Theo Qi và ctv (2004), vỏ protein đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của nhiều loại virus khác nhau. Một số loại virus ở ngƣời nhƣ virus sởi, virus vaccinia, các protein vỏ hoạt động nhƣ một protein gắn kết trên bề mặt tế bào để gắn lên tế bào và làm tiền đề cho việc xâm nhiễm. Ở HBV trên vịt, protein vỏ L giúp cho virus di chuyển đến màng tế bào. Tƣơng tự thì protein vỏ của virus đốm trắng cũng thực hiện những chức năng đó. Do đó, protein vỏ này đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus đốm trắng.
Một công trình nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng protein vỏ, VP28, liên quan đến quá trình xâm nhiễm vào cơ thể của tôm bằng một thí nghiệm trung hòa in vivo. Công trình nghiên cứu duy nhất về chức năng của VP28 đã chứng minh rằng nó
chịu trách nhiệm gắn lên các receptor bề mặt tế bào chuyên biệt. Về đặc điểm sinh học của VP28, có 5 vị trí có khả năng thực hiện glycosyl hóa đầu N, 2 vị trí glycosyl hóa đầu O và 9 vị trí có thể thực hiện sự phosphoryl hóa. Tuy nhiên có một vùng kỵ nƣớc cực mạnh hiện diện ở đầu N của VP28. Cấu trúc sinh học của VP28 chứng minh rằng nó có thể đóng vai trò là một protein gắn kết (Qi và ctv, 2004).
Vai trò của VP28
- Protein vỏ VP28 có thể gắn lên các tế bào của tôm và có vai trò quan trọng trong sự tƣơng tác giữa virus và tế bào. Sử dụng kháng thể đơn dòng chống lại VP28, thu đƣợc kết quả kháng thể này trung hòa VP28 ngăn chặn quá trình xâm nhiễm của virus.
- Khả năng gắn kết của VP28 lên tế bào của tôm phụ thuộc vào nồng độ. - Sự gắn kết của VP28 lên tế bào phụ thuộc vào pH. Nghiên cứu của Qi và
ctv (2004) đã chứng minh rằng pH 6.0 là pH tốt nhất cho sự gắn kết lên tế bào của WSSV
- VP28 không chỉ gắn trên tế bào mà còn xâm nhập vào tế bào chất trong quá trình gắn kết và xâm nhập của WSSV vào tế bào của tôm.
Tóm lại, quá trình xâm nhiễm của virus đốm trắng đƣợc mô tả nhƣ sau: Đầu tiên, VP28 trên bề mặt của virus sẽ gắn lên bề mặt của tế bào và làm trung gian cho quá trình xâm nhiễm của virus bằng cách gắn trực tiếp lên các receptor chuyên biệt cho WSSV hay đẩy mạnh quá trình xâm nhập bằng cách hoạt hóa vị trí dung hợp để cho WSSV xâm nhập vào tế bào. Từ đó, VP28 có thể thu đƣợc không chỉ trên bề mặt tế bào mà còn trong tế bào chất (Qi và ctv, 2004).
2.3.2. Cơ chế xâm nhiễm
Cơ quan đích của virus đốm trắng:
Trong giai đoạn đầu của quá trình lây nhiễm, virus đốm trắng xâm nhập vào dạ dày, mang, biểu bì, những mô liên kết của gan tụy. Ở giai đoạn sau đó là cơ quan bạch huyết, tuyến an-ten, mô cơ, mô tạo máu, tim, đoạn ruột sau, và một số phần của ruột giữa. Hệ thần kinh và những cặp mắt kép chỉ bị nhiễm ở giai đoạn cuối. Nhƣ vậy, dạ dày, mang, biểu bì, cơ quan bạch huyết, mô tạo máu, và tuyến an-ten bị nhiễm rất nặng ở giai đoạn cuối (Hendrik Marks, 2005).
Tuy chƣa có báo cáo về đƣờng xâm nhập của WSSV vào tế bào nhƣng các nhà khoa học đã xác định sự sao chép, trƣởng thành và lắp ráp của virion xảy ra trong nhân. Ở nhân, trong giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm, xuất hiện những thể hình sợi, hình hạt (có thể là chất nền của virus), những cấu trúc giống nhƣ màng. Sau đó có thể quan sát thấy những ống dài và rỗng. Những ống nhỏ này vỡ ra thành từng mảnh nhỏ, hình thành nucleocapsid. Có hai giả thuyết về sự phát triển hình dạng WSSV. Theo một số tác giả, trƣớc khi phần lõi đi vào trong thì nucleocapsid đã đƣợc bao phủ bởi màng (envelop), để lại một khoảng hở. Protein nhân (nucleoprotein) dạng sợi chui vào trong capsid qua khoảng hở này. Khi phần lõi hoàn tất, phần bao thu hẹp đầu hở và tạo thành đuôi của virion trƣởng thành. Trái lại, một số tác giả khác lại cho rằng nucleocapsid hoàn chỉnh đƣợc lắp ráp đầu tiên, sau đó mới đƣợc bao lại (Wang và ctv, 2000). Sau khi lắp ráp, virion trƣởng thành có thể kết lại với nhau thành một dãy hoặc phân tán trong dịch nhân. Làm thế nào WSSV virion rời khỏi tế bào chủ vẫn chƣa đƣợc biết rõ nhƣng sau khi virion phá vỡ tế bào nhiễm bệnh thoát ra ngoài, chúng tiếp tục xâm nhập vào các tế bào bên cạnh hoặc theo phân thải ra môi trƣờng ngoài. Tôm ăn phải virus tự do trong bùn ao và nƣớc sẽ nhiễm bệnh (Chou và ctv, 1996; trích bởi Trần Ngọc Ánh Mai, 2005).
2.3.3. Cơ chế lây lan
Quá trình truyền lây xảy ra khi mầm bệnh đƣợc truyền từ nguồn bệnh (cá thể bệnh, yếu tố truyền lây, trực tiếp từ môi trƣờng ngoài) vào cơ thể cá thể khỏe, lúc này cá thể đã bị nhiễm bệnh. Mầm bệnh WSSV có thể truyền lan theo hai trục:
Trục ngang: là con đƣờng chủ yếu. Từ nguồn nƣớc, từ thức ăn, từ các giáp xác hoang dã trong ao, đặc biệt là do tôm khỏe ăn tôm chết do bị bệnh đốm trắng
trong ao, đây là con đƣờng lây lan rất nhanh gây chết tôm hàng loạt (Tookwinas, 1998).
Một số loài tôm hoang dã và giáp xác khác đƣợc xem là vật truyền lan gây bùng nổ bệnh đốm trắng trong ao nuôi khi chúng xâm nhập vào thông qua con đƣờng thay nƣớc (Limsuwan và ctv,1997).
Bằng xét nghiệm sinh học (bioassay) và mô học cho thấy cua, tôm nƣớc ngọt, tôm hùm có thể đóng vai trò nhƣ là vật chủ mang hoặc chuyên chở mầm bệnh không triệu chứng (asymtomatic). Tôm hùm đóng vai trò chính nhƣ là vật chủ dự trữ đối với WSSV; nó có thể bị nhiễm từ phân chim, nƣớc thải ra biển và có thể mang WSSV trong thời gian dài mà không bị bệnh, là nguồn lây nhiễm cho nguồn tôm bố mẹ tự nhiên (Rajendran và ctv, 1999).
Ngoài ra còn có những tác nhân khác nhƣ các loài vật ăn thịt nhƣ cá, chim, chó, mèo sẽ đƣa mầm bệnh từ ao này sang ao khác làm lan tràn dịch bệnh, những tác động của con ngƣời qua thao tác trong quá trình nuôi.
Sử dụng phƣơng pháp lai DNA chỉ ra rằng ruột và mang tôm sú là đƣờng xâm nhập của virus đốm trắng vào cơ quan tạo máu, mang là nơi sinh sản ra virus (Chang và ctv, 1996) .
Trục dọc: biểu hiện sự truyền bệnh từ bố mẹ sang con. Tuy nhiên, khả năng truyền theo trục dọc vẫn chƣa đƣợc chứng minh mặc dù SEMBV đã đƣợc phát hiện trong một số giai đoạn trứng tôm khi quan sát dƣới kính hiển vi điện tử (Tookwinas, 1998).
2.4. Mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn virus trên tôm
Mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn là mô hình đƣợc xây dựng nghiêm ngặt theo những điều kiện, tiêu chí nhất định đƣợc duy trì trong suốt thời gian tiến hành thí nghiệm nhằm gây nhiễm mầm bệnh virus, vi khuẩn trên vật chủ với liều lƣợng xác định nhằm khảo sát đặc tính, đánh giá hoạt lực của mầm bệnh gây ra trên cơ thể vật chủ.
Quá trình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn đƣợc xây dựng ở đây nhằm xác định độc lực của mầm bệnh dựa trên việc xác định ID50 (infectious dose 50%) và LD50
(lethal dose 50%)
2.4.1. ID50 và LD50
- ID50 là liều lƣợng mầm bệnh xác định sử dụng có thể gây nhiễm 50% động vật thí nghiệm.
- Liều gây nhiễm 50 % đồng thời đo lƣờng khả năng chịu đựng của vật chủ đối với một mầm bệnh xác định, từ đó cho ta một cái nhìn khái quát về độc lực của mầm bệnh đó.
B. LD50
LD50 là liều lƣợng mầm bệnh xác định khi sử dụng có thể gây chết 50 % động vật thí nghiệm.
2.4.2. Một số thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm chuẩn trên tôm
Thí nghiệm vaccin (Trích trong bài nghiên cứu “Vaccination of
Penaeus monodon by injection of WSSV structural virion proteins” (Witterveldt,
2002).
Trong thí nghiệm vaccin, tôm có khối lƣợng khoảng 1 g đƣợc tiêm vào cơ ở đốt thứ 4 hoặc 5 của phần bụng với protein tinh sạch pha loãng. 5 ngày sau khi tiêm vaccin lần đầu tiên, tôm đƣợc tiêm tiếp với cùng 1 lƣợng protein. Hai ngày sau khi tiêm lần 2 cho tôm, tôm đƣợc cảm nhiễm bằng tiêm virus đốm trắng với độ pha loãng sao cho đạt đƣợc tỷ lệ chết là 70-90% trong thí nghiệm 1 và tỷ lệ chết là 100% trong thí nghiệm 2. Sau khi cảm nhiễm, tôm đƣợc nuôi trong những hồ riêng biệt để ngăn ngừa tình trạng nhiễm chéo virus đốm trắng.
Chuẩn độ in vivo và cảm nhiễm WSSV trên tôm (Trích trong bài nghiên cứu “Oral vaccination of Penaeus monodon for protection against WSSV”
(Witterveldt, 2004)
Trong thí nghiệm này, tôm đƣợc cảm nhiễm bằng cách ngâm trong nƣớc. Để xác định số lƣợng mong muốn của virus để cảm nhiễm thu đƣợc tỷ lệ chết là 75% virus stock đƣợc chuẩn bị và đƣợc chuẩn độ in vivo. Tôm có khối lƣợng khoảng 1g
đƣợc ngâm vào những dịch WSSV khác nhau trong khoảng thời gian là 7 giờ. Sau đó vớt tôm ra, rửa và đặt vào những hồ riêng biệt để ngăn ngừa sự nhiễm chéo. Sự tử vong của tôm đƣợc ghi lại 2 lần mỗi ngày và tôm chết đƣợc kiểm tra sự hiện diện của WSSV bằng PCR.
Thí nghiệm chuẩn độ virus (Trích trong bài nghiên cứu “In vivo titration of white spot syndrome virus (WSSV) in specific pathogen-free Litopenaeus vannamei
Kích cỡ tôm sử dụng trong thí nghiệm này nhỏ nhất là 6 -7 g. Tôm trong thí nghiệm này đƣợc gây nhiễm qua đƣờng miệng. Quy trình gây nhiễm nhƣ sau: sử dụng một ống hút dẻo vô trùng và một mặt kính phóng đại (2,5X) đặt vào miệng tôm sau đó đặt tôm nằm dọc và chuyển dịch virus vào cơ thể tôm qua đƣờng miệng.
2.5. Phƣơng pháp hóa mô miễn dịch 2.5.1. Nguyên lý 2.5.1. Nguyên lý
Hóa mô miễn dịch (IHC) là kỹ thuật sử dụng kết hợp giữa miễn dịch học và mô học để phát hiện kháng nguyên trong mô. Kháng nguyên đƣợc nhận biết bằng kháng thể chuyên biệt. Phản ứng miễn dịch đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi bằng cách thêm một enzyme, một cơ chất của enzyme và một chất tạo màu để tạo nên một phản ứng màu. Hóa mô miễn dịch là một kỹ thuật rất nhạy và chuyên biệt (ihcworld.com)
Hóa mô miễn dịch đƣợc tiến hành qua các bƣớc cơ bản sau: - Bƣớc 1: Kháng thể ban đầu gắn với kháng nguyên chuyên biệt
- Bƣớc 2: Phức hợp kháng thể - kháng nguyên đƣợc gắn với kháng thể thứ hai, kháng thể này có gắn enzyme
- Bƣớc 3: Với sự hiện diện của cơ chất và chất tạo màu, enzyme hình thành nên một dạng màu sắc ở vị trí gắn kết giữa kháng thể và kháng nguyên
2.5.2. Kháng nguyên
Theo Stites và ctv (1987) kháng nguyên là những chất khi đƣa vào cơ thể một động vật có thể kích ứng một phản ứng miễn dịch mà ta có thể nhận biết đƣợc (miễn dịch thể dịch, miễn dịch tế bào, hay thƣờng là cả hai loại).
Bản chất hóa học của kháng nguyên thƣờng là những đại phân tử protein. Polysaccharide, các polypeptide tổng hợp và những polypeptide khác cũng là kháng nguyên trong những điều kiện thích hợp (Stites và ctv, 1987).
Những phân tử lớn là những kháng nguyên mạnh nhƣng chỉ có một số vùng giới hạn trên những phân tử đó tham gia gắn kết thật sự với vị trí kết hợp trên kháng thể. Những vùng này quyết định tính đặc hiệu của phản ứng kháng nguyên – kháng thể và đƣợc gọi là vùng quyết định (antigen determinant) hay vùng phản ứng. Epitope là dạng đơn giản nhất của vùng phản ứng trong phân tử kháng nguyên phức tạp. Lƣợng vùng phản ứng trên kháng nguyên thay đổi tùy theo kích thƣớc và tính phức tạp của kháng nguyên (Stites và ctv, 1987).
Theo Boenisch và ctv (2002) kháng thể thuộc nhóm protein gọi là globulin miễn dịch (immunoglobulin – Ig). Globulin miễn dịch gồm 5 nhóm chính, đƣợc xếp theo thứ tự giảm dần trong huyết thanh: IgG, IgA, IgM, IgD và IgE. Trong đó, IgG và IgM thƣờng đƣợc dùng trong hóa mô miễn dịch.
Có hai loại kháng thể
A B
Hình 2.5: Kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng (Boenisch và ctv, 2002).
A: Kháng thể đa dòng gắn với các epitope khác nhau trên kháng nguyên B: Kháng thể đơn dòng phản ứng với một epitope đặc hiệu trên kháng nguyên
Kháng thể đa dòng (polyclonal antibodies): Đƣợc tạo ra bởi những tế
bào plasma khác nhau nên thƣờng không đồng nhất về hóa miễn dịch, chúng phản ứng với những epitopes khác nhau trên kháng nguyên đã kích thích tạo ra chúng. Động vật đáp ứng miễn dịch và tạo ra kháng huyết thanh bao gồm nhiều loại kháng thể đặc hiệu và không đặc hiệu. Kháng thể đa dòng dễ sản xuất hơn kháng thể đơn dòng nhƣng có khuyết điểm là ngay cả sau khi tinh sạch, kháng thể đa dòng vẫn có thể chứa những kháng thể phản ứng không đặc hiệu với kháng nguyên
Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody): Đƣợc tạo ra từ một dòng tế
bào plasma nên đồng nhất về hoá miễn dịch, chúng phản ứng với một epitope nhất định trên kháng nguyên đã kích thích tạo ra chúng. Ƣu điểm của kháng thể đơn dòng là độ đồng nhất cao, rất tinh khiết và đặc hiệu.
2.5.4. Các phƣơng pháp nhuộm (theo IHC world)
Có nhiều phƣơng pháp hóa mô miễn dịch có thể dùng để định vị kháng nguyên. việc lựa chọn phƣơng pháp thích hợp dựa trên các thông số nhƣ loại mẫu vật và độ nhạy yêu cầu (IHC world, 2005).
Â
Hình 2.6: Các phƣơng pháp nhuộm IHC
A: Phương pháp nhuộm trực tiếp B: Phương pháp nhuộm gián tiếp
C: phương pháp nhuộm ABC (Avidin – Biotin Complex) D: Phương pháp nhộm PAP (Peroxidase anti-Peroxidase) E: Phương pháp nhuộm LSAB
2.5.4.1. Phƣơng pháp trực tiếp
Phƣơng pháp trực tiếp là phƣơng pháp nhuộm màu một bƣớc và bao gồm kháng thể đƣợc đánh dấu phản ứng trực tiếp với kháng nguyên trên những vùng mô. Kỹ thuật này chỉ sử dụng một kháng thể và quy trình thực hiện thì ngắn và nhanh. Tuy nhiên, phƣơng pháp này không nhạy do sự khuếch đại dấu hiệu quá ít và cũng rất ít đƣợc sử dụng (Hình 2.7.A)
2.5.4.2. Phƣơng pháp gián tiếp
A B C
Phƣơng pháp gián tiếp bao gồm một kháng thể sơ cấp không đƣợc đánh dấu (lớp đầu tiên) phản ứng với kháng nguyên trên mô và một kháng thể thứ cấp đƣợc đánh dấu (lớp hai) phản ứng với kháng thể sơ cấp. Phƣơng pháp này nhạy hơn do sự khuếch đại dấu hiệu thông qua những phản ứng của kháng thể thứ cấp với những vị trí kháng nguyên khác nhau trên kháng thể sơ cấp. Thêm vào đó, phƣơng pháp này cũng rất kinh tế vì một kháng thể thứ cấp đƣợc đánh dấu có thể sử dụng với nhiều kháng thể sơ cấp cho những kháng nguyên khác nhau.
Kháng thể lớp thứ hai có thể đƣợc đánh dấu với thuốc nhuộm huỳnh quang nhƣ: FITC, rhodamine hay Texas red và phƣơng pháp gián tiếp này đƣợc gọi là phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang (immunofluorescent method). Kháng thể thứ hai có thể đƣợc đánh dấu với một enzyme nhƣ peroxidase, alkaline phosphatase hay glucose oxidase và phƣơng pháp này đƣợc gọi là miễn dịch enzyme (Hình 2.7.B)
2.5.4.3. Phƣơng pháp PAP (peroxidase anti – peroxidase method)
Phƣơng pháp PAP là một phƣơng pháp phát triển cao hơn phƣơng pháp gián tiếp. Phƣơng pháp này liên quan đến lớp thứ 3 là kháng thể thỏ gắn với peroxidase để tạo thành phức hợp peroxidase anti – peroxidase ổn định. Phức hợp này, bao gồm gaba – globulin thỏ và peroxidase, hoạt động nhƣ kháng nguyên lớp thứ 3 và có khả năng gắn kết kháng gaba – globulin thỏ ở dê không tiếp hợp của lớp thứ hai. Độ nhạy của phƣơng pháp này cao hơn từ 100 – 1000 lần vì phân tử peroxidase không tiếp hợp hóa học với kháng IgG nhƣng gắn kết miễn dịch và không làm giảm hoạt tính enzyme. Phƣơng pháp này cũng cho phép độ pha loãng của kháng thể sơ cấp cao hơn, do đó loại bỏ đƣợc nhiều kháng thể không mong muốn và giảm sự nhuộm màu nền không chuyên biệt. (Hình 2.7.C)
2.5.4.4. Phƣơng pháp avidin – biotin complex (ABC method)
Phƣơng pháp ABC là phƣơng pháp IHC chuẩn và là một trong những kỹ thuật đƣợc sử dụng rộng rãi trong việc nhuộm màu. Avidin, một glycoprotein lớn, có thể đƣợc đánh dấu bằng peroxidase hoặc fluorescent và có ái lực cao đối với biotin.