Bước đầu khảo sát quá trình phát sinh bệnh (pathogenesis) của virus đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) trên tôm sú (Penaeus mondon) sử dụng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn

Bước đầu khảo sát quá trình phát sinh bệnh (pathogenesis) của virus đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) trên tôm sú (Penaeus mondon) sử dụng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

* * * * * * *

PHẠM MINH NHỰT

BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT

QUÁ TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA VIRUS ĐỐM TRẮNG

TRÊN TÔM SÖ (Penaeus monodon) BẰNG MÔ HÌNH GÂY

NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN VÀ PHƯƠNG PHÁP HÓA MÔ MIỄN DỊCH

LUẬN VĂN KỸ SƯ

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

* * * * *

BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT

QUÁ TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA VIRUS ĐỐM TRẮNG

TRÊN TÔM SÖ (Penaeus monodon) BẰNG MÔ HÌNH GÂY

NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN VÀ PHƯƠNG PHÁP HÓA MÔ MIỄN DỊCH

LUẬN VĂN KỸ SƯ

CHUYÊN NGÀNH:CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING

NONG LAM UNIVERSITY, HCMC

TIGER SHRIMP (Penaeus monodon)

GRADUATION OF THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY

Professor: Student:

HCMC, 8/2006

iv

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn:

BGH Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM và các thầy cô ở Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo mọi điều kiện để chúng em học tập tốt, đã tận tình giúp đỡ, quan tâm đến việc học tập của chúng em trong suốt 4 năm qua và đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để chúng em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

TS Nguyễn Văn Hảo, ThS Ngô Xuân Tuyến, CN Đoàn Văn Cường đã tận tình chỉ bảo, giải đáp các vướng mắc, các khó khăn mà tôi gặp phải trong suốt quá trình thực tập, giúp tôi hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này

KS Phạm Thị Tuyết Anh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài

TS Lý Thị Thanh Loan đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình thực tập tại Viện

Các anh chị ở phòng Mô học tại Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, Thành Phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài

Các anh chị ở phòng Sinh Học Thực Nghiệm và Trại thực nghiệm Thủy Sản Thủ Đức đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành quá trình bố trí thí nghiệm

Bạn Trần Thị Ánh Nguyệt và các bạn thân yêu ở lớp Công Nghệ Sinh Học 28 đã cùng tôi chia sẻ những cảm xúc vui buồn trong thời gian học tập và giúp đỡ, động viên tôi để tôi hoàn thành khóa luận này

Và con vô cùng biết ơn cha mẹ và những người thân trong gia đình đã luôn động viên, giúp đỡ con để con có thể hoàn thành khóa luận này

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006 Sinh viên thực hiện

Phạm Minh Nhựt

v

TÓM TẮT

PHẠM MINH NHỰT - Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8/2006 “BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA VIRUS ĐỐM

TRẮNG TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM

THỰC NGHIỆM CHUẨN VÀ PHƯƠNG PHÁP HÓA MÔ MIỄN DỊCH” Giáo viên hướng dẫn:

TS NGUYỄN VĂN HẢO ThS NGÔ XUÂN TUYẾN

Bệnh đốm trắng do virus đốm trắng (WSSV) gây ra là nguyên nhân gây chết hàng loạt đối với tôm sú nuôi lẫn tôm tự nhiên tại Việt Nam và trên thế giới Các nghiên cứu về quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng trên tôm hiện nay rất ít Do đó việc hiểu rõ hơn về quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng sẽ giúp cho việc tạo ra những phương thức kiểm soát bệnh Kết hợp mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn và phương pháp hóa mô miễn dịch trên tôm sú không mang các virus thông thường nhằm xác định vị trí xâm nhập đầu tiên của virus đốm trắng, phân tích sự xâm nhiễm và tìm ra nguyên nhân gây chết trên tôm

Tiến trình thí nghiệm được thực hiện như sau: tôm không mang các virus thông thường được gây nhiễm bằng cách tiêm vào phần cơ với liều thấp (101,5 SID50/ml) và liều cao (104,0

SID50/ml) Ở mỗi liều gây nhiễm, tiến hành thu mẫu theo từng thời điểm sau khi gây nhiễm Sử dụng phương pháp hóa mô miễn dịch để khảo sát các mẫu theo từng thời điểm nhằm khảo sát quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng trên tôm sú

Các kết quả thu được:

Các biểu hiện lâm sàng của tôm thí nghiệm bị nhiễm bệnh: hoạt động bất thường, bỏ ăn, đỏ thân, xuất hiện đốm trắng, hấp hối và chết, được phát hiện vào thời điểm 36 giờ ở liều thấp và 24 giờ ở liều cao

Vị trí xâm nhập đầu tiên của virus đốm trắng trên tôm sú ở liều thấp xảy ra vào thời điểm 12 giờ sau khi gây nhiễm với tỷ lệ tôm bị nhiễm đốm trắng tại thời điểm này là 33,3 % và cơ quan xâm nhiễm đầu tiên của chúng là các tế bào của tim với cường độ nhiễm là (+)

vi

Ở liều cao, các cơ quan phát hiện dương tính với virus đốm trắng vào thời điểm 12 giờ sau khi tiêm sau khi nhuộm bằng hóa mô miễn dịch Tỷ lệ tôm bị nhiễm đốm trắng tại thời điểm này là 50 % Và cơ quan xâm nhiễm đầu tiên của virus đốm trắng ở liều cao là các tế bào của tim, mô tạo máu, mang, tuyến anten và các tế bào của màng bao bên ngoài gan tụy với cường độ nhiễm thấp (+)

Ở thời điểm 36 giờ sau khi gây nhiễm và ở cả 2 liều gây nhiễm tất cả các cơ quan đều bị nhiễm virus đốm trắng

Cường độ nhiễm virus đốm trắng trên các cơ quan khi gây nhiễm với liều cao và liều thấp có sự khác biệt trên các cơ quan lymphoid, mang, ruột trước, tuyến anten, dạ dày, biểu mô dưới vỏ và mô liên kết của màng bao gan tụy

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Đặc điểm sinh học của hệ miễn dịch tôm sú 3

2.1.1 Miễn dịch không đặc hiệu của giáp xác 3

2.1.2 Các tế bào máu tham gia vào đáp ứng miễn dịch của giáp xác 3

2.1.3 Hệ thống hoạt hóa prophenoloxidase 3

viii

2.3.1 Vật liệu gây bệnh 15

2.3.2 Cơ chế gây bệnh 16

2.3.3 Cơ chế lây lan 17

2.4 Mô hình cảm nhiễm chuẩn virus trên tôm 18

2.5 Phương pháp hóa mô miễn dịch 19

2.5.4.2 Phương pháp gián tiếp 22

2.5.4.3 Phương pháp PAP (peroxidase anti – peroxidase method) 23

2.5.4.4 Phương pháp avidin – biotin complex (ABC method) 23

2.5.4.5 Phương pháp đánh dấu Streptavidin Biotin (LASB) 24

PHẦN III: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 25

3.1 Thời gian và địa điểm 25

3.3.1 Tôm và điều kiện thí nghiệm 27

3.3.2 Virus đốm trắng dòng Việt Nam (WSSV-VN) 27

3.3.3 Gây nhiễm virus đốm trắng trên tôm sú 27

3.3.4 Thời gian theo dõi và thu mẫu để khảo sát quá trình phát sinh bệnh 28

ix

3.4 Phương pháp nghiên cứu 28

3.4.1 Phương pháp pha loãng dịch virus 28

3.4.2 Phương pháp thu mẫu tôm 29

3.4.3 Phương pháp nhuộm IHC 30

3.4.4 Xử lý thống kê 34

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

4.1 Độc lực của virus gốc dòng Việt Nam (WSSV-VN) 35

4.1.1 Các dấu hiệu lâm sàng và tỷ lệ gây chết 35

4.1.2 Tỷ lệ nhiễm của tôm thí nghiệm theo từng thời điểm 36

4.2 Khảo sát quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng dòng Việt Nam trên tôm sú 37

4.2.1 Quá trình phát sinh bệnh của WSSV-VN trên tôm sú ở liều gây nhiễm thấp (101,5 SID50/ml) 38

4.2.2 Quá trình phát sinh bệnh của WSSV-VN trên tôm sú ở liều cao (104,0 SID50/ml) 42

4.2.3 So sánh giữa hai liều gây nhiễm về quá trình phát sinh bệnh 46

x

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

WSSV-VN White Spot Syndrome Virus – Việt Nam WSSV-TL White Spot Syndrome Virus – Thailand

LPBP Lipopolysaccharide binding protein

ICTV International Committee on Taxonomy for Virus SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

xi

DANH SÁCH CÁC BẢNG

TRANG

Bảng 2.1: Các dạng bạch cầu của giáp xác và chức năng của chúng 4 Bảng 3.1: Thời gian theo dõi và thu mẫu để khảo sát quá trình phát sinh bệnh 27 Bảng 4.1: Tỷ lệ phần trăm (%) tôm biểu hiện các dấu hiệu lâm sàng ở các thời

điểm sau khi gây nhiễm 34 Bảng 4.2: Tỷ lệ nhiễm của tôm thí nghiệm ở liều cao và liều thấp theo từng

thời điểm 35 Bảng 4.3: Kết quả theo dõi tỷ lệ xâm nhiễm của WSSV-VN trên các cơ quan

khảo sát ở liều thấp (%) 37 Bảng 4.4: Kết quả theo dõi tỷ lệ xâm nhiễm của WSSV-VN trên các cơ quan

khảo sát ở liều cao (%) 41 Bảng 4.5: Tỷ lệ (%) các cơ quan bị nhiễm WSSV-VN theo từng thời điểm khảo sát 46

xii

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1: Tôm bị bệnh đốm trắng 11

Hình 2.2: Hình thái của virus đốm trắng quan sát dưới kính hiển vi điện tử 12

Hình 2.3: Thành phần các protein của virus đốm trắng 13

Hình 2.4: Genome của virus đốm trắng 14

Hình 2.5: Kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng 20

Hình 2.6: Các phương pháp nhuộm IHC 21

Hình 3.1: Hệ thống bể thí nghiệm 26

Hình 3.2: Gây nhiễm virus trên tôm thí nghiệm 27

Hình 3.3: Tiêm dung dịch Davidson vào đầu tôm 28

Hình 3.4: Các giai đoạn thực hiện IHC 29

Hình 3.5: Các giai đoạn xử lý mẫu 30

Hình 3.6: Các bước thực hiện IHC 31

Hình 4.1: Tôm bị nhiễm virus đốm trắng 35

Hình 4.2: Tỷ lệ nhiễm của tôm thí nghiệm ở liều cao và liều thấp theo từng thời điểm 36

Hình 4.3: Các cơ quan khảo sát quá trình phát sinh bệnh của WSSV-VN 37

Hình 4.4: Đồ thị biểu diễn tỷ lệ xâm nhiễm của WSSV-VN trên các cơ quan ở liều thấp 38

Hình 4.5: Các tế bào của các cơ quan bị nhiễm WSSV ở tôm thí nghiệm liều thấp 40

Hình 4.6: Đồ thị biểu diễn tỷ lệ xâm nhiễm của WSSV-VN trên các cơ quan ở liều cao 42

Hình 4.7: Các cơ quan bị nhiễm WSSV ở liều cao sau khi nhuộm IHC 43

Hình 4.8: Đồ thị so sánh tỷ lệ nhiễm trên các cơ quan khảo sát ở liều cao và liều thấp 45

PHẦN I: GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Bệnh đốm trắng (White Spot Disease) do virus gây hội chứng đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) gây ra trên tôm sú nuôi Đây là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho nhóm tôm he, bệnh có sức tàn phá rất lớn, làm tôm chết trong thời gian rất ngắn, gây chết 100 % trong khoảng thời gian từ 3 – 7 ngày (Leong, 2005) và có khả năng lây lan rất nhanh Chính virus này đã làm suy giảm sản lượng tôm hằng năm trên thế giới, gây thiệt đáng kể đến nền kinh tế của nhiều quốc gia trên thế giới, trong đó có Việt Nam

Hiện nay, trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh đốm trắng và WSSV ở nhiều khía cạnh khác nhau như hình thái, cấu trúc, di truyền, các yếu tố nguy cơ xảy ra dịch bệnh, phát triển thuốc, vaccine… Trong khi đó các công trình nghiên cứu về quá trình phát sinh bệnh của WSSV lại rất hạn chế Kết quả của nghiên cứu quá trình phát sinh bệnh ở các mức độ tế bào, phân tử giúp chúng ta hiểu rõ hơn cơ chế tương tác quan trọng của các giai đoạn virus tiếp cận, xâm nhập, nhân bản, hình thành hạt virus bên trong và phát tán ra ngoài tế bào vật chủ Từ những kết quả quan trọng này giúp cho chúng ta tìm ra được các thời điểm hay giai đoạn mấu chốt của quá trình nơi mà chúng ta có thể phát triển các giải pháp can thiệp, ngăn chặn khác nhau (thuốc, vaccine, các yếu tố lý hoá ) Đây cũng là hướng tiếp cận mới cho WSSV do trường đại học Ghent-Bỉ đề xuất, trong đó sử dụng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn và các kỹ thuật nhuộm miễn dịch đặc hiệu sử dụng kháng thể đơn dòng kháng protein VP28 của WSSV để khảo sát quá trình phát sinh bệnh ở các mức độ cơ quan, mô, tế bào và phân tử Với phương pháp này, cho phép chúng ta biết được về quá trình xâm nhiễm của WSSV theo thời gian, tiến trình, mức độ xâm nhiễm của virus ở các cơ quan đích khác nhau Việc nghiên cứu quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng trên tôm sú là rất cần thiết, nó làm nền tảng cho các nghiên cứu chuyên sâu và các thí nghiệm đánh giá độ mẫn cảm của các dòng tôm đối với virus, hay tác dụng của các thuốc, chế phẩm, vaccine trên hệ miễn dịch của tôm đối với việc đề kháng lại virus, đồng thời nhằm phát triển các chiến lược kiểm soát WSSV và sự bùng nổ bệnh đốm

trắng ở các mức độ khác nhau trên tôm sú (ở mức độ cá thể, quần thể, ao nuôi, khu nuôi, khu vực nuôi, vùng nuôi và quốc gia)

Từ cơ sở quan trọng đó, được sự phân công của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học

và sự chấp thuận của Viện Nuôi Trồng Thủy Sản II, tôi đã thực hiện đề tài “Bước đầu khảo sát quá trình phát sinh bệnh (pathogenesis) của virus đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) trên tôm sú (Penaeus mondon) sử dụng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn và phương pháp hóa mô miễn dịch (immunohistochemistry)”

1.2 Mục đích

Thực hiện gây nhiễm thực nghiệm chuẩn virus trên tôm sú sử dụng liều virus

SID50/ml đã được chuẩn độ xác định nhằm khảo sát quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng trên tôm bằng phương pháp hóa mô miễn dịch

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Đặc điểm sinh học của hệ miễn dịch tôm sú 2.1.1 Cơ chế phòng vệ chung của giáp xác

Hệ thống phòng vệ ở động vật được chia thành 2 nhóm chính là miễn dịch thụ động và miễn dịch chủ động Ở giáp xác không có hệ thống miễn dịch chủ động, do đó cơ chế phòng vệ của giáp xác chủ yếu dựa vào đáp ứng miễn dịch thụ động (Jiravanichpaisal, 2005)

Hệ thống phòng vệ thụ động đóng vai trò quan trọng trong sự tồn tại của giáp xác Lớp vỏ bên ngoài là một rào cản vật lý hữu hiệu chống lại sự gắn kết và xâm nhập của các tác nhân gây bệnh Hệ thống phòng vệ của lớp cutin này rất hiệu quả, chống lại các tác nhân gây bệnh và các tác nhân gây bệnh chỉ tạo nên bệnh tích khi lớp vỏ bọc này bị tổn thương Đường tiêu hóa, là con đường chính của sự xâm nhập, được bảo vệ bằng màng chitin Trong ruột có môi trường acid và chứa nhiều enzyme làm bất hoạt và tiêu diệt nhiều loại virus và vi khuẩn Khi các tác nhân gây bệnh vượt qua được các rào cản trên xâm nhập khoang máu của cơ thể vật chủ, chúng vấp phải một cơ chế phòng vệ phức tạp liên quan đến đáp ứng miễn dịch thể dịch và tế bào Đầu tiên, hệ thống prophenoloxidase (proPO) được hoạt hóa tạo nên quá trình melanin hóa và tạo ra các nhân tố liên quan đến phản ứng miễn dịch như peroxinectin Kế tiếp, đáp ứng miễn dịch tế bào ở nhiều loại tế bào máu khác nhau sẽ tham gia vào quá trình tiêu diệt các mầm bệnh bằng cách thực bào các vi sinh vật hay bẫy chúng trong tế bào máu bằng cách đông máu hay tạo khối u hoặc đóng gói các vi sinh vật lớn hơn và các phản ứng độc tế bào Cuối cùng, trong quá trình xâm nhập của vật lạ, một tỷ lệ lớn các phân tử tác động cảm ứng như các peptide kháng khuẩn (AMPs), các nhân tố cần cho quá trình opsonin hóa cũng được tạo ra (Jiravanichpaisal, 2005)

2.1.2 Các tế bào máu tham gia vào đáp ứng miễn dịch của giáp xác

Ở động vật có vú, các loại tế bào máu khác nhau đảm nhiệm các chức năng chuyên biệt khác nhau chủ yếu liên quan đến sự sống của cá thể như sự vận chuyển oxy và sự phòng vệ chống lại sự xâm nhập của vật thể lạ Ở động vật không xương sống, vai trò quan trọng nhất của các tế bào máu là bảo vệ chúng chống lại sự xâm nhập của vật thể lạ (Jiravanichpaisal, 2005) Ở giáp xác, các dạng tế bào máu có thể

được phân biệt dựa trên đặc điểm hình thái và tính chất bắt màu của chúng Tuy nhiên, các tế bào máu của giáp xác chưa đạt đến độ biệt hóa rõ rệt và chưa thể xếp thành các nhóm tế bào máu như ở cá và động vật có xương sống (Đỗ Thị Hòa, 2004) Ở giáp xác thường chứa ba nhóm tế bào máu: hyaline (bạch cầu không hạt), semigranular (bạch cầu bán hạt) và granular (bạch cầu có hạt) (Jiravanichpaisal, 2005; Đỗ Thị Hòa, 2004) với chức năng được tóm tắt ở bảng 2.1

Bảng 2.1: Các dạng bạch cầu của giáp xác và chức năng của chúng

Thực bào Đóng gói Độc tế bào Hoạt hóa proPO

Bạch cầu không hạt có khả năng thực bào, phát hiện được trong máu các loài giáp xác bộ mười chân, nhưng số lượng tương đối của các tế bào này thay đổi tùy theo từng loài (Đỗ Thị Hòa, 2004)

Bạch cầu bán hạt được đặc trưng bởi sự tồn tại của một số hạt nhỏ trong tế bào chất tương tự như bạch cầu có hạt ở động vật có xương sống Các tế bào này phản ứng với các polysaccharide có trong thành phần của vách tế bào vi sinh vật như LPS ở vi khuẩn, -1,3-glucan của nấm Các tế bào này cũng có khả năng đóng gói các hạt ngoại lai (Đỗ Thị Hòa, 2004)

Bạch cầu có hạt đặc trưng bởi các túi hoặc hạt lớn trong tế bào chất Đặc điểm này có lẽ đóng vai trò trong việc sản sinh, dự trữvà tiết ra các hợp chất kháng khuẩn Các bạch cầu có hạt của giáp xác không có khả năng thực bào và khả năng đóng gói các hạt ngoại lai rất hạn chế Vai trò chính yếu của chúng là dự trữ proPO – hợp chất đóng vai trò chính yếu trong đáp ứng bảo vệ của cơ thể giáp xác Khi tiếp xúc với -1,3-glucan, LPS và PG, bạch cầu có hạt tiết và hoạt hóa proPO thành PO – có tác dụng xúc tác phản ứng oxy hóa các hợp chất phenol thành quinone và sản phẩm cuối cùng là melanin Quinone và các sản phẩm trung gian của quá trình này là những chất độc đối với vi sinh vật do hoạt tính cao của chúng (Đỗ Thị Hòa, 2004)

2.1.3 Hệ thống prophenoloxidase (proPO)

Động vật không xương sống không có kháng thể, do đó phải dựa vào hệ thống nhận diện không đặc hiệu nhưng chúng vẫn phải nhận biết vật thể lạ và đáp ứng lại nó để bước đầu chống lại và tiêu hủy chúng Quá trình nhận biết các vật thể lạ được thực hiện nhờ hệ thống proPO (Sritunyalucksana, 2001) Hệ thống proPO chứa nhiều loại protein liên quan đến sự phòng vệ miễn dịch ở động vật không xương sống Đó là sự tổng hợp melanin, sự gắn kết tế bào, sự đóng gói và sự thực bào Hệ thống proPO là một hệ thống miễn dịch nhận diện không đặc hiệu cực kỳ hiệu quả và được hoạt hóa bằng sự nhận biết các LPS hoặc PG có ở vi khuẩn và -1,3-glucan có ở nấm Hệ thống chứa một tập hợp proteinase gồm có các protein nhận biết (PRPs), nhiều loại proteinase, các nguồn tạo enzyme và proPO (Lee, 2001)

Dạng hoạt động của proPO, phenoloxidase (PO) nằm trong bạch cầu có hạt (Flegel, 1998), còn được xem như là tyrosinase, có khả năng thực hiện hai phản ứng:

sự khử monophenol thành o – diphenol (hoạt tính monophenoloxidase) và sự oxy hóa của o – diphenol thành o – quinone (hoạt tính diphenoloxidase) Sự tạo ra o – quinone

của PO là bước đầu tiên của chuỗi phản ứng sinh hóa tổng hợp melanin (Lee, 2001) Mặc dù melanin được xem là có hoạt tính kháng khuẩn trực tiếp, nhưng sự tạo ra các sản phẩm trong quá trình oxy hóa như các anion superoxide, các gốc hydroxyl trong quá trình tạo quinoid cũng có một vai trò kháng khuẩn quan trọng Thêm vào đó, các phản ứng sinh học như sự thực bào, đóng gói và tạo khối u cũng được hoạt hóa.(Flegel, 1998)

Hệ thống proPO được hoạt hóa bằng các thành phần thành tế bào vi khuẩn như LPS, -1,3-glucan hay PG, từ đó kích thích sự hoạt hóa của các proteinase trong hệ thống proPO (Lee, 2001) Sau đó dưới điều kiện sinh lý, các protein chuyên biệt của hệ thống proPO cần sự phân cắt của các proteinase này để tạo ra trạng thái hoạt động; hệ thống proPO từ trạng thái bất hoạt với trọng lượng phân tử là 76 kDa được chuyển đổi thành dạng hoạt động có trọng lượng phân tử là 62 kDa bằng enzyme hoạt hóa prophenoloxidase (PPAE) (Sritunyalucksana, 2001) Bên cạnh đó, quá trình hoạt hóa hệ thống proPO cần có sự hiện diện của ion Ca2+ Nếu thiếu Ca2+ thì quá trình hoạt hóa không xảy ra ngay cả khi có các yếu tố kích thích (Flegel, 1998)

Tóm lại, sự hoạt hóa proPO ở giáp xác liên quan đến hai bước: Bước thứ nhất là quá trình mất hạt xảy ra khi tế bào máu bị kích thích bởi các thành phần của vi khuẩn

như LPS, -glucan hoặc PG và tạo ra dạng bất hoạt của cả proPO lẫn PPAE Bước thứ hai đòi hỏi sự tham gia của Ca2+

để chuyển đổi PPAE bất hoạt thành proteinase hoạt động để phục vụ cho quá trình biến đổi proPO thành PO hoạt động (Flegel, 1998)

2.1.4 Hệ thống đông máu

Một hệ thống khác cũng được hoạt hóa bởi các sản phẩm của vi sinh vật là hệ thống đông máu Đây là một đáp ứng phòng vệ quan trọng ở giáp xác bởi vì nó ngăn chặn sự mất máu khi bị tổn thương ở bộ xương ngoài lẫn sự xâm nhập của vi sinh vật khắp cơ thể Protein huyết tương cấu thành những khối máu được gọi là các protein đông máu (CP) (Flegel, 1998)

CP được tinh sạch từ nhiều loài giáp xác khác nhau gồm tôm hùm Panulirus

interruptus, crayfish P leniusculus, và tôm thẻ chân trắng P vannamei Trong tất cả

các trường hợp, CP được xác định là một glycoprotein với trọng lượng phân tử 420 kDa với 2 tiểu đơn vị tương tự nhau được nối với nhau bằng liên kết disulfide Thêm vào đó, thành phần cấu tạo của CP ở tôm thẻ chân trắng thì cũng tương tự như crayfish, tôm hùm và cua, mặc dù những loài này có những loại tế bào đông máu khác nhau (Flegel, 1998)

Yếu tố đóng vai trò quan trọng của quá trình đông máu là transglutaminase (TGase) tế bào được tạo ra bởi tế bào máu (có lẽ là tế bào không hạt) dưới sự kích thích của các tác nhân ngoại bào Kết quả phản ứng phân giải của TGase là tạo thành những liên kết chéo -( -glutamyl)-lysine nội phân tử giữa mặt bên của gốc glutamine trên một chuỗi polypeptide với mặt bên của gốc lysine trên một chuỗi polypeptide khác (Vargas-Albores và ctv, 1998; Flegel, 1998)

Mặc dù có sự khác nhau trong cấu trúc nhưng hệ thống đông máu của động vật có xương sống và động vật không có xương sống có cơ chế tương tự nhau mặc dù cách thức thực hiện khác nhau Trong cả hai trường hợp, khối đông được hình thành bởi sự hoạt động của TGase kết hợp với Ca2+

trên các tế bào huyết tương gây đông, fibrinogen hoặc protein gây đông Tuy nhiên ở động vật có xương sống, đòi hỏi quá trình phân cắt protein trước đó (fibrinogen thành fibrin) để tạo nên cơ chất cho TGase trong huyết tương Trái lại, TGase ở tôm được giữ trong các tế bào máu (giống như các loài động vật không xương sống khác) và hoạt động ngay lập tức khi được giải phóng Xem như quá trình phân cắt protein trước đó không cần thiết, chỉ cần sự kích

thích của bạch cầu không hạt cùng với sự xuất hiện của LPS vi khuẩn là đủ để kích thích sự giải phóng TGase và dẫn đến quá trình đông máu tiếp theo (Vargas-Albores và ctv, 1998; Flegel, 1998)

2.1.5 Các chất ức chế proteinase

Các nhóm proteinase, như nhóm gây đông máu và hệ thống proPO cần thiết cho quá trình điều hòa để ngăn ngừa sự hoạt hóa quá mức của các nhóm enzyme nội sinh và gây hại tế bào vật chủ Hoạt động của các chất ức chế proteinase được tìm thấy ở nhiều loài động vật không có xương sống, đóng vai trò quan trọng trong quá trình kiểm soát và điều hòa hoạt động của hệ thống đông máu và hệ thống proPO Các nhóm chất ức chế được tìm ra như Kasal, Kunitz, serpin, -macroglobulin và chất ức chế metalloproteinase (Jiravanichpaisal, 2005)

Trong số các chất ức chế proteinase ức chế hoạt động của hệ thống proPO thì có nhiều chất ức chế proteinase ngăn chặn sự hoạt hóa quá mức của PPAE và một chất ức chế phenoloxidase trực tiếp ức chế hoạt tính của phenoloxidase Chất ức chế PPAE hiệu quả nhất ở crayfish là pacifastin, một protein heterodimer 155 kDa với một cấu trúc duy nhất Nó chứa một chuỗi nhẹ với 9 đơn vị ức chế proteinase và một chuỗi nặng chứa 3 thùy transferrin Phân tử này được gắn bằng các liên kết giữa các peptide và hình thành nên một chất ức chế proteinase mới được gọi là các chất ức chế serine proteinase giống pacifastin, hiện diện và ức chế hệ thống proPO ở nhiều loài giáp xác (Jiravanichpaisal, 2005)

2.1.6 Hệ thống nhận diện không chuyên biệt

Hệ thống miễn dịch thụ động ở động vật không xương sống được hoạt hóa bởi các tác nhân gây bệnh và nó là trung gian cho phản ứng giữa các phân tử nhận diện và tác nhân gây bệnh Những phân tử nhận diện các vật thể lạ được Janeway gọi là các protein nhận diện kháng nguyên (PRP) (Lee, 2001) Các PRP này nằm trên bề mặt của tế bào hoặc ẩn trong hemolymph, để sẵn sàng nhận diện sự xâm nhập của vi sinh vật lạ (Jiravanichpaisal, 2005)

Một số protein nhận diện đã được tìm thấy ở động vật không xương sống Đó là:

Lectin/ agglutinin là những glycoprotein không có hoạt tính phân giải nhưng có khả năng gắn kết với các carbohydrate chuyên biệt và có mặt ở hầu hết các sinh vật sống Chúng có thể gắn kết tế bào và tạo ra phản ứng ngưng kết Tương tác giữa lectin

và carbohydrate có liên quan đến nhiều hoạt động sinh học khác nhau ví dụ như là sự vận chuyển carbohydrate của mô và tế bào, các glycoprotein, sự gắn kết tế bào, sự opsonin hóa và sự hình thành các khối u Đặc biệt, các lectin type C, các lectin có hoạt tính phụ thuộc vào Ca có liên quan đến sự nhận biết miễn dịch ở động vật không xương sống (Lee, 2001; Jiravanichpaisal, 2005; Newman, 2001)

GBP và LPBP có trình tự tương tự như glucanase ở vi khuẩn nhưng chúng không biểu hiện bất kỳ hoạt tính nào của glucanase và thay vào đó là làm tăng sự hoạt hóa hệ thống proPO Các GBP ở crayfish nằm trong huyết tương và tương tác với -1,3- glucan để gia tăng sự hoạt hóa của hệ thống proPO và cũng hoạt động như một opsonin để tăng khả năng thực bào (Jiravanichpaisal, 2005)

Protein giống masquerade (mas-like protein) là một protein nhận diện kháng nguyên trong tế bào máu vì nó có khả năng gắn với LPS, -1,3-glucan, vi khuẩn gram (-) và nấm men Các mas-like protein cũng có hoạt tính opsonin và gắn kết tế bào Do đó, các mas-like protein là một protein đa chức năng Trình tự aminoacid của nó tương đồng với serine proteinase ngoại trừ sự thay thế bộ ba xúc tác  không có hoạt tính phân giải (Lee, 2001; Jiravanichpaisal, 2005)

Hemolin thuộc liên họ immunoglobulin chứa những vùng giống Ig có thể gắn với phần lipid A của LPS và vi khuẩn gram (-) (Lee, 2001; Jiravanichpaisal, 2005) Vai trò của hemolin trong động vật không xương sống vẫn chưa được xác định rõ ràng, tuy nhiên có những báo cáo cho rằng hemolin có khả năng nhận biết không chuyên biệt và tạo ra đáp ứng miễn dịch và cũng có vai trò trong sự hình thành thần kinh (Lee, 2001)

2.1.7 Các peptide kháng khuẩn

Các peptide/polypeptide chống lại vi sinh vật (AMPs) do gene mã hóa có vai trò rất lớn trong giới sinh vật sống từ vi sinh vật đến thực vật và động vật Một phần quan trọng của hệ miễn dịch tự nhiên là tạo ra những chất chống lại vi sinh vật mà chủ yếu là các peptide Bình thường, AMPs chứa ít hơn 150 – 200 amino acid và được tạo ra bởi nhiều loại tế bào khác nhau Dựa vào sự phân bố trên mô của chúng, có thể chắc chắn rằng AMPs có khả năng bảo vệ vật chủ chống lại các mầm bệnh (Jiravanichpaisal, 2005; Newman, 2001)

Nhiều peptide chống vi sinh vật đã được xác định từ nhiều loài côn trùng và chelicerate, nhưng cũng có một số peptide được tìm thấy ở giáp xác Trong thập kỷ vừa qua, nhiều AMP đã được phân lập từ cua, tôm và crayfish Một peptide 6.5 kDa và 3.7 kDa (callinectin) đã được xác định một phần từ tế bào máu của cua Một họ AMP có cả hoạt tính kháng khuẩn lẫn kháng nấm được phân lập từ máu của tôm

Litopenaeus vannamei và được đặt tên là penaeidin (Destoumieux và ctv, 1997) Gần

đây, histone H2A được tạo dòng và xác định từ tôm, L vannamei và đầu N của nó

được tìm thấy là có tính tương đồng với các peptide histone kháng khuẩn đã biết là buforin I, parasin và hipposin Các nhân tố kháng lipopolysaccharide (ALFs) được tìm

thấy trong tế bào máu của cua và gần đây là tế bào máu của P monodon ALF tái tổ

hợp có một phổ kháng nấm và vi khuẩn rộng chống lại cả vi khuẩn gram (-) lẫn vi khuẩn gram (+) Hai AMP khác, crustin và peptide có nguồn gốc từ hemocyanin cũng được tìm thấy ở tôm và crayfish Crustin, một peptide kháng khuẩn 11.5 kDa được tìm

thấy ở Carcinus maenas Đầu C của hemocyanin có hoạt tính kháng nấm nhưng cơ chế

mà hemocyanin bị phân cắt và được hoạt hóa ở tôm vần chưa rõ ràng Cuối cùng, 2 peptide kháng khuẩn với trọng lượng phân tử thấp tên là astacidin 1 và 2 được tinh

sạch và xác định từ máu của crayfish P leniuscus Asticidin 1 với 16 amino acid được

tạo ra do sự phân cắt của hemocyanin trong khi asticidin 2 với 14 aa, là một peptide giàu proline (Lee, 2001; Jiravanichpaisal, 2005)

2.1.8 Peroxinectin

Trong quá trình hoạt hóa hệ thống proPO, peroxinectin, một nhân tố gắn kết tế bào với hoạt tính peroxidase được tạo ra Peroxinectin được tổng hợp trong các tế bào máu ở trạng thái bất hoạt, chỉ được giải phóng khi có các vật thể lạ kích thích và được hoạt hóa bên ngoài tế bào để thực hiện sự gắn kết Ngoài khả năng gắn kết tế bào và hoạt tính peroxidase, peroxinectin cũng là một nhân tố làm mất hạt của tế bào máu, một yếu tố mở đầu cho quá trình đóng gói và opsosin hóa (Sritunyalucksana, 2001)

Chức năng gắn kết của peroxinectin được thực hiện thông qua những motif gắn integrin, KGD- hoặc RGD motif Ngoài việc gắn với integrin, peroxinectin cũng có thể gắn được với Cu-Zn-superoxide dismutase bề mặt tế bào máu ngoại vi Peroxinectin có thể tạo ra acid hypohalic từ hydrogen peroxide và do đó nó có chức năng như là một hệ thống tấn công vi sinh vật hiệu quả chống lại sự xâm nhập của chúng (Sritunyalucksana, 2001)

2.2 Bệnh đốm trắng và virus gây bệnh đốm trắng 2.2.1 Bệnh đốm trắng

2.2.1.1 Lịch sử và phân bố

Virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) là một trong những nhóm virus được xếp vào nhóm virus gây chết cấp tính trên tôm nuôi WSSV gây chết trên hầu hết

các loài tôm thuộc nhóm Penaeus như P monodon, P japonicus, P.chinensis, P

merguiensis… và trên tất cả các giai đoạn phát triển của tôm từ ấu trùng đến tôm

giống, tôm trưởng thành (Lý Thị Thanh Loan, 2003)

Mặc dù bệnh đốm trắng xuất hiện đầu tiên vào năm 1992 tại Đài Loan, nhưng bằng chứng cụ thể lần đầu tiên về căn bệnh này và tác nhân gây bệnh được biết vào năm 1993 Sự bùng nổ căn bệnh này xảy ra ở Nhật Bản và ở các trang trại nuôi

tôm Penaeus japonicus Trong dịch bệnh này, tỷ lệ tôm chết cao được tìm thấy trong

tất cả các trang trại nuôi tôm có nhập khẩu tôm giống từ Trung Quốc  một số tác giả cho rằng virus có nguồn gốc từ Trung Quốc Một năm sau đó, một nhóm nghiên cứu viên Trung Quốc đã xác nhận bệnh đốm trắng (WSD) hiện diện ở Trung Quốc vào đầu năm 1993 (Zhang và ctv, 1998), chính điều này đã giải thích được điểm khởi đầu bùng nổ dịch bệnh Năm 1994, sự hiện diện của WSSV đã có ở hầu hết các quốc gia có nuôi tôm ở châu Á như: Hàn Quốc, Đài Loan, Việt Nam, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Ấn Độ…

Ở Việt Nam, vào tháng 2 năm 1994, tại huyện Bình Đại, huyện Thạnh Phú – tỉnh Bến Tre và tháng 3 đến tháng 4 năm 1994 tại các đầm nuôi ở huyện Cần Giờ - Tp Hồ Chí Minh đã phát hiện tôm bị bệnh đốm trắng chết hàng loạt sau 30 – 40 ngày nuôi (Lý Thị Thanh Loan, 2003)

Năm 1995, WSSV gây chết tôm hàng loạt ở Texas ở các nông trại nhập khẩu tôm từ châu Á (Lightner, 1999) Vào năm 1997, WSSV được tìm thấy ở miền Nam Carolina và chính sách cách ly được thực hiện nghiêm ngặt ở bang này để kiểm soát dịch bệnh nhưng người dân vẫn bị thiệt hại rất nhiều Vào năm 1998, công bố một nghiên cứu đã phát hiện sự nhiễm WSSV trong tôm thương mại nhập khẩu lấy từ các siêu thị ở Mỹ và sự rủi ro của việc mang WSSV từ châu Á sang châu Mỹ qua nguồn tôm sống và tôm đông lạnh ngày càng rõ ràng hơn Đến năm 1999 thì vùng phân bố địa lý của virus đã lan rộng đến nhiều nông trại nuôi tôm ở Nicaragua, Guatemela, Panama, Ecuador Sự xuất hiện của WSSV ở vùng Trung Mỹ và châu Mỹ La tinh đã

khiến Chính phủ các nước ở khu vực này phải có các biện pháp kiểm soát Chính phủ Peru đã chính thức cấm nhập khẩu ấu trùng tôm và tôm bố mẹ và Mexico cho phép nhập khẩu tôm từ Texas chỉ khi có chứng nhận là trong sản phẩm không có WSSV (Nguyễn Văn Hảo, 2000)

2.2.1.2 Dấu hiệu bệnh tích

a Dấu hiệu bên ngoài

Tôm nhiễm bệnh xuất hiện dấu hiệu đỏ thân cùng với đốm trắng bên trong lớp vỏ đầu ngực, các đốm trắng có kích thước từ 0,5 đến 2 mm xuất hiện đầu tiên trên lớp vỏ đầu ngực và ở đốt đuôi cuối cùng (Chou và ctv, 1995; Kou và ctv, 1998) (Hình 2.1A)

Tôm bị bệnh đốm trắng dễ dàng phát hiện ở tôm nhỏ (juvenile) và sắp trưởng thành (sub-adult)

b Dấu hiệu bên trong

Tế bào tôm bị bệnh đốm trắng có hiên tượng trương nhân (Chou và ctv, 1995) Gan tụy trương nhân có màu trắng vàng và trở nên dòn hơn

Dấu hiệu đặc trưng về mô bệnh học là sự xuất hiện của các thể vùi Crowdry type A trong nhân trương (Lightner, 1996) (Hình 2.1B)

Hình 2.1: Tôm bị bệnh đốm trắng (Vlak, 2005)

A: Các dấu hiệu lâm sàng (đỏ thân và xuất hiện đốm trắng) B: Tế bào nhiễm đốm trắng bị trương nhân

2.2.2 Virus đốm trắng

2.2.2.1 Phân loại và tên gọi

Sự phân loại của WSSV thì không rõ ràng Trong những năm đầu thì WSSV

được phân vào họ Baculoviradae, họ phụ là Nudibaculovirinae do hình thái và cấu

trúc genome của nó (Wang và ctv, 1995; Wongsteerasupaya và ctv, 1995) Tuy nhiên,

sáu báo cáo trong Hội đồng phân loại học virus quốc tế (ICTV) đã phủ nhận họ phụ

này Do WSSV không có quan hệ với nguồn gốc của Baculovirus được chứng minh

qua sự phân tích hệ thống phát sinh loài, nên một nhóm nghiên cứu đã đề nghị là tạo ra

một họ mới, là Whispovirus (van Hulten, 2001)

Hiện nay, virus đốm trắng thuộc họ Nimaviridae, giống Whispovirus, tên gọi

là virus đốm trắng (White Spot Syndrome Virus)

Hiện nay trên thế giới đã thống nhất tên gọi của virus gây bệnh đốm trắng là

White Spot Syndrome Virus

2.2.2.2 Hình thái

Vỏ WSSV là những tiểu phần đối xứng, có hình ellipse hoặc hình que, không tạo thể ẩn, đường kính từ 120 – 150 nm, chiều dài từ 270 – 290 nm WSSV có một phần phụ giống như đuôi ở điểm cuối của vỏ Một số loại nucleocapsid cá biệt có đường kính từ 65 – 70 nm, chiều dài từ 300 – 350 nm (Van Hulten và các ctv, 2001)

- Nucleocapsid được phân lập có những đường chéo song song và kích thước khoảng 300 x 70 nm (Hình 2.3) Nucleocapsid được hình thành bởi số lượng lớn các vòng (khoảng 14 trong tổng số) mà những vòng này được tạo ra từ những tiểu thể hình cầu rỗng có đường kính khoảng 8 nm, xếp thành hai hàng song song Nucleocapsid

Hình 2.2 Hình thái của virus đốm trắng quan sát dưới kính hiển vi điện tử (Vlak, 2005) (A): phần vỏ

(B): nuclocapsid

chứa genome của virus và phần lớn là các protein mã hóa cho WSSV là VP664, VP26, VP24, VP15 (Leu và ctv, 2005; van Hulten và ctv, 2002) VP664, một protein lớn chứa 6.077 amino acid được mã hóa bởi một khung đọc mở (ORF) với 18.234 nucleotide và có trọng lượng phân tử 664 kDa, được xem là protein lõi, chịu trách nhiệm tạo nên những sọc cho nucleocapsid (Leu và ctv, 2005) VP15, một protein không có vùng kỵ nước, là một protein giống histon, một protein gắn với DNA mạch đôi (Witteveldt và ctv, 2005) Chức năng của VP26 và VP24 trên nucleocapsid vẫn chưa rõ Hơn nữa, có khoảng 40 protein thứ yếu mã hóa cho WSSV đã được xác định bằng cách giải trình tự protein của từng band sau khi phân tích virion WSSV bằng SDS-PAGE (Leu và ctv, 2005; Tsai và ctv, 2004; van Hulten và ctv, 2002) Tùy vị trí địa lý phân lập WSSV khác nhau mà khi xác định các đặc điểm thì chỉ có điểm tương tự nhưng không tương đồng về hình thái và proteome (Wang và ctv, 2000)

Hình 2.3: (A): Gel protein của WSSV đã được tinh sạch (1: marker, 2: nucleocapsid và vỏ của WSSV đã được tinh sạch (Lo và ctv, 2004)

(B): Mô hình virion của virus đốm trắng (Vlak và ctv, 2002) A

-

- Vật chất di truyền của virus đốm trắng là phân tử DNA mạch đôi, siêu xoắn, dạng vòng (Hình 2.4) Giữa những khu vực phân lập WSSV khác nhau thì sẽ có sự đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP) Cụ thể là có 3 chủng virus đốm trắng có kích thước khác nhau thu được ở 3 vùng khác nhau là Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan: WSSV-CN có kích thước 305107 bp (Genbank Acceession No AF332093), WSSV-TH có kích thước 292967 (GenBank Accession No AF369029), WSSV-TW có kích thước 307287 (GenBank Accession No AF440570) (van Hulten, 2001)

Hình 2.4: Genome của virus đốm trắng (Yang và ctv, 2001)

Hình mũi tên (vòng ngoài): Vị trí của 181 ORFs (màu đỏ và màu xanh chỉ hướng dịch mã khác nhau) Hình chữ nhật màu xanh lá chỉ 9 hrs B: Vị trí cắt giới hạn của enzyme BamHI (vòng trong, số trong ngoặc đơn chỉ vị trí)

2.3 Quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng 2.3.1 Vật liệu gây bệnh

Theo Qi và ctv (2004), vỏ protein đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của nhiều loại virus khác nhau Một số loại virus ở người như virus sởi, virus vaccinia, các protein vỏ hoạt động như một protein gắn kết trên bề mặt tế bào để gắn lên tế bào và làm tiền đề cho việc xâm nhiễm Ở HBV trên vịt, protein vỏ L giúp cho virus di chuyển đến màng tế bào Tương tự thì protein vỏ của virus đốm trắng cũng thực hiện những chức năng đó Do đó, protein vỏ này đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus đốm trắng

Một công trình nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng protein vỏ, VP28, liên

quan đến quá trình xâm nhiễm vào cơ thể của tôm bằng một thí nghiệm trung hòa in

vivo Công trình nghiên cứu duy nhất về chức năng của VP28 đã chứng minh rằng nó

chịu trách nhiệm gắn lên các receptor bề mặt tế bào chuyên biệt Về đặc điểm sinh học của VP28, có 5 vị trí có khả năng thực hiện glycosyl hóa đầu N, 2 vị trí glycosyl hóa đầu O và 9 vị trí có thể thực hiện sự phosphoryl hóa Tuy nhiên có một vùng kỵ nước cực mạnh hiện diện ở đầu N của VP28 Cấu trúc sinh học của VP28 chứng minh rằng nó có thể đóng vai trò là một protein gắn kết (Qi và ctv, 2004)

Vai trò của VP28

- Protein vỏ VP28 có thể gắn lên các tế bào của tôm và có vai trò quan trọng trong sự tương tác giữa virus và tế bào Sử dụng kháng thể đơn dòng chống lại VP28, thu được kết quả kháng thể này trung hòa VP28  ngăn chặn quá trình xâm nhiễm của virus

- Khả năng gắn kết của VP28 lên tế bào của tôm phụ thuộc vào nồng độ - Sự gắn kết của VP28 lên tế bào phụ thuộc vào pH Nghiên cứu của Qi và

ctv (2004) đã chứng minh rằng pH 6.0 là pH tốt nhất cho sự gắn kết lên tế bào của WSSV

- VP28 không chỉ gắn trên tế bào mà còn xâm nhập vào tế bào chất trong quá trình gắn kết và xâm nhập của WSSV vào tế bào của tôm

Tóm lại, quá trình xâm nhiễm của virus đốm trắng được mô tả như sau: Đầu tiên, VP28 trên bề mặt của virus sẽ gắn lên bề mặt của tế bào và làm trung gian cho quá trình xâm nhiễm của virus bằng cách gắn trực tiếp lên các receptor chuyên biệt cho WSSV hay đẩy mạnh quá trình xâm nhập bằng cách hoạt hóa vị trí dung hợp để cho WSSV xâm nhập vào tế bào Từ đó, VP28 có thể thu được không chỉ trên bề mặt tế bào mà còn trong tế bào chất (Qi và ctv, 2004)

2.3.2 Cơ chế xâm nhiễm

 Cơ quan đích của virus đốm trắng:

Trong giai đoạn đầu của quá trình lây nhiễm, virus đốm trắng xâm nhập vào dạ dày, mang, biểu bì, những mô liên kết của gan tụy Ở giai đoạn sau đó là cơ quan bạch huyết, tuyến an-ten, mô cơ, mô tạo máu, tim, đoạn ruột sau, và một số phần của ruột giữa Hệ thần kinh và những cặp mắt kép chỉ bị nhiễm ở giai đoạn cuối Như vậy, dạ dày, mang, biểu bì, cơ quan bạch huyết, mô tạo máu, và tuyến an-ten bị nhiễm rất nặng ở giai đoạn cuối (Hendrik Marks, 2005)

Tuy chưa có báo cáo về đường xâm nhập của WSSV vào tế bào nhưng các nhà khoa học đã xác định sự sao chép, trưởng thành và lắp ráp của virion xảy ra trong nhân Ở nhân, trong giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm, xuất hiện những thể hình sợi, hình hạt (có thể là chất nền của virus), những cấu trúc giống như màng Sau đó có thể quan sát thấy những ống dài và rỗng Những ống nhỏ này vỡ ra thành từng mảnh nhỏ, hình thành nucleocapsid Có hai giả thuyết về sự phát triển hình dạng WSSV Theo một số tác giả, trước khi phần lõi đi vào trong thì nucleocapsid đã được bao phủ bởi màng (envelop), để lại một khoảng hở Protein nhân (nucleoprotein) dạng sợi chui vào trong capsid qua khoảng hở này Khi phần lõi hoàn tất, phần bao thu hẹp đầu hở và tạo thành đuôi của virion trưởng thành Trái lại, một số tác giả khác lại cho rằng nucleocapsid hoàn chỉnh được lắp ráp đầu tiên, sau đó mới được bao lại (Wang và ctv, 2000) Sau khi lắp ráp, virion trưởng thành có thể kết lại với nhau thành một dãy hoặc phân tán trong dịch nhân Làm thế nào WSSV virion rời khỏi tế bào chủ vẫn chưa được biết rõ nhưng sau khi virion phá vỡ tế bào nhiễm bệnh thoát ra ngoài, chúng tiếp tục xâm nhập vào các tế bào bên cạnh hoặc theo phân thải ra môi trường ngoài Tôm ăn phải virus tự do trong bùn ao và nước sẽ nhiễm bệnh (Chou và ctv, 1996; trích bởi Trần Ngọc Ánh Mai, 2005)

2.3.3 Cơ chế lây lan

Quá trình truyền lây xảy ra khi mầm bệnh được truyền từ nguồn bệnh (cá thể bệnh, yếu tố truyền lây, trực tiếp từ môi trường ngoài) vào cơ thể cá thể khỏe, lúc này cá thể đã bị nhiễm bệnh Mầm bệnh WSSV có thể truyền lan theo hai trục:

Trục ngang: là con đường chủ yếu Từ nguồn nước, từ thức ăn, từ các giáp xác hoang dã trong ao, đặc biệt là do tôm khỏe ăn tôm chết do bị bệnh đốm trắng

trong ao, đây là con đường lây lan rất nhanh gây chết tôm hàng loạt (Tookwinas, 1998)

Một số loài tôm hoang dã và giáp xác khác được xem là vật truyền lan gây bùng nổ bệnh đốm trắng trong ao nuôi khi chúng xâm nhập vào thông qua con đường thay nước (Limsuwan và ctv,1997)

Bằng xét nghiệm sinh học (bioassay) và mô học cho thấy cua, tôm nước ngọt, tôm hùm có thể đóng vai trò như là vật chủ mang hoặc chuyên chở mầm bệnh không triệu chứng (asymtomatic) Tôm hùm đóng vai trò chính như là vật chủ dự trữ đối với WSSV; nó có thể bị nhiễm từ phân chim, nước thải ra biển và có thể mang WSSV trong thời gian dài mà không bị bệnh, là nguồn lây nhiễm cho nguồn tôm bố mẹ tự nhiên (Rajendran và ctv, 1999)

Ngoài ra còn có những tác nhân khác như các loài vật ăn thịt như cá, chim, chó, mèo sẽ đưa mầm bệnh từ ao này sang ao khác làm lan tràn dịch bệnh, những tác động của con người qua thao tác trong quá trình nuôi

Sử dụng phương pháp lai DNA chỉ ra rằng ruột và mang tôm sú là đường xâm nhập của virus đốm trắng vào cơ quan tạo máu, mang là nơi sinh sản ra virus (Chang và ctv, 1996)

Trục dọc: biểu hiện sự truyền bệnh từ bố mẹ sang con Tuy nhiên, khả năng truyền theo trục dọc vẫn chưa được chứng minh mặc dù SEMBV đã được phát hiện trong một số giai đoạn trứng tôm khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử (Tookwinas, 1998)

2.4 Mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn virus trên tôm

Mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn là mô hình được xây dựng nghiêm ngặt theo những điều kiện, tiêu chí nhất định được duy trì trong suốt thời gian tiến hành thí nghiệm nhằm gây nhiễm mầm bệnh virus, vi khuẩn trên vật chủ với liều lượng xác định nhằm khảo sát đặc tính, đánh giá hoạt lực của mầm bệnh gây ra trên cơ thể vật chủ

Quá trình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn được xây dựng ở đây nhằm xác định độc lực của mầm bệnh dựa trên việc xác định ID50 (infectious dose 50%) và LD50

(lethal dose 50%)

2.4.1 ID50 và LD50

A ID50

- ID50 là liều lượng mầm bệnh xác định sử dụng có thể gây nhiễm 50% động vật thí nghiệm

- Liều gây nhiễm 50 % đồng thời đo lường khả năng chịu đựng của vật chủ đối với một mầm bệnh xác định, từ đó cho ta một cái nhìn khái quát về độc lực của mầm bệnh đó

B LD50

LD50 là liều lượng mầm bệnh xác định khi sử dụng có thể gây chết 50 % động vật thí nghiệm

2.4.2 Một số thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm chuẩn trên tôm

Thí nghiệm vaccin (Trích trong bài nghiên cứu “Vaccination of

Penaeus monodon by injection of WSSV structural virion proteins” (Witterveldt,

2002)

Trong thí nghiệm vaccin, tôm có khối lượng khoảng 1 g được tiêm vào cơ ở đốt thứ 4 hoặc 5 của phần bụng với protein tinh sạch pha loãng 5 ngày sau khi tiêm vaccin lần đầu tiên, tôm được tiêm tiếp với cùng 1 lượng protein Hai ngày sau khi tiêm lần 2 cho tôm, tôm được cảm nhiễm bằng tiêm virus đốm trắng với độ pha loãng sao cho đạt được tỷ lệ chết là 70-90% trong thí nghiệm 1 và tỷ lệ chết là 100% trong thí nghiệm 2 Sau khi cảm nhiễm, tôm được nuôi trong những hồ riêng biệt để ngăn ngừa tình trạng nhiễm chéo virus đốm trắng

Chuẩn độ in vivo và cảm nhiễm WSSV trên tôm (Trích trong bài

nghiên cứu “Oral vaccination of Penaeus monodon for protection against WSSV”

(Witterveldt, 2004)

Trong thí nghiệm này, tôm được cảm nhiễm bằng cách ngâm trong nước Để xác định số lượng mong muốn của virus để cảm nhiễm thu được tỷ lệ chết là 75%

virus stock được chuẩn bị và được chuẩn độ in vivo Tôm có khối lượng khoảng 1g

được ngâm vào những dịch WSSV khác nhau trong khoảng thời gian là 7 giờ Sau đó vớt tôm ra, rửa và đặt vào những hồ riêng biệt để ngăn ngừa sự nhiễm chéo Sự tử vong của tôm được ghi lại 2 lần mỗi ngày và tôm chết được kiểm tra sự hiện diện của WSSV bằng PCR

Thí nghiệm chuẩn độ virus (Trích trong bài nghiên cứu “In vivo titration of

white spot syndrome virus (WSSV) in specific pathogen-free Litopenaeus vannamei

by instramuscular and oral routes”)

Kích cỡ tôm sử dụng trong thí nghiệm này nhỏ nhất là 6 -7 g Tôm trong thí nghiệm này được gây nhiễm qua đường miệng Quy trình gây nhiễm như sau: sử dụng một ống hút dẻo vô trùng và một mặt kính phóng đại (2,5X) đặt vào miệng tôm sau đó đặt tôm nằm dọc và chuyển dịch virus vào cơ thể tôm qua đường miệng

2.5 Phương pháp hóa mô miễn dịch 2.5.1 Nguyên lý

Hóa mô miễn dịch (IHC) là kỹ thuật sử dụng kết hợp giữa miễn dịch học và mô học để phát hiện kháng nguyên trong mô Kháng nguyên được nhận biết bằng kháng thể chuyên biệt Phản ứng miễn dịch được quan sát dưới kính hiển vi bằng cách thêm một enzyme, một cơ chất của enzyme và một chất tạo màu để tạo nên một phản ứng màu Hóa mô miễn dịch là một kỹ thuật rất nhạy và chuyên biệt (ihcworld.com)

Hóa mô miễn dịch được tiến hành qua các bước cơ bản sau: - Bước 1: Kháng thể ban đầu gắn với kháng nguyên chuyên biệt

- Bước 2: Phức hợp kháng thể - kháng nguyên được gắn với kháng thể thứ hai, kháng thể này có gắn enzyme

- Bước 3: Với sự hiện diện của cơ chất và chất tạo màu, enzyme hình thành nên một dạng màu sắc ở vị trí gắn kết giữa kháng thể và kháng nguyên

2.5.2 Kháng nguyên

Theo Stites và ctv (1987) kháng nguyên là những chất khi đưa vào cơ thể một động vật có thể kích ứng một phản ứng miễn dịch mà ta có thể nhận biết được (miễn dịch thể dịch, miễn dịch tế bào, hay thường là cả hai loại)

Bản chất hóa học của kháng nguyên thường là những đại phân tử protein Polysaccharide, các polypeptide tổng hợp và những polypeptide khác cũng là kháng nguyên trong những điều kiện thích hợp (Stites và ctv, 1987)

Những phân tử lớn là những kháng nguyên mạnh nhưng chỉ có một số vùng giới hạn trên những phân tử đó tham gia gắn kết thật sự với vị trí kết hợp trên kháng thể Những vùng này quyết định tính đặc hiệu của phản ứng kháng nguyên – kháng thể và được gọi là vùng quyết định (antigen determinant) hay vùng phản ứng Epitope là dạng đơn giản nhất của vùng phản ứng trong phân tử kháng nguyên phức tạp Lượng vùng phản ứng trên kháng nguyên thay đổi tùy theo kích thước và tính phức tạp của kháng nguyên (Stites và ctv, 1987)

2.5.3 Kháng thể

Theo Boenisch và ctv (2002) kháng thể thuộc nhóm protein gọi là globulin miễn dịch (immunoglobulin – Ig) Globulin miễn dịch gồm 5 nhóm chính, được xếp theo thứ tự giảm dần trong huyết thanh: IgG, IgA, IgM, IgD và IgE Trong đó, IgG và IgM thường được dùng trong hóa mô miễn dịch

Có hai loại kháng thể

Hình 2.5: Kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng (Boenisch và ctv, 2002)

A: Kháng thể đa dòng gắn với các epitope khác nhau trên kháng nguyên B: Kháng thể đơn dòng phản ứng với một epitope đặc hiệu trên kháng nguyên

 Kháng thể đa dòng (polyclonal antibodies): Được tạo ra bởi những tế

bào plasma khác nhau nên thường không đồng nhất về hóa miễn dịch, chúng phản ứng với những epitopes khác nhau trên kháng nguyên đã kích thích tạo ra chúng Động vật đáp ứng miễn dịch và tạo ra kháng huyết thanh bao gồm nhiều loại kháng thể đặc hiệu và không đặc hiệu Kháng thể đa dòng dễ sản xuất hơn kháng thể đơn dòng nhưng có khuyết điểm là ngay cả sau khi tinh sạch, kháng thể đa dòng vẫn có thể chứa những kháng thể phản ứng không đặc hiệu với kháng nguyên

 Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody): Được tạo ra từ một dòng tế

bào plasma nên đồng nhất về hoá miễn dịch, chúng phản ứng với một epitope nhất định trên kháng nguyên đã kích thích tạo ra chúng Ưu điểm của kháng thể đơn dòng là độ đồng nhất cao, rất tinh khiết và đặc hiệu

2.5.4 Các phương pháp nhuộm (theo IHC world)

Có nhiều phương pháp hóa mô miễn dịch có thể dùng để định vị kháng nguyên việc lựa chọn phương pháp thích hợp dựa trên các thông số như loại mẫu vật và độ nhạy yêu cầu (IHC world, 2005)

Â

Hình 2.6: Các phương pháp nhuộm IHC

A: Phương pháp nhuộm trực tiếp B: Phương pháp nhuộm gián tiếp

C: phương pháp nhuộm ABC (Avidin – Biotin Complex) D: Phương pháp nhộm PAP (Peroxidase anti-Peroxidase) E: Phương pháp nhuộm LSAB

2.5.4.1 Phương pháp trực tiếp

Phương pháp trực tiếp là phương pháp nhuộm màu một bước và bao gồm kháng thể được đánh dấu phản ứng trực tiếp với kháng nguyên trên những vùng mô Kỹ thuật này chỉ sử dụng một kháng thể và quy trình thực hiện thì ngắn và nhanh Tuy nhiên, phương pháp này không nhạy do sự khuếch đại dấu hiệu quá ít và cũng rất ít được sử dụng (Hình 2.7.A)

2.5.4.2 Phương pháp gián tiếp

Phương pháp gián tiếp bao gồm một kháng thể sơ cấp không được đánh dấu (lớp đầu tiên) phản ứng với kháng nguyên trên mô và một kháng thể thứ cấp được đánh dấu (lớp hai) phản ứng với kháng thể sơ cấp Phương pháp này nhạy hơn do sự khuếch đại dấu hiệu thông qua những phản ứng của kháng thể thứ cấp với những vị trí kháng nguyên khác nhau trên kháng thể sơ cấp Thêm vào đó, phương pháp này cũng rất kinh tế vì một kháng thể thứ cấp được đánh dấu có thể sử dụng với nhiều kháng thể sơ cấp cho những kháng nguyên khác nhau

Kháng thể lớp thứ hai có thể được đánh dấu với thuốc nhuộm huỳnh quang như: FITC, rhodamine hay Texas red và phương pháp gián tiếp này được gọi là phương pháp miễn dịch huỳnh quang (immunofluorescent method) Kháng thể thứ hai có thể được đánh dấu với một enzyme như peroxidase, alkaline phosphatase hay glucose oxidase và phương pháp này được gọi là miễn dịch enzyme (Hình 2.7.B)

2.5.4.3 Phương pháp PAP (peroxidase anti – peroxidase method)

Phương pháp PAP là một phương pháp phát triển cao hơn phương pháp gián tiếp Phương pháp này liên quan đến lớp thứ 3 là kháng thể thỏ gắn với peroxidase để tạo thành phức hợp peroxidase anti – peroxidase ổn định Phức hợp này, bao gồm gaba – globulin thỏ và peroxidase, hoạt động như kháng nguyên lớp thứ 3 và có khả năng gắn kết kháng gaba – globulin thỏ ở dê không tiếp hợp của lớp thứ hai Độ nhạy của phương pháp này cao hơn từ 100 – 1000 lần vì phân tử peroxidase không tiếp hợp hóa học với kháng IgG nhưng gắn kết miễn dịch và không làm giảm hoạt tính enzyme Phương pháp này cũng cho phép độ pha loãng của kháng thể sơ cấp cao hơn, do đó loại bỏ được nhiều kháng thể không mong muốn và giảm sự nhuộm màu nền không chuyên biệt (Hình 2.7.C)

2.5.4.4 Phương pháp avidin – biotin complex (ABC method)

Phương pháp ABC là phương pháp IHC chuẩn và là một trong những kỹ thuật được sử dụng rộng rãi trong việc nhuộm màu Avidin, một glycoprotein lớn, có thể được đánh dấu bằng peroxidase hoặc fluorescent và có ái lực cao đối với biotin Biotin, một vitamin có trọng lượng phân tử thấp, có khả năng tiếp hợp với nhiều phân tử sinh học khác nhau như là kháng thể

Kỹ thuật này liên quan đến 3 lớp Lớp thứ nhất là kháng thể sơ cấp không đánh dấu Lớp thứ hai là kháng thể thứ cấp được gắn với biotin Lớp thứ ba là một

phức hợp của avidin – biotin peroxidase Sau đó peroxidase được gắn bởi DAB hay các cơ chất khác để tạo những sản phẩm cuối cùng có màu sắc khác nhau.(Hình 2.7.D)

2.5.4.5 Phương pháp đánh dấu Streptavidin Biotin (LSAB)

Streptavidin, có nguồn gốc từ streptococcus avidini, là một phương thức

mới nhằm thay thế avidin Phân tử streptavidin không có điện tích trên mô của động vật, không giống như avidin có điểm đẳng điện là 10 và do đó loại bỏ được sự gắn kết tĩnh điện với mô Thêm vào đó, streptavidin không chứa các nhóm carbohydrate nên không gây ra sự gắn kết với mô lectin

LSAB là kỹ thuật tương tự như kỹ thuật ABC chuẩn lớp đầu tiên là kháng thể sơ cấp không đánh dấu Lớp thứ hai là kháng thể sơ cấp được đánh dấu bằng biotin Lớp thứ ba là phức hợp enzyme và streptavidin (HRP – Streptavidin hoặc AP – Streptavidin) để thay thế cho phức hợp avidin – biotin peroxidase Enzyme được quan sát bằng dung dịch chất tạo sắc để tạo ra những sản phẩm cuối có màu sắc khác nhau Lớp thứ ba có thể được đánh dấu bằng fluorescent dye – streptavidin như FITC – streptavidin (Hình 2.7.E)

Theo một số báo cáo gần đây cho rằng phương pháp LSAB có độ nhạy cao hơn 5 – 10 lần so với phương pháp ABC chuẩn

PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THÍ NGHIỆM 3.1.1 Thời gian

Từ ngày 6/3/2006 đến ngày 18/7/2006

3.1.2 Địa điểm

- Gây nhiễm: Trại Thực Nghiệm Thuỷ Sản Thủ Đức-Tp HCM

- Phân tích IHC: Phòng Mô Học – Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Khu Vực Nam Bộ – Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II

- Tôm sú có độ tuổi từ 45 ngày tuổi (trọng lượng cơ thể 8,5 g 2) được lấy từ trại nuôi tôm Công ty K22, huyện Thạnh Phú, tỉnh Bến Tre sau khi đã kiểm tra tôm không mang các mầm bệnh virus thông thường (WSSV, MBV, IHHNV, HPV, YHV, TSV) Tôm được đem về Trại Thực Nghiệm Thuỷ sản Thủ Đức, nuôi thuần dưỡng theo các điều kiện thí nghiệm 6 ngày trước khi đưa vào gây nhiễm thực nghiệm

- Bể kính thí nghiệm có thể tích 126 lít

- Nước biển sử dụng trong thí nghiệm được chở từ Vũng Tàu có độ mặn 30 %o35 ‰ được pha loãng đến 20 ‰ cho thí nghiệm Sau đó xử lý nước biển bằng chlorine 30 ppm Sau 3 ngày trung hòa dư lượng chlorine.bằng NaHSO4

- Hóa chất: Cồn 700, cồn 900, dung dịch Davidson, nước cất, dung dịch đệm PBS, Chlorine, formaline, NaHSO4.

3.2.2 Các hóa chất và dụng cụ sử dụng trong IHC 3.2.2.1 Hóa chất

- Xylene

- Ethanol ( 100 %, 95 %, 70 %, 50 %) - Sodium azide 10 %

- Tris NaCl, tris HCl pH 7.6 - H2O2 30%

- Kháng thể thứ nhất 8B7 (Diagxostic – USA)

- Kháng thể thứ hai (Anti-mouse Ig, biotinylated species-specific whole antibody (Amersham – Vương quốc Anh)

- Normal Sheep serum (Calbiochem)

- Streptavidin – biotine horseradish peroxidase (HRP) (Amersham – Vương quốc Anh)

- 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (Sigma – USA) - Hematoxylin

- Keo dán Baume Canada

3.2.2.2 Vật tư

- Lame - Lamella - Găng tay - Khẩu trang - Kim

- Bàn nóng, bình rót paraffin

- Máy cắt mẫu microtome - Tủ ủ

- Kính hiển vi quang học

3.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM

3.3.1 Tôm và điều kiện thí nghiệm

Tôm sau khi được nuôi thuần hóa trong bể composite 4 ngày được chuyển lên các bể kính thí nghiệm chứa 70 lít nước biển có độ mặn 20 ‰ và nhiệt độ nước là 280C, pH nước 7,5 – 8,5 được duy trì suốt quá trình thí nghiệm Tiến hành 2 thí nghiệm Ở thí nghiệm thứ nhất, tôm (n = 48) được tiêm với liều thấp và ở thí nghiệm thứ hai tôm (n = 48) được tiêm với liều cao Trong mỗi thí nghiệm, mỗi nhóm 6 con tôm được nuôi chung trong 1 bể thí nghiệm chứa 70 lít nước Tôm thí nghiệm được cho ăn mỗi ngày 3 lần: 8; 13 và 18 giờ

Các chỉ tiêu môi trường được theo dõi:

Trong ngày:

Oxy hoà tan 8 giờ 14 giờ

Đầu và cuối đợt thí nghiệm

Amonia Đầu thí nghiệm Cuối thí nghiệm

3.3.2 Virus đốm trắng dòng Việt Nam (WSSV-VN)

Stock virus đốm trắng dòng Việt Nam sau khi chuẩn độ có được nồng độ gây nhiễm 50 % số tôm thí nghiệm (SID50/ml) là 105,32 SID50/ml Từ 105,32SID50/ml tiến hành pha loãng dịch virus trong PBS 1X để có được liều cao (104,0

SID50/ml) và liều thấp (101,5 SID50/ml) Thể tích tiêm cho liều thấp và liều cao là 100 l

3.3.3 Gây nhiễm virus đốm trắng trên tôm sú

Hình 3.1: Hệ thống bể thí nghiệm

Sử dụng kim tiêm insulin (1ml) hút 100 l dịch virus đã được pha loãng và tiêm thẳng vào phần cơ giữa đốt thứ 2 và thứ 3 ở mặt bên của tôm Sau khi tiêm khử trùng chỗ tiêm bằng cồn 70 %

3.3.4 Thời gian theo dõi và thu mẫu để khảo sát quá trình phát sinh bệnh

Thời gian theo dõi và thu mẫu như bảng 3.1 cho cả 2 thí nghiệm Mỗi lần thu mẫu là 6 con/bể và tiến hành trong 60 h

Bảng 3.1: Thời gian theo dõi và thu mẫu tôm sú để khảo sát quá trình phát sinh bệnh

3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1 Phương pháp pha loãng dịch virus

Cách tính để có được liều cao 104,0 SID50/100 l thể tích tiêm (Nghĩa là 104,0SID50/100 µl = 105,0 SID50/1ml)

Cách tính:

Hệ số pha loãng

105,32 SID50.ml-1

=100,32 = 2,089 lần 105 SID50.ml-1

Thể tích dịch virus cần để sử dụng để gây nhiễm thực nghiệm: 100µl x 6con x 8 bể = 4800 µl

Thể tích dịch virus đã được chuẩn độ SID50/ml cần sử dụng để pha loãng:

Hình 3.2: Gây nhiễm virus trên tôm thí nghiệm

Vstock = Vsử dụng /hệ số pha loãng = 4800 l / 2,089 = 2297,7µl (2,2977 ml)

 Thành phần dịch virus liều cao là: 2,2977 ml stock SID50/ml + 2,5023 ml PBS

Cách tính để có được liều thấp 101,5 SID50/100µl thể tích tiêm (nghĩa là 101,5 SID50/100 µl = 102,5 SID50/1ml

Cách tính:

Hệ số pha loãng: 105,32 SID50 ml-1

=102,82 lần = 660,69 lần 102,5 SID50 ml-1

3.4.2 Phương pháp thu mẫu tôm

Thu mẫu tôm phân tích PCR:

Thu chân bơi và 1 – 2 lá mang, cố định trong cồn 950 Thu mẫu tôm phân tích IHC

Ở mỗi thời điểm tiến hành thu phần đầu của 6 con, tiêm và cố định trong dung dịch Davidson từ 24 – 48 h, sau đó chuyển qua cồn 500 ít nhất là 24h

Hình 3.3: Tiêm dung dịch Davidson vào đầu tôm