Quy trình thực hiện IHC gồm 3 giai đoạn chính
Ủ mẫu trong 24 – 72 giờ
12,5 giờ
Làm lạnh
Ủ mẫu ở 400C
Quy trình 3.4: Các bƣớc thực hiện IHC
Thu mẫu
Cố định mẫu
Xử lý mẫu
Đúc mẫu
Cắt mẫu
Nhuộm IHC và quan sát dƣới kính hiển vi Chuyển mẫu lên lame
Giai đoạn 1: Xử lý mẫu (theo phƣơng pháp mô học)
Bước 1: Xử lý mẫu
Mẫu sau khi đƣợc cố định trong dung dịch Davidson đƣợc chuyển vào cassette và rửa 1 – 2 giờ dƣới vòi nƣớc. Sau đó xử lý theo quy trình 3.2. Quá trình này đƣợc thực hiện bằng máy. Tổng thời gian xử lý là 12,5 giờ
Quy trình 3.5: Các giai đoạn xử lý mẫu
Bước 2: Đúc mẫu
Cho mẫu vào nằm sát đáy khuôn, rót hỗn hợp paraffin vào đầy khuôn, đậy nắp cassette và để nguội.
Sau khi nến đông lại, đặt khuôn lên bàn lạnh cho đến khi tách đƣợc khối paraffin ra khỏi khuôn và đặt lên bàn lạnh cho đến khi mặt cắt cứng lại.
Bước 3: Cắt mẫu
Cắt khối paraffin chứa mẫu bằng máy cắt mẫu microtome. Bề dày lát cắt là 5 m.
Bước 4: Đính mẫu lên lame.
Với mỗi lát cắt, nhỏ cồn 70 % sao cho ƣớt toàn bộ lát cắt rồi chuyển vào nồi nƣớc nóng 400C. Dùng lame (+) vớt mẫu. Sau đó ủ ở 500C cho đến khi mẫu khô hoàn toàn. Cồn 70 % 30 phút Cồn 95 % (1) 30 phút Cồn 95 % (2) 30 phút Cồn 95 % (3) 30 phút Cồn tuyệt đối (1) 30 phút Cồn tuyệt đối (2) 30 phút Cồn tuyệt đối (3) 30 phút Chloroform (1) 1,5 giờ Chloroform (2) 1,5 giờ Paraffin (1) 3 giờ Paraffin (2) 3 giờ
Giai đoạn 2: Tiến hành nhuộm IHC cho mẫu
Quy trình 3.6: Các bƣớc thực hiện IHC
Bước 1: Khử paraffin cho mẫu mô
- Xylene 1 lần 5 phút
- Cồn 100 % 1 lần 5 phút
- Cồn 95 % 1 lần 5 phút
- Cồn 70 % 1 lần 5 phút
- Cồn 50 % 1 lần 5 phút
Nhúng 3 lần trong Tris buffer NaCl pH 7.6. Mỗi lần 5 phút
Bước 2: Ngăn ngừa hoạt động của enzyme nội bào
Ngăn hoạt động của enzyme peroxidase nội bào: Pha dung dịch gồm sodium azide (10 %), Tris - NaCl, H2O2 theo tỉ lệ 25 : 221 : 4. Lƣợng dung dịch cần pha phụ thuộc vào lƣợng lame muốn nhuộm (80μl hỗn hợp/lame). Dùng micropipette hút dung dịch và trải đều lên trên mặt mẫu.
Ủ mẫu 30 phút ở nhiệt độ phòng. Khử paraffin Ngăn hoạt động của enzyme nội bào bằng
SA 10% Ủ với kháng thể thứ nhất Ủ với kháng thể thứ hai Rửa 3 lần với Tris-NaCl 1X Rửa 3 lần với Tris-NaCl 1X Rửa 3 lần với
Tris-NaCl 1X Ủ với HRP Rửa 3 lần với
Tris-NaCl 1X
Hiển thị màu bằng DAB Nhuộm tạo màu nền
với hematoxylin Khử nƣớc Dán keo Baume Canada 30 phút Mỗi lần 5 phút 1 giờ Mỗi lần 3 phút 1 giờ Mỗi lần 3 phút 30 phút Mỗi lần 5 phút
Rửa 3 lần với Tris buffer pH 7,6 + NaCl (5 phút/lần).
Bước 3: Ủ với kháng thể thứ nhất
Pha kháng thể 8B7 mAb (kháng WSSV VP28) với huyết thanh cừu 10% (100 μl huyết thanh cừu + 900 μl tris buffer pH 7,6) theo tỉ lệ 1:30. Lƣợng dung dịch cần pha và cách sử dụng tƣơng tự bƣớc 3.
Ủ mẫu 1 giờ ở 370
C .
Rửa 3 lần với Tris buffer pH 7,6 + NaCl (3 phút/ lần).
Bước 4: Ủ với kháng thể thứ hai
Pha kháng thể thứ hai (kháng thể của cừu có gắn biotin kháng lại kháng thể 1 từ chuột) với huyết thanh cừu 10% (100 μl huyết thanh cừu + 900 μl tris buffer pH 7,6) theo tỉ lệ 1:200. Lƣợng dung dịch cần pha và cách sử dụng tƣơng tự bƣớc 3.
Ủ mẫu trong 1 giờ ở 370
C.
Rửa 3 lần với Tris buffer pH 7,6 + NaCl (3 phút/lần)
Bước 5: Ủ với Streptavidine-biotin HRP
Pha phức hợp streptavidine-biotinylated horseradise peroxidase với huyết thanh cừu 10% (100 μl huyết thanh cừu + 900 μl tris buffer pH 7,6) theo tỉ lệ 1:200. Lƣợng dung dịch cần pha và cách sử dụng tƣơng tự bƣớc 3.
Ủ mẫu trong 30 phút tại nhiệt độ phòng.
Rửa 3 lần với Tris buffer pH 7,6 + NaCl (5 phút/lần).
Bước 6: Làm hiển thị màu bằng DAB
Pha DAB trong Tris buffer pH 7,6 không có NaCl (0,5mg DAB/ml Tris buffer). Bổ sung ngay trƣớc khi dùng H2O2 (30 %) với tỉ lệ 3H2O2 : 5Tris buffer.
Nhúng lame mẫu vào dung dịch và ủ vài phút tại nhiệt độ phòng.
Kiểm tra sự hiện màu (màu nâu tích tụ trong tế bào nhiễm virus) trong phút đầu tiên sau khi nhúng lame vào dung dịch DAB. Dừng phản ứng bằng cách nhúng lame trong tris buffer pH 7,6 + NaCl.
Bước 7: Nhuộm tạo nền tƣơng phản bằng cách nhúng lame vài lần vào dung
dịch hematoxylin pha loãng.
Rửa cẩn thận với nƣớc cất 2 lần cho đến khi hết hematoxylin trên lamee.
Bước 8: Khử nƣớc
Ethanol 50% 1 lần 5 phút/lần. Ethanol 70% 1 lần 5 phút/lần.
Ethanol 95% 1 lần 5 phút/lần. Ethanol 100% 1 lần 5 phút/lần.
Xylene 1 lần 5 phút/lần.
Bước 9: Dán lamella với Baume Canada.
Lame sau khi lấy ra khỏi xylene để khô trong vài phút, nhỏ một giọt keo Baume Canada ngay trên tiêu bản mẫu, đặt lamella lên lame kính, tránh hiện tƣợng có bọt khí bên trong.
Giai đoạn 3: Đọc kết quả
Tiến hành đọc kết quả ở các vật kính 10X, 40X và 100X. Quan sát các tế bào nhiễm WSSV bị trƣơng nhân và bắt màu nâu trên các cơ quan: lympho, ruột giữa, gan tụy, tim, mang, mô tạo máu, ruột trƣớc, tuyến anten, dạ dày và biểu mô dƣới vỏ.