48

Hình 3.3 Độ ổn định hoạt tính của chế phẩm bacteriocin 55

Hình 3.4 Mật độ vi khuẩn gây bệnh trên mô hình trung gian giá đỗ gây nhiễm đơn sau khi xử lý bacteriocin nồng độ 20 AU/mL 57

Hình 3.5 Mật độ vi khuẩn gây bệnh trên mô hình trung gian giá đỗ gây nhiễm đơn sau khi xử lý bacteriocin nồng độ 40 AU/mL 58

Hình 3.6 Mật độ vi khuẩn gây bệnh trên mô hình trung gian giá đỗ gây nhiễm đơn

sau khi xử lý bacteriocin nồng độ 80 AU/mL 59

Hình 3.7 Mật độ vi khuẩn gây bệnh trên mô hình trung gian giá đỗ gây nhiễm hỗn

hợp khi xử lý chế phẩm bacteriocin 61

MỞ ĐẦU Đặt vấn đề

Bacteriocin là những protein được sinh tổng hợp từ vi khuẩn có thể ức chế sự sinh trưởng phát triển của vi khuẩn khác [30] Sự tạo thành bacteriocin trong vi khuẩn rất

đa dạng, trong đó nhóm bacteriocin bắt nguồn từ vi khuẩn lactic (LAB_Lactic acid bacteria) sở hữu nhiều tiềm năng ứng dụng khác nhau trong y học và thực phẩm [37] Các bacteriocin này là những peptide, tích điện dương, kỵ nước, chủ yếu tấn công lên

màng tế bào và gây ức chế các chủng vi sinh vật nhạy cảm [30]

Trong các bacteriocin của chủng LAB, nhóm bacteriocin sinh tổng hợp từ Lb acidophilus ức chế được nhiều vi sinh vật gây bệnh như: Bacillus cereus, L monocytogenes, Clostridium sp…Hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin được xem như một trong những nguyên nhân quan trọng giúp chủng Lb acidophilus thể hiện

tiềm năng probiotic vượt trội Ngoài ra, các bacteriocin này thường bền nhiệt, pH, nên có khả năng sử dụng như chất phụ gia sinh học, nhằm thay thế một số phụ gia thực phẩm truyền thống [50]

Rau thuộc nhóm thực phẩm không thể thiếu trong bữa ăn ở khắp nơi Tuy vậy, bắt nguồn từ thói quen canh tác, sự ô nhiễm vi sinh ở rau, với các chủng vi khuẩn gây

bệnh như E coli, Salmonella, B cereus…[2], trở thành vấn đề đầy quan ngại

Đặc biệt, với nhu cầu giữ lại nhiều nhất những thành phần dinh dưỡng trong rau,

và phong cách ẩm thực, nhóm rau ăn sống vốn không qua chế biến xử lý nhiệt trước khi ăn, nên mối nguy vi sinh càng cao và có thể tác động trực tiếp đến sức khỏe người tiêu dùng Trong đó, rau xà lách là loại rau ăn sống phổ biến cùng với xà lách xoong, rau muống, cải bẹ xanh, rau đắng, rau tần ô…

Với khả năng kháng khuẩn và tính an toàn như đã nêu, bacteriocin từ chủng Lb acidophilus có thể được sử dụng như một phương thức mới để ức chế vi sinh vật gây

bệnh trong thực phẩm và đặc biệt trên nhóm rau ăn sống, đại diện trong nghiên cứu này là rau xà lách

Từ những nguyên nhân trên nhóm chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Thử nghiệm tạo

chế phẩm bacteriocin sinh tổng hợp từ Lactobacillus acidophilus và ứng dụng ức chế

một số vi sinh vật gây bệnh trên nhóm rau ăn sống”

Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài được thực hiện nhằm:

- Thử nghiệm tạo chế phẩm bacteriocin sinh tổng hợp từ Lactobacillus acidophilus

- Khảo sát khả năng ứng dụng của chế phẩm bacteriocin trong việc kiểm soát một

số vi sinh vật gây bệnh trên rau ăn sống

Nội dung nghiên cứu

Để thực hiện được mục tiêu nêu trên, nội dung nghiên cứu của đề tài như sau:

Nội dung 1: tạo chế phẩm bacteriocin từ chủng Lactobacillus acidophilus

- Khảo sát quá trình sinh tổng hợp và một số đặc tính bacteriocin từ chủng Lactobacillus acidophilus

- Tạo chế phẩm bacteriocin dạng bột từ dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus acidophilus bằng phương pháp sấy thăng hoa, và đánh giá chế phẩm

Nội dung 2 Ứng dụng chế phẩm bacteriocin nhằm ức chế vi sinh vật gây bệnh

trên nhóm rau ăn sống, đại diện là rau xà lách

- Khảo sát khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh của chế phẩm trên mô hình trung gian giá đỗ được gây nhiễm trong phòng thí nghiệm

- Khảo sát khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh trên rau xà lách: đánh giá mật độ

vi sinh và chỉ tiêu cảm quan của mẫu rau sau xử lý

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bacteriocin của chủng LAB

1.1.1 Định nghĩa và lược sử nghiên cứu

Định nghĩa bacteriocin được Klaenhammer đưa ra năm 1993 và được chấp nhận

rộng rãi trong cộng đồng nghiên cứu: “bacteriocin là những peptide hoặc protein ngoại bào, rất đa dạng, có hoạt tính sinh học, được sinh tổng hợp bởi ribosome, có khả năng ức chế vi khuẩn khác” [31]

Năm 1877, Pasteur cùng cộng sự của mình Joubert, khi đang tìm cách ức chế sự

sinh trưởng của Bacillus anthrax, đã phát hiện sự ức chế sinh trưởng in vivo và in vitro ở các vi sinh vật Các nghiên cứu về sau đã chứng minh: chính các hợp chất

được sinh ra trong quá trình sinh trưởng phát triển của vi sinh vật với một nồng độ rất thấp là tác nhân quan trọng cho các phản ứng đối kháng xảy ra Các hợp chất ấy được gọi chung là antibiotic (kháng sinh) [30]

Năm 1925 lần đầu tiên Gratia phát hiện ra hợp chất nhỏ và bền nhiệt do chủng

E.coli V tổng hợp có khả năng ức chế sự phát triển của chủng E.coli Φ ở một nồng

độ thấp Hợp chất trên được gọi là colicin, được sản xuất bởi E.coli và các vi khuẩn trong họ Entorobacteria [30]

Năm 1953 Jacob lần đầu sử dụng tên gọi bacteriocin cho các hợp chất kháng khuẩn

có bản chất protein được tổng hợp ở vi sinh vật Trong khoảng thời gian này bản chất protein của colicin được khám phá, cơ chế tổng hợp, hoạt động, khối lượng phân tử

và cụm gen có chức năng tổng hợp colicin lần lượt được công bố Những bacteriocin khác mersacidin và epidermin (thuộc nhóm lantibiotic) cho thấy tác dụng trong việc

điều trị bệnh gây ra bởi Staphylococcus ở chuột

Năm 1928, Rogers và cộng sự phát hiện bacteriocin đầu tiên của vi khuẩn Gram

dương, trước penicillin, do các vi khuẩn nhóm lactococci (nhóm streptococci N) sinh

tổng hợp Năm 1947, Hirsh và cộng sự đặt tên bacteriocin này là nisin, với ý nghĩa:

“hoạt chất kháng khuẩn của nhóm N” Nisin được tách chiết và xác định tính chất

đặc biệt với các sản phẩm từ sữa Thành công về thương mại của nisin đã mở đường cho những nghiên cứu bacteriocin của vi khuẩn Gram dương về đặc tính phân tử, di truyền và khả năng ứng dụng thực tế

Năm 1976, Tagg và cộng sự công bố nghiên cứu tổng quan đầu tiên về bacteriocin của vi khuẩn Gram dương, đánh dấu cột mốc cho sự phát triển của hướng nghiên cứu những hợp chất tương tự nisin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram dương [42]

1.1.2 Phân loại, đặc điểm quá trình sinh tổng hợp và cơ chế tác động

Bacteriocin bao gồm những nhóm peptide và protein đa dạng, khác nhau về kích thước, vi khuẩn mục tiêu, cơ chế kháng khuẩn, và tính miễn nhiễm bacteriocin của vi sinh vật chủ… Nhiều nỗ lực trong việc phân loại bacteriocin của các chủng vi khuẩn Gram dương, và LAB đã được thực hiện

Dựa trên cấu trúc, đặc điểm hóa lý, đặc điểm phân tử, bacteriocin của chủng LAB được Klaenhammer chia thành 3 nhóm lớn [31] Cùng với việc phát hiện những bacteriocin mới, hệ thống phân loại cũng tiếp tục được thay đổi và cập nhật dựa trên khóa phân loại ban đầu của Klaenhammer Khóa phân loại giới thiệu ở bảng 1.1 được chấp nhận rộng rãi trong cộng đồng nghiên cứu Trong đó, các bacteriocin thuộc lớp

I và II chiếm tỷ lệ lớn và đã được nghiên cứu rõ các đặc tính phân tử, di truyền, cơ chế tác động…

Bảng 1.1 Phân loại bacteriocin của vi khuẩn Gram dương

I Lantibiotic, trải qua chỉnh sửa sau dịch mã, chứa các acid amin không mã hóa: Lan và Melan

II Những peptide không trải qua chỉnh sửa sau dịch mã, kích thước nhỏ (< 10 kDa) tích điện dương,

bền nhiệt

III Protein kích thước lớn (> 10 kDa), cấu tạo phức tạp, chịu nhiệt Helveticin J

IV Những bacteriocin cyclic, cấu trúc vòng, kị nước, tích điện dương Enterocin AS-48

[33, 42, 52]

1.1.2.1 Lớp I: các lantibiotic

Lantibiotic là tên gọi của các peptide kháng khuẩn, chứa các amino acid hiếm không mã hóa như: Lanthionine (Lan), 3-methyllanthionine (MeLan), dehydroalanine (Dha), hay Dehydrobutyrine (Dhb) (hình 1.1) Các aminoacid này xuất hiện do quá trình chỉnh sửa sau dịch mã Các bacteriocin thuộc lớp này có số lượng lớn và đa dạng, đặc điểm chung là đều trải qua quá trình chỉnh sửa sau dịch mã

để tạo peptide trưởng thành, có hoạt tính, từ các tiền peptide Các lantibiotic được phát hiện đến nay đều được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram dương, và có phổ kháng khuẩn đối với các vi khuẩn Gram dương rộng hơn so với các vi khuẩn Gram âm Lớp I bao gồm 2 phân lớp nhỏ, được chia theo cấu trúc và đặc tính sinh học: phân lớp IA bao gồm những peptide ở dạng chuỗi thẳng, tích điện dương, phân lớp IB gồm những peptide hình cầu, không tích điện Phân lớp IA được chia tiếp thành hai phân nhóm nhỏ dựa trên kích thước, điện tích và trình tự peptide leader: phân nhóm A1 và phân nhóm A2 Dựa trên những bacteriocin mới được phát hiện, nhiều tác giả đề xuất phân lớp IC bao gồm các lantibiotic 2 thành phần [42]

a Quá trình điều hòa sinh tổng hợp và tính miễn nhiễm

Cụm gen mã hóa các lantibiotic có thể nằm trên chromosome [22], hoặc plasmid hoặc transposon [25] Thông thường, cụm gen sẽ bao gồm các gen mã hóa trình tự: của tiền peptide, các protein hỗ trợ tạo bacteriocin ở dạng hoạt động [25], các protein

hỗ trợ vận chuyển bacteriocin qua màng tế bào , protein điều hòa và protein tạo tính miễn nhiễm ở vi sinh vật chủ [22]

Sinh tổng hợp: con đường sinh tổng hợp của nisin có sự đồng tham gia biểu hiện của 11 cụm gen, tương đối ít so với các lantibiotic khác Cụ thể nisA mã hóa tiền

peptide, protein NisB, NisC khử nước ở các gốc Ser/Thr, hình thành liên kết thioether (Lan và MeLan) với gốc Cys, ở đầu C của phân tử peptide [25, 33] NisT là protein vận chuyển ABC, có nhiệm vụ giải phóng đoạn peptide ra khỏi tế bào NisP là protein bám trên màng tế bào, có nhiệm vụ cắt đoạn peptide leader, tạo bacteriocin có hoạt tính

Những gốc (β-methyl) lanthionine được tô xám (Ala-S-Ala lanthionine; Ala, β-methyllanthionine); những gốc chỉnh sửa khác được tô đen (Dha

Abu-S-Hình 1.1 Sơ đồ trình tự amino acid của các lantibiotic

Tính miễn nhiễm: NisI là protein tham gia vào quá trình tự miễn nhiễm nisin của

tế bào vi sinh vật chủ Các NisI có thể được gắn trên màng nguyên sinh, và tạo liên kết với các phân tử nisin bên ngoài và gây tủa trên bề mặt tế bào Khi biểu hiện NisI

ở các chủng nhạy cảm, sẽ làm giảm tính nhạy cảm của các chủng này với nisin Tuy nhiên tính miễn nhiễm sẽ không thể hiện hoàn toàn nếu không có mặt của NisFEG NisFEG là một phức hợp protein vận chuyển ABC, thể hiện vai trò miễn nhiễm bằng

cơ chế tương tự như các kênh vận chuyển đa thuốc (multi-drug transporters), giúp giảm nồng độ nisin tiếp xúc trực tiếp với màng tế bào [42]

Điều hòa cảm ứng: NisK và NisR cùng tạo thành một sensor kinase (Histindine

protein kinase_HPK) giúp cảm ứng các yếu tố điều hòa đáp ứng (Respone regulator_RR) tham gia vào quá trình sinh tổng hợp nisin Sensor kinase thể hiện hoạt tính vào giai đoạn tăng trưởng, đặc biệt nisin được nhận biết và liên kết với NisK, nên nisin có thể tự điều hòa biểu hiện [42]

Con đường sinh tổng hợp nisin cơ bản được bảo toàn cho tất cả các lantibiotic Tuy nhiên, một số thay đổi được ghi nhận ở các lantibiotic khác: phản ứng khử nước và tạo vòng được thực hiện nhờ enzyme LanM thay vì phức hợp LanB/C Một số lantibiotic mã hóa LanD, có vai trò trong việc hình thành những amino acid lạ như S-[(Z)-2-aminovinyl]-D-cysteine(AviCys) và S-[(Z)-2-aminovinyl] -(3S)-3methyl-D-cysteine (AviMeCys) Tính miễn nhiễm của vi sinh vật chủ ở các lantibiotics khá đa dạng như: chỉ phụ thuộc vào LanI (Pep 5) hoặc Lan FEG (lacticin 481), hay có sự tham gia của nhân tố phụ như LanH giúp tăng cường phản ứng miễn dịch qua trung gian Lan FEG (epidermin và gallidermin) [42]

Quá trình nghiên cứu phát hiện nhiều biến thể của nisin A, trong đó nisin U là một biến thể bao gồm 31 amino acid (khác nisin A 12 amino acid), được sinh tổng hợp

bởi Streptococcus uberis, có độ tương đồng 82 % Chủng chủ sinh tổng hợp nisin A

và nisin U miễn nhiễm chéo, protein NsuI, giúp thể hiện tính miễn nhiễm của nisin U với chủng chủ, chỉ tương đồng 55 % so với NisI Ngược lại, không có ghi nhận về tính miễn nhiễm chéo giữa nisin và subtilin mặc dù độ tương đồng của 2 peptide trên

là 60 % [33]

(A) Sơ đồ tổ chức cụm gen sinh tổng hợp các lantibiotic phân lớp IA: nisin A, nisin

U, SA-SFF2, (B): Các bước chỉnh sửa nisin từ prepetide đến nisin có hoạt tính, dấu

* đánh dấu vị trí các gốc chỉnh sửa; A, B, C, D, E kí hiệu các liên kết vòng [42]

Hình 1.2 Sơ đồ tổ chức cụm gen và các bước chỉnh sửa lantibiotic

Phân nhóm A2 khác phân nhóm A1 ở việc cầu nối thioether được hình thành do tác động enzyme LanM, thay vì sự tác động kết hợp của LanB và LanC Phân nhóm này thường có trình tự bảo tồn tương đồng E(L/V) và E(L/M) trong peptide leader Peptide leader chứa thêm trình tự glycine kép (GG/GA/GS) ngay sau vị trí cắt, đặc điểm này tương đồng đồng với các bacteriocin lớp II Lacticin 481 là đại diện tiêu biểu cho lantibiotic phân nhóm A2, bao gồm 27 amino acid Cụm gen lacticin 481 không mã hóa sensor kinase, quá trình điều hòa được thay thế bằng hai promoter P1

và P3 bằng cách kiểm soát pH [42]

Phân lớp IB bao gồm các peptide hình cầu, cấu trúc bền vững, không tích điện hoặc tích diện âm trong pH trung tính Trong đó, cinamycin là bacteriocin gồm 19

amino acid được sinh tổng hợp bởi S cinnamoneus Cấu trúc đặc trưng: có 2 vòng

MeLan tạo bởi cystine ở đầu N và Dhb, có liên kết vòng lysinoalanine từ đầu đến đuôi, và có leader peptide dài hơn so với các tiền peptide của các lantibiotic khác Cinamycin được vận chuyển bằng đường vận chuyển Sec thay vì phức hợp protein ABC [42]

Hình 1.3 Sơ đồ điều hòa sinh tổng hợp lantibiotic [18]

Qua đó, nhận thấy cơ chế điều hòa sinh tổng hợp các lanbitotic khá đa dạng:

• Không chứa gen mã hóa yếu tố điều hòa bên trong cụm gen (lacticin 481)

• Tự điều hòa (nisin)

• Điều hòa bởi peptide tín hiệu nhưng không phải các lantibiotic (SA-FF22)

• Điều hòa thông qua 2 peptide, mỗi peptide cảm ứng biểu hiện những gen khác nhau, trong cụm gen (mersadin có 2 yếu tố đáp ứng điều hòa: MrsR1 và MrsR2; MrsR1 cảm ứng biểu hiện gen miễn nhiễm và MrsR2 cảm ứng gen sinh tổng hợp [42])

b Cơ chế tác động

Mặc dù có nhiều khác biệt cấu trúc và các đặc tính hóa lý giữa bacteriocin thuộc 4 lớp, cơ chế tác động chung của bacteriocin là tương tác với màng sinh chất và hình thành lỗ rỗng, hoặc các kênh ion trên màng của các tế bào vi khuẩn, làm mất điện thế màng (Δψ), gradien pH, và các thành phần tế bào cuối cùng gây chết tế bào

Những nghiên cứu trước đây cho thấy nisin hình thành lỗ trên màng các tế bào đích tích điện âm và môi trường kiềm (bên trong màng) Liên kết được hình thành giữa bacteriocin và màng tế bào được giải thích dựa trên đặc điểm cấu tạo của các phân tử peptide: bacteriocin là những phân tử tích điện dương có các gốc kị nước, có thể hình thành tương tác tĩnh điện với các gốc phosphate tích điện âm có trên màng

tế bào [20] Các liên kết kị nước giữa bacteriocin và tính kị nước của màng cũng được

mô phỏng để dự đoán khả năng liên kết Các gốc kị nước sẽ chèn vào màng và hình thành các lỗ

Có 2 kiểu tạo lỗ ở nisin: tán nổi, và hình nêm Theo mô hình tán nổi, mỗi phân tử bacteriocin định hướng vuông góc với màng, hình thành kênh ion xuyên qua màng Theo mô hình nêm, một số lượng cần thiết phân tử nisin đã liên kết với màng, sẽ xuyên qua màng đồng thời hình thành các lỗ nhọn hình nêm Những nghiên cứu khác, cho thấy sự phức tạp trong việc thể hiện hoạt tính bacteriocin: trong một số trường hợp, nisin cần phải liên kết với các phân tử lipid II (lipid II đóng vai trò phân tử cập

bến_docking molecule) trên màng các vi sinh vật nhạy cảm để tạo lỗ và tiêu diệt vi sinh vật [35]

Hình 1.4 Mô hình tạo lỗ trên màng

(A): kiểu hình nêm; B: kiểu tán nổi [35]

1.1.2.2 Lớp II các peptide nhỏ không trải qua quá trình chỉnh sửa

Lớp II rất đa dạng và được chia thành 3 phân lớp nhỏ Trong đó phân lớp IIA còn

được gọi là các bacteriocin giống pediocin, thể hiện hoạt tính ức chế Listeria monocytogenes Đại diện điển hình của phân lớp này là pediocin PA-1, gồm 44 amino acid được sinh tổng hợp bởi P acidilactici Pediocin PA-1 được ứng dụng kháng Listeria trong bảo quản thực phẩm [43]

Ngoài đặc tính kháng listeria, bacteriocin thuộc phân lớp IIA đặc trưng bởi trình

tự amino acid bảo tồn Tyr-Gly-Asn-Gly-Val/leu (YGNGV hay còn gọi là pediocin box) ở cuối đầu N, và sự hiện diện của cầu nối disulfite, do đó các petide này khá tương đồng về phổ kháng khuẩn, nhưng giá trị MIC (Minimum inhibitory concentration_nồng độ ức chế tối thiểu) khác nhau đối với các chủng vi khuẩn đích Nhìn chung trình tự peptide sở hữu 2 cầu nối disulfite có phổ kháng khuẩn rộng hơn những peptide chỉ có 1 cầu nối [42]

Tính kháng đặc hiệu Listeria monocytogenes được quy định ở trình tự bảo tồn

Nếu trình tự bị thay đổi có thể làm giảm hoạt tính bacteriocin như trường hợp acidocin

A, được sinh tổng hợp từ Lb acidophilus Nếu pedioxin box có vai trò trong thể hiện

tính kháng Listeria, đặc tính của từng peptide có thể được quyết định bởi tác động

tổng hợp của các amino acid thành phần còn lại [42]

Các bacteriocin thuộc phân lớp IIB có cấu tạo gồm 2 petide thành phần, và cần cả

2 peptide để thể hiện hoạt tính tối đa Các bacteriocin này được chia thành 2 loại: loại

S và loại E Loại S gồm các bacteriocin chỉ thể hiện hoạt tính khi kết hợp cả 2 peptide,

không có peptide nào tự thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, ví dụ: lactococcin G từ L lactis, lactacin từ Lb johnsonii và lactocin 705 từ Lb casei Ngược lại, ở loại E, 1

trong 2 hoặc mỗi peptide thành phần đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, nhưng khi

kết hợp tác động của cả 2 sẽ làm tăng cao hoạt tính như: thermophilin 13 từ S thermophilus; enterocin 50 từ E faecium, ABP-118 từ Lb salivarius [42]

a Quá trình điều hòa sinh tổng hợp và tính miễn nhiễm

Cụm gen mã hóa cho các bacteriocin lớp II như plantaricin, pediocin và sakacin…cũng được nghiên cứu làm rõ Các cụm gen này mã hóa thông tin của 3 nhóm protein chính: tiền peptide, protein miễn nhiễm, protein vận chuyển và điều hòa Các gen mã hóa nhiều bacteriocin sẽ có chung hệ thống protein điều hòa vận chuyển, nhưng có hệ thống protein miễn nhiễm riêng biệt [22]

Đối với pediocin PA-1 gen mã hóa nằm trên plasmid, bao gồm pedA, pedB, pedC, pedD.Trong đó, PedA và PedB mã hóa tiền peptide và protein miễn nhiễm [43] Tiền

peptide thể hiện 80 % hoạt tính của peptide trưởng thành 18 amino acid đầu tiên của PedA chứa peptide tín hiệu định vị trí cắt tại trình tự glysine kép ở đầu C Quá trình cắt sẽ diễn ra khi peptide được vận chuyển ra ngoài tế bào, nhờ phức hợp protein vận

chuyển ABC, được mã hóa bởi pedC và pedD Trong đó, phức hợp ABC được thật

sự mã hóa bởi pedD, pedC mã hóa protein phụ hỗ trợ vận chuyển tiền protein

Hình 1.5 Sơ đồ sinh tổng hợp bacteriocin lớp II [18]

Đa số quá trình sinh tổng hợp bacteriocin được điều hòa bởi cơ chế cảm biến định mức (quorum-sensing mode of regulation) thông qua trung gian các yếu tố cảm ứng (Induction factor: _IF), sensor kinase (HPK), và nhân tố điều hòa đáp ứng (Respone regulator_RR) [22] Những gen điều hòa thường được tổ chức chung trong một operon, mức độ biểu hiện thấp khi mật độ tế bào thấp Những operon điều hòa có thể được kích hoạt bằng sự hiện diện của một chủng vi sinh đặc biệt, bằng cách điều chỉnh môi trường hoặc sự tăng lên gấp nhiều lần của các IF Khi mật độ tế bào đạt đến một giá trị nhất định (cơ chế cảm biến định mức), các IF sẽ kích hoạt gen điều hòa bằng chuỗi phản ứng phosphoryl hóa thông qua trung gian HPK Kết quả các RR liên kết với các promoter điều hòa để khởi động các gen xác định, dẫn đến kích hoạt

sự sinh tổng hợp bacteriocin [22]

Những nghiên cứu về hệ thống điều hòa sẽ hỗ trợ việc xây dựng vector, và biểu hiện protein Ngoài việc phụ thuộc vào mật độ tế bào, sự sinh tổng hợp các bacteriocin còn được điều chỉnh theo nhiệt độ, thành phần môi trường nuôi cấy, pH Thông thường sự sinh tổng hợp bacteriocin liên quá đến quá trình sinh trưởng, và kết thúc

cuối pha sinh trưởng Tuy nhiên, quá trình sinh trưởng tốt không đồng nghĩa sự sinh tổng hợp bacteriocin diễn ra ở nồng độ cao Một số trường hợp, bacteriocin được sinh tổng hợp nhiều hơn khi tế bào trải qua các điều kiện khắc nghiệt, dẫn đến tốc độ sinh trưởng và mật độ tế bào thấp, nhưng hoạt tính bacteriocin được tăng cao [24]

So với lantibiotic hiện tượng miễn nhiễm ở vi sinh vật ở các bacteriocin lớp II lại đơn giản hơn Một gen mã hóa cho một protein kháng, khoảng 50 – 150 amino acid [52] Nhưng quá trình vận chuyển lại đòi hỏi phức hợp ABC đặc biệt, có đầu leader

N khoảng 150 amino acid, có khả năng phân giải protein đặc hiệu Phức hợp nhận biết và cắt peptide leader tại vị trí glycine kép và vận chuyển bacteriocin có hoạt tính

ra khỏi màng tế bào Quá trình này cần sự tham gia các protein phụ hỗ trợ

Hình 1.6 Protein vận chuyển ABC có vùng liên kết protease ở đầu N [18]

b Cơ chế tác động

Cơ chế tác động của các bacteriocin gồm 3 bước chính: đầu tiên bám lên màng nguyên sinh chất, sau đó phân tử bacteriocin được chèn vào màng tế bào cuối cùng hình thành phức hợp lỗ, làm màn thấm và mất động lực proton và dẫn đến chết tế bào [43]

Một số bacteriocin lớp II (lactococcin A, Lactococcin G, lactafin F) cần các receptor đặc hiệu trên màng để hình thành liên kết, đó có thể là hệ thống phosphotransferase đặc hiệu mannose (PTS), hay các phân tử protein đặc hiệu Các receptor đóng vai trò như những phân tử cập bến (như trường hợp lipid II trên màng một số chủng vi sinh vật đối với nisin) giúp ổn định sự tạo lỗ của các bacteriocin [26] Bacteriocin ức chế các vi sinh vật đích không tương đồng nhau, ngoài thành phần phospholipid trên màng tế bào đích, pH môi trường cũng ảnh hưởng đến giá trị MIC (minimum inhibitory concentration_nồng độ kháng khuẩn tối thiểu) của bacteriocin [19, 20]

Với một số peptide tích điện dương khác, nồng độ peptide gây mất thế khử của màng có thể chưa gây chết tế bào do đó không tương đồng với giá trị MIC Ngoài cơ chế tạo lỗ, bacteriocin lớp II có khả năng ức chế sự tạo màng ở vi sinh vật nhạy cảm

1.1.2.3 Lớp III các protein lớn và lớp IV bacteriocin vòng

Lớp III bao gồm các protein kích thước > 10 kDa (hầu hết bacteriocin của vi khuẩn Gram dương < 10kDa) Các protein của lớp này bền nhiệt, một số đại diện như

Helveticin J từ chủng: Lb helviticus, Streptococcin A-M57 từ chủng S pyogenes

Lớp IV là những peptide sinh tổng hợp bởi ribosome, trong quá trình chỉnh sửa, amino acid đầu tiên và cuối cùng của chuỗi peptide liên kết lại với nhau bằng liên kết cộng hóa trị

Trước đây, số lượng bacteriocin vòng sinh tổng hợp bởi các chủng LAB được ghi nhận không nhiều, nhưng sự phát hiện các bacteriocin này ngày càng phổ biến Bacteriocin vòng được quan tâm vì tính ổn định và hoạt tính kháng khuẩn cao, có khả năng tạo thành một thế hệ chất bảo quản sinh học mới Trong đó, gasserin A, garvicin

ML, lactocylin Q và leucocylin Q được sản xuất từ các chủng LAB kháng được nhiều

vi khuẩn Gram dương gây bệnh ở thực phẩm [37]

Tính bền và hoạt tính của nhóm được cho là xuất phát từ sự đóng vòng ở đầu và đuôi peptide, giúp bacteriocin tăng khả năng kháng protease và bền nhiệt Garvicin

từ vịt cổ xanh Leucocylin Q, sinh tổng hợp từ chủng Leuconostoc mesenteroides TK

41401, được phân lập từ cải chua của Nhật, có khả năng kháng B coagulans, là chủng

gây nhiễm chủ yếu trong thực phẩm chua lên men [37]

Cơ chế tác động của bacteriocin vòng cũng được quan tâm nghiên cứu, Đáng lưu

ý, trong lĩnh vực này, Liu và cộng sự (2014) cho rằng liều gây chết của carnocyclin

A làm giảm phản ứng thích nghi của chủng L monocytogenes 08-5923 bằng cách tác

động đến gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp màng tế bào và các gen duy trì các hoạt động trao đổi chất [37]

1.1.3 Phổ kháng khuẩn và đặc điểm lý hóa của bacteriocin

Đa số các lantibiotic có phổ kháng khuẩn tương đối rộng, có thể ức chế các vi

khuẩn Gram dương như L monocytogens, Staphylococcus aureus Ngăn cản sự phát triển của các chủng hình thành bào tử như B cereus và Clostridium botulinum So

với lớp I, bacteriocin lớp II nhìn chung có phổ kháng khuẩn hẹp hơn Một số khác

như pediocin PA-1 với phổ rộng có thể ức chế các chủng S aureus, Clostridium spp

Đặc biệt nhiều bacteriocin lớp II như pediocin PA-1, enterocin A, sakacin P, curvacin

A ức chế các chủng Listeria như: L monocytogenes, L innocua, L ivanovii [31]

Do bản chất protein nên việc sử dụng bacteriocin có nhiều thuận lợi hơn các kháng sinh khác Bacteriocin không gây độc, thường nhạy cảm với các enzyme phân giải protein như trypsin Hoạt động của bacteriocin có thể được điều khiển bởi nhóm enzyme này, cũng như dễ dàng bị tiêu hóa bởi các enzyme tiêu hóa hạn chế tác động đến hệ vi sinh vật đường ruột [18]

Nhiệt độ và pH của môi trường ảnh hưởng đến hoạt tính bacteriocin Nhiệt độ tác động đến độ bền cấu trúc của các phân tử peptide, pH tác động đến điện tích và độ tan của bacteriocin Bacteriocin thường bền hơn ở pH acid (5-6) [31], hoạt tính thường được duy trì ổn định ở nhiệt độ cao trong khoảng 15 – 30 phút thích hợp cho các điều kiện chế biến và bảo quản thực phẩm [18]

Hiện nay đặc điểm và phổ kháng khuẩn của bacteriocin có thể được cải thiện thông qua sự hỗ trợ của các công cụ di truyền [24, 37] Sự nhạy cảm với nhiệt độ, pH, enzyme của một số bacteriocin từ LAB được trình bày ở bảng 2, phụ lục 1

1.1.4 Ứng dụng của bacteriocin và tình hình nghiên cứu trong ngoài nước

1.1.4.1 Những nghiên cứu ứng dụng trên thế giới

Bacteriocin và những chủng sinh tổng hợp bacteriocin có nhiều khả năng ứng dụng như chất bảo quản sinh học cho nhiều loại thực phẩm như: sữa và những sản phẩm từ sữa, thịt tươi sống, thịt qua chế biến, thịt gia cầm, thịt lên men, cá, cá lên men, rau củ tươi sống, rau củ lên men, nước trái cây…[18, 27]

Bacteriocin sinh tổng hợp từ LAB có những đặc điểm nổi bật về tính an toàn: LAB

có lịch sử ứng dụng lâu dài và an toàn trong thực phẩm LAB và những sản phẩm trao đổi chất, bao gồm bacteriocin, được xem là an toàn cho sử dụng (GRAS_Generally Recognized as Safe) Bacteriocin của chủng LAB không độc cho tế bào Eukaryotic,

có bản chất protein, được cho là sẽ bất hoạt bởi các protease của hệ tiêu hóa, không ảnh hưởng lớn đến hệ vi sinh vật đường ruột [52]

Bên cạnh đó, bacteriocin còn có những đặc tính riêng biệt về ứng dụng do bản chất protein: một số bacteriocin thể hiện hoạt tính kháng khuẩn rộng bao gồm các chủng gây bệnh và gây hư hỏng thực phẩm, đặc biệt là các chủng Gram dương Bacteriocin

có khả năng kết hợp với các kháng khuẩn khác Cơ chế tác động riêng biệt: lên màng

tế bào, tránh gây tình trạng kháng kháng sinh chéo với những kháng sinh đang sử dụng trong y tế Hoạt tính ổn định dưới điều kiện nhiệt độ, pH được sử dụng khi chế biến nhiều loại thực phẩm Đặc điểm di truyền thường được mã hóa bởi cụm gen trên plasmid, thuận tiện cho các thao tác di truyền và tạo những chủng sinh tổng hợp có đặc tính cải thiện Mặc dù có rủi ro đi kèm về tính ổn định của khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng được thiết kế khi mất đi plasmid tái tổ hợp [37]

Do đó, ứng dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm có những điểm thuận lợi như sau:

- Giảm nguy cơ tạp nhiễm chéo trong chuỗi sản xuất thực phẩm

- Cải thiện thời gian bảo quản của sản phẩm, bảo vệ thực phẩm trong những điều kiện nhiệt độ nhạy cảm

- Giảm thiệt hại về kinh tế do thực phẩm hư hỏng gây ra, giảm lượng chất bảo quản hóa học sử dụng trong thực phẩm

- Giảm những tác động mạnh của các phương pháp vật lý trong quá trình chế biến, lưu giữ nhiều giá trị dinh dưỡng, giảm chi phí chế biến

- Có khả năng là chất bảo quản cho thế hệ thực phẩm mới: ít acid, nồng độ muối thấp…

- Đáp ứng nhu cầu tiêu dùng về thực phẩm tươi sống và sẵn sàng sử dụng (Ready

to eat_RTE) Sở hữu nhiều tiềm năng trong thị trường chất bảo quản có nguồn gốc tự nhiên, thực phẩm chức năng, dược thực phẩm (nutraceuticals) [24]

Có hai cách chính ứng dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm, bao gồm: ứng dụng bacteriocin ở dạng chế phẩm, hoặc ứng dụng các chủng sinh tổng hợp bacteriocin như chủng giống khởi động hoặc kết hợp

Bacteriocin chế phẩm: thu nhận bằng cách lên men chủng sinh tổng hợp bacteriocin trong điều kiện môi trường phù hợp, sau đó ức chế vi sinh vật bằng nhiệt

độ, ly tâm, và cô đặc bằng quá trình sấy thăng hoa, sấy phun, để tạo sản phẩm bột có hoạt tính Những sản phẩm thương mại như: NisaplinTM, AltaTM, MicrogardTM, một

số bacteriocin khác cũng được thu nhận ở dạng bột như: lacticin 3147; eneterocin AS-48 [24]

Bacteriocin tinh sạch: bằng phương pháp truyền thống như tủa peptide bằng cách

bổ sung muối nồng độ cao vào dịch nuôi cấy, hay những phương pháp hiện đại như: sắc ký trao đổi ion, trích ly, lọc gel, sắc ký đảo pha Tùy mức độ tinh sạch có thể áp dụng các phương pháp lọc gel và sắc ký đảo pha để tinh sạch bacteriocin Các cột sắc

ký được sử dụng dựa trên đặc tính tích điện và kị nước của bacteriocin, thường sử dụng là: SP (Sulfopropyl)-Sepharose hoặc CM (carboxymethyl)-Sephadex Các phương pháp này thu nhận bacteriocin có mức độ tinh sạch cao và thường được sử

dụng và nghiên cứu, tuy nhiên có nhược điểm là tốn thời gian và mức độ thu nhận peptide thấp, không thích hợp sử dụng quy mô lớn

Một phương pháp đơn giản tiết kiệm được mô tả bởi Yang và cộng sự (1992), trong đó pediocin AcH, nisin, sakacin A và leuconocin Lcm 1 được hấp phụ lên tế bào sản xuất ở pH 5-7 và giải hấp ở pH acid Dựa trên nguyên tắc: các bacteriocin hầu như sẽ được hấp phụ lên màng tế bào vi sinh vật trong khoảng pH nhất định Trong phương pháp này tế bào vi sinh được ức chế bằng cách xử lý nhiệt và pH được điều chỉnh về pH acid (pH 2) để giải phóng bacteriocin [55]

Hiện nay, sấy phun và sấy thăng hoa là hai quy trình được áp dụng để tạo chế phẩm bacteriocin dạng bột Quá trình sấy phun tuy đơn giản dễ thực hiện, nhưng gánh nặng

sử dụng nhiệt độ cao trong công đoạn sấy có thể gây mất hoạt tính bacteriocin Sấy thăng hoa đòi hỏi quy trình phức tạp hơn, yêu cầu năng lượng lớn, nhưng được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp, có nhiều khả năng duy trì hoạt tính của chế phẩm,

và tạo được chế phẩm với độ ẩm thấp, phù hợp cho việc bảo quản lâu dài [40] Ngoài ra, chủng sinh tổng hợp bacteriocin, sẵn sàng cho quá trình nuôi cấy, tạo bacteriocin, có thể được áp dụng làm chủng giống khởi động trong thực phẩm lên men nếu chúng đáp ứng những đặc điểm kỹ thuật Hoặc các chủng này sẽ được sử dụng như chủng kết hợp khi chủng giống khởi động không bị ảnh hưởng bởi bacteriocin Ngoài ra, cũng có thể áp dụng đối với các sản phẩm không lên men, nếu không ảnh hưởng đến cảm quan sản phẩm

Tiêu chuẩn ứng dụng bacteriocin: có nhiều tiêu chuẩn, phụ thuộc vào từng ngành thực phẩm cụ thể, cách áp dụng bacteriocin, hệ thống pháp luật của mỗi nước Liên quan đến nhiều hệ thống luật khác: dán nhãn, bao bì, xuất khẩu, và sinh vật biến đổi gen (GMO_Genectically modified organisms) Ví dụ, nisin được thông qua như chất bảo quản thực phẩm (E234), được đánh giá an toàn khi sử dụng trong thực phẩm, được sử dụng trên nhiều quốc gia khác nhau [52], liều lượng sử dụng có sự khác biệt

rõ giữa quy định của các nước Nisin dưới dạng thương mại NisaplinTM, và ChrisinTM,

là những sản phẩm được thu nhận từ quá trình sấy thăng hoa của dịch lên men

1.1.4.2 Những nghiên cứu ứng dụng trong nước

Ở nước ta, quá trình nghiên cứu bacteriocin của các chủng LAB đã thu được một

số kết quả như sau:

Trong năm 2008 -2009, Nguyễn Thị Đà và cộng sự, đã thực hiện những nghiên cứu về đặc điểm sinh học của các chủng lactic sinh tổng hợp bacteriocin, nhằm ứng dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm, đồ hộp, sữa tươi, nước giải khát, các sản phẩm lên men và không lên men khác Nhóm tác giả cũng đã tiến hành xác định một

số tính chất của bacteriocin được tổng hợp bởi vi khuẩn lactic phân lập từ sữa bò tươi Bacteriocin được sinh tổng hợp thể hiện tính bền nhiệt, bền acid, nhạy cảm với trypsin, kích thước protein khoảng 3,3 kDa Tuy nhiên, phổ kháng khuẩn của bacteriocin khá

hẹp và không thể hiện ức chế E coli [1, 10]

Trong hướng nghiên cứu khác, năm 2008 Nguyễn Thúy Hương và cộng sự đã cố

định tế bào vi khuẩn Lactococcus lactic trên chất mang cellulose vi khuẩn (Bacterial

Cellulose- BC) Nghiên cứu hướng đến ứng dụng: lên men thu nhận bacteriocin và bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu Hiệu quả sử dụng chế phẩm tế bào vi khuẩn cố định trên BC để lên men thu nhận bacteriocin khá cao: có thể tái sử dụng 9-10 lần mà vẫn đảm bảo về mặt thời gian lên men, số lượng và chất lượng bacteriocin so với đối chứng Có thể bảo quản thịt tươi đến 3 ngày bằng màng BC hấp thụ dịch bacteriocin

200 AU/mL vẫn đảm bảo chất lượng thịt [3]

Năm 2009, Lâm Xuân Uyên và cộng sự, đã lên men nuôi cấy bổ sung theo đợt (fed-batch) để thu nhận hợp chất kháng khuẩn bacteriocin, kết hợp với dùng màng

BC hấp phụ nisin bảo quản lòng đỏ trứng muối (điều kiện hấp thụ: 12,5oC, 45 phút, chế độ lắc 180 vòng/phút) Kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu trứng muối có thể được bảo quản 30 ngày vẫn duy trì chất lượng [11]

Với mong muốn tạo ra các chủng vi khuẩn tái tổ hợp, có khả năng sinh bacteriocin hoạt tính cao, phổ kháng khuẩn rộng, an toàn, thuận lợi cho quá trình lên men và thu nhận bacteriocin Nhóm tác giả Trần Ngọc Tân (2008 -2009) đã nghiên cứu sinh tổng hợp thành công enterocin AS-48 (là một một cấu trúc peptide gồm 70 amino acid, có

phổ kháng khuẩn rộng, được sinh tổng hợp bởi chủng Enterococcus faecium, E faecalis, E mundtii) trên tế bào E coli ở dạng vòng và dạng thẳng, hướng đến khả

năng sử dụng enterocin như một chất bảo quản thực phẩm có nguồn gốc sinh học [8, 9] Cùng với hướng nghiên cứu này, năm 2010, Nguyễn Thanh Nhàn và cộng sự đã

tái tổ hợp thành công vector biểu hiện enterocin P của chủng E faecium P13 trên vi khuẩn Bacillus 168 Enterocin P tái tổ hợp thể hiện hoạt tính ức chế S aureus, B cereus, tuy nhiên mức độ biểu hiện còn thấp [7]

Năm 2013 Quách Đức Tính và cộng sự đã tiến hành phân lập, khảo sát, và sàng lọc chủng LAB từ hạt Kerfir có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin cao Nhóm tác

giả, đã sàng lọc và định danh thành công Lactobacillus acidophilus Bacteriocin của

chủng này bước đầu cho thấy khả năng kháng khuẩn trên cả vi khuẩn Gram dương

(Bacillus sp.) và vi khuẩn Gram âm (Salmonella sp.), có tính bền pH (khoảng pH

2-12) và nhiệt độ (25 ÷ 60oC trong 60 phút xử lý), nhạy cảm với enzyme protease, và vẫn giữ tính kháng khuẩn khi xử lý với các enzyme lipase,  amylase Nhóm tác giả đồng thời tiến hành khảo sát điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường nhằm nâng

cao khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng Lactobacillus acidophilus Kết quả

khảo sát ghi nhận: bacteriocin sinh tổng hợp trên môi trường MRS bổ sung 4 % cao

nấm men có hoạt tính kháng khuẩn 3555 AU/mL đối với Bacillus subtilis UCC 118

[5, 6] Năm 2015, Nguyễn Thị Nam Phương và cộng sự đã tiến hành tối ưu hóa điều

kiện sấy phun để tạo chế phẩm bacteriocin dạng bột từ chủng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Ở chế độ sấy: lưu lượng nhập liệu 4,67 mL/phút, nhiệt độ sấy 153,6oC, nồng độ chất khô thích hợp nhất của dịch là 15,1 Bx hoạt tính chế phẩm bacteriocin dạng bột đạt được cao nhất 202,208 UI/mL [4]

1.2 Rau sống và mối nguy vi sinh

Sự gia tăng nhận thức của người tiêu dùng về ảnh hưởng của thực phẩm đến sức khỏe đã đặt ra nhu cầu rất lớn về những thực phẩm trải qua quá trình sơ chế tối thiểu,

mà ở đó những chất bảo quản hóa học được thay thế bởi những chất bảo quản tự nhiên

và không ảnh hưởng đên sức khỏe người tiêu dùng

Rau sống là tên gọi chung của các loại rau và lá, xuất hiện từ lâu trong khẩu phần của người châu á, với nhiều giá trị dinh dưỡng, rau sống, rau mầm trờ thành xu hướng

ẩm thực ở khắp nơi Rau sống với hàm lượng chất dinh dưỡng cao, không bị mất đi

do quá trình chế biến nhiệt có thể đêm đến nhiều lợi ích sức khỏe như: tăng sức đề

kháng, phòng ngừa bệnh tật, tốt cho tim mạch, hỗ trợ tiêu hóa…

Hiện nay cùng với xà lách xoong, rau muống, cải bẹ xanh, rau đắng, rau tần ô, rau

xà lách là loại rau ăn sống phổ biến trong nhiều bữa ăn của gia đình Việt Xà lách chứa ít chất béo bão hòa, natri, cholesterol, các vitamin A, B6, thiamin, folate, và các khoáng chất khác như sắt, kali, mangan, canxi, magie, phốt pho…

Được đánh giá là một thành phần quan trọng trong bữa ăn cân đối, giữ gìn sức khỏe Tuy nhiên, việc tiêu thụ rau sống lại gặp phải những mối nguy vi sinh xuất phát

từ tập quán chăn nuôi như vấn đề sử dụng nước, phân bón và đất ở nhiều mô hình trang trại không được kiểm soát Một khảo sát về tập quán canh tác và tình hình ô nhiễm vi sinh vật đường ruột ở các vùng chuyên canh rau thuộc một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long cho thấy: tập quán canh tác của nông dân có thể gây ô nhiễm

trên đất nước và rau, các mẫu đất nước và rau đều nhiễm Coliforms, E coli và thậm chí phát hiện Salmonella [2] Do không qua chế biến, xử lý nhiệt các mối nguy vi

sinh này thật sự đe dọa trực tiếp đến sức khỏe, thậm chí có nguy cơ ảnh hưởng đến tính mạng của người tiêu dùng

Nhiều ghi nhận về các đợt bùng phát E coli 0157:H7 và các vi khuẩn gây bệnh

trên rau sống, đặc biệt là xà lách đã đặt ra nhiều quan ngại về vệ sinh, và quá trình kiểm soát vệ sinh nông trại Mặc dù rau mầm được xem là nguồn thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao và có nhiều lợi ích cho sức khỏe Nhưng nhóm rau này cũng được

xem là phương tiện truyền nhiễm của các nhóm vi khuẩn gây bệnh như Salmonella,

E coli 015:H7, và B cereus [27]

Ngoài ra, các nhóm rau sống và rau củ chế biến sẵn, cần được hỗ trợ của quá trình bảo quản để giữ rau tươi và tránh hư hỏng Một số kỹ thuật bảo quản được sử dụng như: đóng gói chân không, lưu trữ nhiệt độ thấp, đóng gói điều chỉnh không khí (MAP), để kéo dài thời gian bảo quản Nhưng các phương pháp này vẫn không giúp

kiểm soát các mối nguy vi sinh Như trường hợp Salmonella, vì hiện diện trong hệ tiêu hóa của người và động vật nên Salmonella có thể xâm nhiễm trong quá trình xử

lý chế biến Mặc dù có sự xâm nhiễm, nhưng khả năng tồn tại phát triển và gây bệnh của các chủng này còn phụ thuộc vào các yếu tố: hệ vi sinh có trên rau quả, tương tác giữa các hệ vi sinh, phản ứng thích nghi đối với điều kiện bảo quản và sơ chế tối thiểu

Mật độ Salmonella trên một số mẫu rau có thể phát triển đến 106 CFU/g tùy thuộc

vào điều kiện bảo quản: Salmonella được ghi nhận vẫn có thể phát triển trên rau củ ở

điều kiện bảo quản 7 ÷ 15oC [45]

Bảng 1.2 liệt kê các mối nguy vi sinh thường gặp trên rau, trong đó E coli là vi sinh vật gây bệnh có mặt trên nhiều loại rau sống E coli thường có mặt trong chất thải động vật, dễ xâm nhiễm vào các nguồn nước tưới ao, sông, hồ E coli 0157:H7

có thể gây nhiễm trùng nặng đường ruột, gây nguy hiểm đến tính mạng đối với trẻ

em, người lớn tuổi, những người có hệ miễn dịch suy yếu Tương tự E coli, trực khuẩn đường ruột Salmonella có thể xâm nhiễm vào rau từ môi trường canh tác Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể chủ yếu bằng đường ăn uống Salmonella có khả năng

sinh nội độc tố và ngoại độc tố Ngoại độc tố tác động vào vào hệ tiêu hóa gây tiêu

chảy, ở một số loài có khả năng ly giải, giải phóng nội độc tố gây hôn mê, co giật…B cereus, là trực khuẩn Gram dương có khả năng tạo bào tử và sinh độc tố, thường xâm nhiễm vào thực phẩm, rau quả từ đất trồng B cereus có thể sinh 2 loại độc tố: độc tố tiêu chảy và độc tố nôn mửa, các độc tố có tính ổn định cao ở nhiệt độ và pH S aureus là những tụ cầu khuẩn, có mặt phổ biến trong thiên nhiên Vi khuẩn có thể

xâm nhiễm vào thực phẩm trong quá trình vận chuyển, bảo quản chế biến không hợp

lý S aureus sinh độc tố có các tính chất ngộ độc khác nhau Tụ cầu phát triển trên

thực phẩm sinh ngoại độc tố, là nguyên nhân gây ngộ độc thức ăn

Bảng 1.2 Một số mối nguy vi sinh trên rau sống

- Nhẹ: đau bụng tiêu chảy, sốt

- Nặng: suy thận, ảnh hưởng tính mạng

Salmonella sp

Trực khuẩn đường ruột, Gram âm

Đất trồng, Phân bón, nước tưới

- Sinh ngoại độc tố, tiêu chảy ngộ độc thực phẩm

- Nội độc tố, hôn mê, co giật, xung huyết

Staphylococcus

aureus

Tụ cầu khuẩn, Gram dương

Vận chuyển, bảo quản, chế biến không hợp lý

Sinh độc tố, gây ngộ độc thực phẩm Độc tố bền nhiệt, chịu pH và cồn

B cereus

Trực khuẩn, Gram dương, tạo bào tử

Thường nhiễm từ đất trồng

Sinh độc tố gây các hiện tượng ngộ độc thực phẩm: tiêu chảy nôn mửa, có thể nguy hiểm đến tính mạng

Sử dụng hóa chất rửa rau, nước chlorine không đáp ứng nhu cầu ngày càng cao về tiêu thụ sản phẩm tự nhiên, an toàn, và thân thiện Một số phương pháp tự nhiên khác như sử dụng tinh dầu thực vật và chất kháng oxi hóa từ mật ong… không cho thấy hiệu quả thực sự trong việc ức chế các chủng vi sinh vật gây bệnh Nhiều tinh dầu thực vật, và các thành phần hydrogen peroxide, các hợp chất phenol trong mật ong

có khả năng làm giảm tốc độ phát triển của các vi sinh vật gây bệnh ở pha lag Nhưng

hầu hết các thí nghiệm ngừng lại ở các bước khảo sát in vitro và các tác giả cho rằng

cần một nồng độ rất cao để phát huy tác dụng kiềm hãm vi khuẩn gây bệnh khi ứng dụng trên mẫu thực tế [28]

Bacteriocin và những chủng sản sinh bacteriocin có thể được ứng dụng trên rau để

ức chế và kiểm soát các chủng vi khuẩn gây bệnh Dựa trên cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng những chủng không độc được sử dụng để ức chế sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình tạo mầm Sự phân lập hệ vi sinh vật tự nhiên trên rau có khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh đã được nghiên cứu Các chủng LAB cho thấy khả năng ức chế hiệu quả sự sinh trưởng của các vi sinh vật gây bệnh trên rau sống chủng

lactococci được phân lập từ giá có khả năng giảm mật độ L monocytogenes trong

quá trình bảo quản lạnh [28]

Ứng dụng bacteriocin dạng chế phẩm được xem là giải pháp thay thế hợp lý để hạn chế các vấn đề trong xử lý bacteriocin từ các chủng LAB ở rau quả Không có nghiên cứu cho thấy bacteriocin có tác dụng phụ đối với rau nên có thể được ứng dụng để xử lý tạp nhiễm ở rau quả Ngoài ra, một số bacteriocin có thể ức chế sự phát triển trở lại của những chủng vi khuẩn gây hại trong thời gian bảo quản [14]

Bacteriocin có thể kết hợp với sodium lactate, potassium sorbate, phytic acid, citric acid để giảm mật độ vi khuẩn gây bệnh có mặt trên rau cải bắp, bông cải giá đỗ Chỉ sau 1 phút rửa qua hỗn hợp nisin và phytic acid, hoặc hỗn hợp nisin, pediocin và

phytic acid có thể gây giảm đáng kể L monocytogenes có mặt trên cải bắp, bông cải Enterocin AS-48 làm giảm mật độ các chủng gây bệnh S aureus, B cereus ở xà lách

Măng tây được ngâm trong AS-48 có thể làm giảm lượng vi khuẩn gây bệnh, tác dụng diệt khuẩn giúp giảm sự phát triển trở lại của vi khuẩn trong quá trình bảo quản [14]

Tóm tại, rau sống là nguồn thực phẩm quan trọng có rất nhiều giá trị dinh dưỡng, nhưng đặc thù không qua chế biến xử lý nhiệt, rau có thể trở thành phương tiện lây nhiễm của các vi sinh vật gây bệnh Nhu cầu về một giải pháp an toàn kiểm soát hiệu quả mối nguy vi sinh trên rau là thực tế và cần thiết Dựa trên quá trình ứng dụng lâu dài, tính an toàn và cơ chế diệt khuẩn, bacteriocin có thể đáp ứng nhu cầu về một phương pháp sinh học, thân thiện, giúp kiểm soát hiệu quả mối nguy vi sinh ở rau