KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA BAP, NAA VÀ BA DỊCH CHIẾT TỰ NHIÊN ĐẾN SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN GIỐNG LAN REN (Renanthera sp.) TRONG NUÔI CẤY IN-VITRO

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA BAP, NAA VÀ BA DỊCH CHIẾT TỰ NHIÊN ĐẾN SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN GIỐNG LAN REN (Renanthera sp.) TRONG NUÔI CẤY IN-VITRO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA BAP, NAA VÀ BA DỊCH CHIẾT TỰ NHIÊN ĐẾN SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN GIỐNG LAN

REN (Renanthera sp.) TRONG NUÔI CẤY IN-VITRO

Họ và tên sinh viên: PHẠM THANH HUYỀN Ngành: NÔNG HỌC

Niên khóa: 2004 – 2008

Tháng 11 /2008

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA BAP, NAA VÀ BA DỊCH CHIẾT TỰ NHIÊN ĐẾN SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN GIỐNG LAN

REN (Renanthera sp.) TRONG NUÔI CẤY IN-VITRO

Tác giả

PHẠM THANH HUYỀN

(Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng kỹ sư ngành Nông Học)

Giáo viên hướng dẫn:

ThS NGUYỄN CHÂU NIÊN KS BÙI THÙY LINH

Tháng 11/2008

cũng xin được gửi đến cô Bùi Thuỳ Linh - người đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em

trong suốt quá trình thực tập tại phòng thí nghiệm bộ môn Di Truyền Giống của khoa Nông Học

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô khoa Nông Học trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tận tình giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường

Xin cảm ơn tất cả bạn bè, thân hữu đã giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình học tập tại trường

Sau cùng, xin chúc quý thầy cô Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh lời chúc sức khoẻ và thành công trong công tác đào tạo

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng 11 năm 2008

Sinh viên thực hiện:

Phạm Thanh Huyền

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Khảo sát ảnh hưởng của BAP, NAA và ba dịch chiết hữu cơ đến

sinh trưởng, phát triển giống lan Ren (Renanthera sp.) trong nuôi cấy in-vitro” được

tiến hành tại phòng nuôi cấy mô, bộ môn Di Truyền Giống, khoa Nông Học, trường ĐH Nông Lâm, thời gian thực hiện từ ngày 2/6 đến 2/10 năm 2008 Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên Đề tài nhằm theo dõi sự sinh trưởng, phát triển

của lan Ren đối với in-vitro, khi thay đổi nồng độ chất điều hoà sinh trưởng BAP và

NAA, dịch chiết nước dừa, khoai tây và chuối xanh trong môi trường nuôi cấy

Kết quả đạt được:

Sử dụng chất điều hoà sinh trưởng BAP và NAA trong nhân giống in-vitro:

Hai công thức môi trường có sự kết hợp giữa BAP và NAA thích hợp cho sự sinh trưởng, phát triển của lan Ren nuôi cấy mô là:

- Khoáng MS + 8,5agar + 30g/l sucrose + 0,5g/l than + 1,5mg/lít BAP + 0,2mg/lít NAA

- Khoáng MS + 8,5agar + 30g/l sucrose + 0,5g/l than + 0,4mg/lít NAA + 0,5mg/lít BAP

Sử dụng các dịch chiết hữu cơ:

Đối với các dịch chiết hữu cơ: đưa vào môi trường nuôi cấy hàm lượng dịch chiết hữu cơ thích hợp nhằm làm tăng sự sinh trưởng phát triển của hoa lan Ren Các công thức môi trường cụ thể như sau:

- Khoáng MS + 8,5agar + 30g/l sucrose + 0,5g/l than + 200ml/lít nước dừa

- Khoáng MS + 8,5agar + 30g/l sucrose + 0,5g/l than + 100ml/lít dịch chiết khoai tây

- Khoáng MS + 8,5agar + 30g/l sucrose + 0,5g/l than + 50ml/lít dịch chiết chuối xanh

Chương 2TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về nuôi cấy mô thực vật 3

2.1.1 Khái niệm 3

2.1.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 3

2.2 Các phương pháp nhân giống in-vitro 6

2.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 6

2.2.2 Nuôi cấy mô sẹo 7

2.2.3 Nuôi cấy tế bào đơn 7

2.2.4 Nuôi cấy protoplast- chuyển gen 8

2.2.5 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội 8

2.3 Các bước vi nhân giống và những hiện tượng thường gặp 8

2.3.1 Các bước vi nhân giống 8

2.3.2 Những trường hợp thường gặp trong nuôi cấy 9

2.4 Tình hình sản xuất lan trên thế giới và Việt Nam 9

2.4.1 Trên thế giới 9

2.4.2 Tại Việt Nam 10

2.5 Vai trò các chất điều hoà sinh trưởng dịch chiết hữu cơ trong nuôi cấy in-vitro 10

2.5.1 Auxin 10

2.5.2 Các cytokinine 11

2.5.3 Dịch chiết xuất hữu cơ từ trái cây, củ quả 12

2.6 Giới thiệu về lan Renanthera sp 12

2.6.1 Nguồn gốc 12

2.6.2 Đặc điểm thực vật học 13

2.6.3 Đặc điểm sinh thái 14

2.6.4 Kỹ thuật trồng lan Ren 14

Chương 3VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm 16

3.2 Phương tiện thí nghiệm 16

3.2.1 Đối tượng thí nghiệm 16

Chương 4KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

4.1 Thí nghiệm theo dõi ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng đến sinh trưởng, phát triển của lan Ren 21

4.1.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của 5 nồng độ BAP và 2 nồng độ NAA đến khả năng sinh trưởng, phát triển của lan Ren in-vitro 21

4.1.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của 5 nồng độ NAA và 2 nồng độ BAP đến khả năng sinh trưởng, phát triển của lan Ren in-vitro 29

4.2 Thí nghiệm theo dõi ảnh hưởng của dịch chiết hữu cơ đến sự sinh trưởng, phát triển của lan Ren 36

4.2.1 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa đến khả năng sinh trưởng, phát triển của lan Ren in-vitro 36

4.2.2 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng dịch chiết khoai tây đến khả năng sinh trưởng, phát triển của lan Ren in-vitro 39

4.2.3 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng dịch chiết Chuối Xanh đến khả năng sinh trưởng, phát triển của lan Ren in-vitro 41

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ANOVA : Analysis of Variance BAP : 6 - Benzylaminopurine Ctv : Cộng tác viên

MS : Murashige và Skoog (1962) MTN : Môi trường nền

NAA : α – napthylacetic acid

REN : Renanthera sp

NSC : Ngày sau cấy

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1: Đặc điểm thực vật học của lan Ren 13

Hình 2.2: Một số giống hoa lan Ren 15

Hình 4.1: Ảnh hưởng của BAP và NAA đến sinh trưởng, phát triển của lan Ren 28

Hình 4.2: Ảnh hưởng của NAA và BAP đến sinh trưởng và phát triển lan Ren 30

Hình 4.3: Ảnh hưởng của dịch chiết nước dừa đến sinh trưởng của lan Ren in-vitro 38

Hình 4.4: Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây đến sinh trưởng, phát triển lan Ren 40

Hình 4.5: Ảnh hưởng của dịch chiết chuối xanh đến sinh trưởng, phát triển lan Ren 43

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 1: Ảnh hưởng BAP và NAA đến chỉ tiêu số lá của lan Ren in-vitro 48

Biểu đồ 2: Ảnh hưởng BAP và NAA đến chỉ tiêu số rễ của lan Ren in-vitro 48

Biểu đồ 3: Ảnh hưởng BAP và NAA đến chỉ tiêu chiều cao chồi của lan Ren in-vitro 48

Biểu đồ 4: Ảnh hưởng BAP và NAA đến chỉ tiêu chiều dài lá của lan Ren in-vitro 48

Biểu đồ 5: Ảnh hưởng BAP và NAA đến chỉ tiêu chiều dài rễ của lan Ren in-vitro 48

Biểu đồ 6: Ảnh hưởng BAP và NAA đến trọng lượng tươi của lan Ren in-vitro 48

Biểu đồ 7: Ảnh hưởng NAA và BAP đến chỉ tiêu số lá của lan Ren in-vitro 49

Biểu đồ 8: Ảnh hưởng NAA và BAP đến chỉ tiêu số rễ của lan Ren in-vitro 49

Biểu đồ 9: Ảnh hưởng NAA và BAP đến chỉ tiêu chiều cao chồi của lan Ren in-vitro 49

Biểu đồ 10: Ảnh hưởng NAA và BAP đến chỉ tiêu chiều dài lá của lan Ren in-vitro 49

Biểu đồ 11: Ảnh hưởng NAA và BAP đến chỉ tiêu chiều dài rễ của lan Ren in-vitro 49

Biểu đồ 12: Ảnh hưởng NAA và BAP đến trọng lượng tươi của lan Ren in-vitro 49

Biểu đồ 13: Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa đến chỉ tiêu số lá của lan Ren in-vitro 50

Biểu đồ 14: Ảnh hưởng hàm lượng nước dừa đến chỉ tiêu chiều dài lá lan Ren in-vitro 50

Biểu đồ 15: Ảnh hưởng hàm lượng nước dừa đến trọng lượng tươi lan Ren in-vitro 50

Biểu đồ 16: Ảnh hưởng dịch chiết khoai tây đến chỉ tiêu số lá lan Ren in-vitro 50

Biểu đồ 17: Ảnh hưởng dịch chiết khoai tây đến chỉ tiêu chiều dài lá lan Ren in-vitro 50

Biểu đồ 18: Ảnh hưởng dịch chiết khoai tây đến trọng lượng tươi lan Ren in-vitro 50

Biểu đồ 19: Ảnh hưởng dịch chiết chuối xanh đến chỉ tiêu số lá của lan Ren in-vitro 51

Biểu đồ 20: Ảnh hưởng dịch chiết chuối xanh đến chỉ tiêu chiều dài lá Ren in-vitro 51

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 4.1: Ảnh hưởng BAP và NAA đến chỉ tiêu số lá (lá/chồi) của lan Ren in-vitro 22

Bảng 4.2: Ảnh hưởng BAP và NAA đến chỉ tiêu chiều dài lá (mm) của lan Ren 23

Bảng 4.3: Ảnh hưởng BAP và NAA đến chỉ tiêu số rễ (rễ/chồi) của lan Ren in-vitro 24

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của BAP và NAA đến chiều dài rễ (mm) lan Ren sau 90NSC 25

Bảng 4.5: Ảnh hưởng BAP và NAA đến chỉ tiêu chiều cao chồi (mm) lan Ren in-vitro 26

Bảng 4.6: Ảnh hưởng BAP và NAA đến trọng lượng tươi (g) lan Ren in-vitro 27

Bảng 4.7: Ảnh hưởng NAA và BAP đến chỉ tiêu số lá (lá/chồi) của lan Ren in-vitro 29

Bảng 4.8: Ảnh hưởng NAA và BAP đến chỉ tiêu chiều dài lá (mm) lan Ren in-vitro 31

Bảng 4.9: Ảnh hưởng NAA và BAP đến chỉ tiêu số rễ (rễ/chồi) của lan Ren in-vitro 32

Bảng 4.10: Ảnh hưởng NAA và BAP đến chỉ tiêu chiều dài rễ (mm) lan Ren in-vitro 33

Bảng 4.11: Ảnh hưởng NAA và BAP đến chỉ tiêu chiều cao chồi của lan Ren in-vitro 34

Bảng 4.12: Ảnh hưởng NAA và BAP đến trọng lượng tươi (g) của lan Ren in-vitro 36

Bảng 4.13: Ảnh hưởng của nước dừa đến chỉ tiêu số lá và chiều dài lá của lan Ren 37

Bảng 4.14: Ảnh hưởng nước dừa đến trọng lượng tươi (g) lan Ren in-vitro 38

Bảng 4.15: Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây đến số lá và chiều dài lá lan Ren 39

Bảng 4.16: Ảnh hưởng dịch chiết khoai tây đến trọng lượng tươi (g) lan Ren in-vitro 41

Bảng 4.17: Ảnh hưởng dịch chiết chuối xanh đến chỉ tiêu số lá của lan Ren in-vitro 42

Bảng 4.18: Ảnh hưởng dịch chiết chuối xanh đến trọng lượng tươi (g) Ren in-vitro 43

Nhiều nhóm nghiên cứu về Stress đã đưa ra kết quả thật bất ngờ Đó là, chính hoa – cây kiểng là giải pháp giải quyết một cách tốt đẹp và hữu hiệu đến thần kỳ cho căn bệnh tinh thần STRESS này Cộng với việc nước ta nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa được thiên nhiên ưu đãi, có bốn mùa trong năm thuận lợi cho sự phát triển nông nghiệp, đặc biệt là ngành trồng hoa – cây kiểng Một ngành vừa mang lại giá trị giải trí, nghệ thuật lại vừa mang lại cả giá trị kinh tế cao Vì thế trong những năm gần đây nghề trồng hoa – cây kiểng được chú trọng nhiều hơn Thú chơi hoa – cây kiểng cũng xuất hiện nhiều và phổ biến hơn trong nhiều hộ gia đình Loài hoa luôn giành được sự chú ý và quan tâm nghiên cứu nhiều nhất là hoa Lan, một loài hoa với muôn màu muôn sắc và hương thơm thật hấp dẫn, còn được phong tặng danh hiệu là nữ chúa của các loài hoa

Như chúng ta đã biết hoa Lan xuất hiện với sự phong phú đến muôn hình muôn vẻ về kiểu dáng từ cấu trúc hình thể đến màu sắc Một số thì mộc mạc giản dị, dễ trồng và phổ biến, một số khác thì lại khoác trên mình một vẻ đẹp kiêu sa đến mức được nâng niu vì sự quí hiếm của nó

Một ví dụ chứng minh ở đây là giống Lan lai Ren với giá trị của nó được giới chơi hoa tính theo chiều cao Ren là giống Lan lai còn rất quí hiếm ở Việt Nam, chưa được nhiều người biết đến Lan Ren đã thể hiện sự vượt trội đẳng cấp của mình từ vẻ đẹp sắc sảo của hoa, lượng hoa lớn trên một phát hoa, kích cỡ khổng lồ của phát hoa

đến vẻ cứng cáp bên ngoài của cây Ren thực sự khiến người ta phải ngưỡng mộ và

trầm trồ trước vẻ đẹp của chính mình Qua đó và được sự đồng ý của bộ môn Di Truyền - Giống, ban chủ nhiệm khoa Nông Học, trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tôi thực hiện đề tài “ khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường nuôi cấy in-vitro trong nhân giống lan Ren”

dụng cho nhân giống lan Ren in-vitro

2 Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về nuôi cấy mô thực vật

2.1.1 Khái niệm

Nuôi cấy mô thực vật hay nhân giống in-vitro đều là thuật ngữ mô tả phương

thức nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa các môi trường xác định ở điều kiện vô trùng Trong môi trường có các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các hormones tăng trưởng và đường

2.1.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.1.2.1 Thế giới

Năm 1838, hai nhà sinh vật Đức Schleiden và Schwann đã đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ: mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm những đơn vị nhỏ các tế bào hợp thành Các tế bào đã phân hóa đều mang các thông tin di truyền có trong các tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh, là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng toàn bộ cơ thể

Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa các giả thuyết của Schleiden và Schwann vào thực nghiệm để chứng minh tính toàn thế của tế bào, nhưng ông đã thất bại trong nuôi cấy các tế bào đã phân hóa tách từ lá một số cây một lá mầm Ngày nay, chúng ta đã biết được nguyên nhân thất bại là vì cây một lá mầm là đối tượng rất khó nuôi cấy, hơn nữa, ông lại dùng các tế bào đã mất hết khả năng tái sinh

Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, khi White

(người Mỹ), nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) Cũng trong thời gian này, ở Pháp đã tiến hành nuôi cấy mô tế bào tượng

tầng một số cây gỗ và xác nhận tác dụng kích thích sinh trưởng mô sẹo của acid – β – Indolactic (IAA) và nhóm ba vitamin B do White đề nghị: Thiamin (B1), Pyridoxin (B6), Nicotinic acid Việc phát hiện IAA, NAA, 2,4-D và Kinetin cùng với phát hiện

vitamin và nước dừa là những bước tiến rất quan trọng trong gian đoạn thứ hai của nuôi cấy mô thực vật

Năm 1954, Skoog và Miller đã công bố kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ Cytokinin/Auxin Nếu tỷ lệ Cytokinin/Auxin thấp ảnh hưởng đến rễ và ngược lại nếu tỷ lệ này cao sẽ kích thích tạo chồi ở mô sẹo thành công của Skoog và Miller dẫn đến những phát hiện quan trọng khác, mở đầu cho giai đoạn thứ ba cho lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật

Trong thời gian từ năm 1945 đến 1954, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn (các tế bào sống độc lập không dính với các tế bào khác) đã được phát triển Nuir, Hildebrandt và Riker đã tách các tế bào của mô sẹo thành một huyền phù các tế bào đơn bằng cách lắc trên máy lắc

Năm 1956, Nickell nuôi liên tục được một huyền phù tế bào đơn cây đậu (Phaseolus vulgaris)

Năm 1959, Melchers và Beckman đã nuôi liên tục các tế bào đơn trong bình có dung tích khá lớn bằng cách sục khí liên tục và thỉnh thoảng thu hoạch tế bào, thêm dung dịch dinh dưỡng mới

Năm 1960, Morel đã nhận thấy các đỉnh sinh trưởng của các loài địa lan

(Cymbidium) khi đem nuôi cấy sẽ hình thành các Protocorm Khi chia cắt các

Protocorm và nuôi cấy tiếp thì được các Protocorm mới Khi để trong các điều kiện nhất định thì Protocorm có thể phát triển thành cây lan con Morel có thể phục tráng tạo các dòng vô tính không bị nhiễm virus Kỹ thuật này đặc biệt có giá trị đối với khoai tây, dâu tây, cây ăn quả và nhiều cây nhân giống vô tính khác

Cũng trong năm 1960, Bergman công bố có thể sử dụng phương pháp lọc đơn giản để thu được huyền phù không có các tế bào dính cụm Cùng với kỹ thuật gieo tế bào của Bergman, nhiều tác giả khác đã thành công trong việc tạo cây hoàn chỉnh từ một tế bào, chứng minh dược tính toàn năng của tế bào thực vật

Sau đó, Cooking ở trường đại học Nottingham (Anh) công bố có thể dùng men cellulose để phân hủy vỏ cellulose của tế bào thực vật, kết quả thu được các tế bào tròn, không có vỏ bọc gọi là Protoplast

Người ta thực sự chú ý đến triển vọng của Protoplast vào đầu những năm 1970, khi tác giả Nhật Nagata và Takebe thành công trong việc làm cho các Protoplast tách

từ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia và tạo nên một quần thể tế bào trong môi trường lỏng, các Protolast có khả năng dung hợp với nhau trong các điều kiện nhất định và hấp thu các phân tử bên ngoài, các nhà nuôi cấy mô đặt hy vọng vào kỹ thuật này để nhân giống có kết quả hơn

Năm 1965, Ledoux và cộng tác viên đề xứng việc biến tính của tế bào thực vật Ông cho rằng các tế bào, thậm chí các hạt giống thực vật, đều có khả năng hấp thu AND ngoại lai vào trong tế bào

Năm 1966, Guha và Maheswari công bố tạo thành công cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dược (Datura inoxia) Từ đó người ta bắt đầu chú ý đến kỹ thuật nuôi cấy túi phấn

Năm 1967, nhóm Bourgin và Nisch tạo thành công cây đơn bội từ túi phấn cây thuốc lá Đến nay, việc tạo cây đơn bội thông qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn đã thành công ở nhiều loại cây trồng

Từ năm 1980 đến 1992 hàng loạt các thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gene thực vật được công bố Nhờ các plasmid, phân tử AND vòng thường có trong các tế bào vi khuẩn, được lắp ghép, cấu trúc lại sao cho trong plasmid có gắn thêm một gene xác định và đã thực hiện thành công

Ngoài phương pháp chuyển gene thông qua vi khuẩn, còn có các phương pháp chuyển gene khác như: kỹ thuật sử dụng xung điện (electroporation), kỹ thuật vi tiêm (micro injection), sử dụng siêu âm (ultrasonic gene transfer), súng bắn gene (gene gun) đang được các phòng thí nghiệm trên thế giới phát triển mạnh và đạt kết quả tốt

Chúng ta đang bắt đầu giai đoạn thứ tư của nuôi cấy mô tế bào thực vật Đó là giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và vào nghiên cứu lý luận di truyền bậc cao Các hiểu biết cơ bản về đời sống của mô, tế bào đơn độc trong môi trường nhân tạo, nhu cầu chất khoáng, vitamin, chất sinh trưởng, nguồn carbon của chúng Các kỹ thuật để tách, nuôi cấy, điều khiển sự phân hóa từ các biện pháp khác của chương trình là tiền đề được chuẩn bị trong các giai đoạn trước

2.1.2.2 Việt Nam

Sau năm 1975, nước ta mới bắt đầu chú trọng đến kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào đầu tiên được xây dựng tại Viện Sinh Học, Viện

Khoa Học Việt Nam do tiến sĩ Lê Thị Muội khởi xướng Bước đầu phòng tập trung nghiên cứu các phương pháp nghiên cứu cơ bản trong điều kiện Việt Nam, như nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy mô sẹo và Protoplast Và đã thành công khi nuôi cấy bao phấn lúa và thuốc lá được công bố vào năm 1978 (Lê Thị Muội và ctv., 1978; Lê Thị Xuân và ctv., 1978) Tiếp đó là thành công nuôi cấy Protoplast khoai tây (Lê Thị Muội và Nguyễn Đức Thành, 1978; Nguyễn Đức Thành và Lê Thị Muội, 1980, 1981) Tiếp theo là phân viện Khoa Học Việt Nam ở TPHCM, sau đó ĐH Nông Nghiệp I Hà Nội, và Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Việt Nam và các phòng thí nghiệp nuôi cấy mô tế bào cũng được thành lập và chủ yếu tập trung vào vi nhân giống khoai tây Đến nay chúng ta đã có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô không những ở các Viện nghiên cứu ( Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Viện Rau Quả Trung Ương), mà có cả ở một số tỉnh và cơ sở sản xuất ( Đà Lạt, Yên Bái, Hưng Yên, Thanh Hóa, Cần Thơ, Nghệ Tĩnh)

Từ giữa 1980 đến nay, hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật phát triển mạnh Những kết quả đáng khích lệ đã đạt được trong lĩnh vực vi nhân giống khoai tây (Viện Công Nghệ Sinh Học, Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Viện Lâm Nghiệp) Một số kết quả bước đầu đã được ghi nhận trong lĩnh vực chọn dòng tế bào kháng bệnh ( Lê Bích Thủy và ctv., 1994), chọn dòng chịu muối, chịu mất nước (Nguyễn Tường Vân và ctv., 1994; Định Thị Tòng và ctv., 1994) Các kết quả về dung hợp tế bào trần, chuyển gen lục lạp cũng thu được kết quả lý thú (Nguyễn Đức Thành và ctv., 1993, 1997) Nuôi cấy bao phấn để tạo dòng thuần đã được ứng dụng nhiều tại Viện Công Nghệ Sinh Học và Di Truyền Giống Nông Nghiệp Nuôi cấy các cây dược liệu quí để bảo tồn nguồn gen và tạo các dòng tế bào có hàm lượng sinh học quan trọng cũng đã và đang được phát triển (Phan Huy Bảo và Lê Thị Xuân, 1998; Phan Thị Bảy và ctv., 1995; Bùi Bá Bổng, 1995)

2.2 Các phương pháp nhân giống in-vitro

2.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên

Sau khi vô trùng, mẫu được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ chất dinh dưỡng có khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp Từ một đỉnh sinh trưởng, sau một khoảng thời gian nuôi

cấy nhất định, mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi Chồi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và rễ để trở thành một cây hoàn chỉnh

Ứng dụng:

- Phục tráng giống

- Nhân giống in-vitro

- Tạo cây đa bội thông qua xử lý colchicin - Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan

2.2.2 Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, phát triển nhanh trên môi trường giàu auxin Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây con hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo

Ứng dụng:

- Nhân giống in-vitro các loại thực vật không có khả năng nhân giống thông qua

nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

- Làm nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào đơn, thu nhận các chất có hoạt tính sinh học - Nguyên liệu cho chọn dòng tế bào

- Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan

2.2.3 Nuôi cấy tế bào đơn

Các tế bào đơn tách từ mô thực vật bằng phương pháp nghiền hoặc xử lý enzyme Sau đó chúng được nuôi cấy dịch lỏng, có khuấy hoặc lắc tạo điều kiện thuận lợi cho sự trao đổi khí và tiếp xúc với các chất dinh dưỡng (Thomas and Davey, 1975) Một số tác giả thì sử dụng mô sẹo để nuôi cấy tế bào đơn (Trần Văn Minh,1994)

Yêu cầu dinh dưỡng cho nuôi cấy tế bào đơn khá phức tạp, do chúng bị mất nhiều chất cần thiết cho sự sinh trưởng khi tách rời khỏi quần thể tế bào Vì thế cần chọn lựa môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy phù hợp cho nuôi cấy tế bào đơn (King and Street, 1977)

2.2.4 Nuôi cấy protoplast- chuyển gen

Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulose, có sức sống và duy trì đầy đủ các chức năng sẳn có

Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh (tính toàn thế ở thực vật)

Khi tế bào mất vách, hai protoplast có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng Quá trình dung hợp protoplast có thể được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài

Ứng dụng:

- Tạo con lai soma nhờ phương pháp dung hợp protoplast - Chuyển các bào quan hoặc cả nhân vào tế bào

- Quá trình sinh tổng hợp màng tế bào

2.2.5 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội

Nguyên liệu dùng cho nuôi cấy là bao phấn hoặc hạt phấn tách rời Trong nuôi cấy bao phấn và hạt phấn, tuỳ từng loại thực vật mà sử dụng môi trường thích hợp để tạo mô sẹo Từ mô sẹo sẽ tái sinh thành cây hoàn chỉnh có 1n gọi là cây đơn bội Tỷ lệ tạo cây đơn bội sẽ phụ thuộc các yếu tố như:

- Tuổi của hạt phấn - Tuổi của mô sẹo

- Xử lý bao phấn ở nhiệt độ lạnh

- Để tạo cây đơn bội kép, có thể xử lý mô hoặc cây đơn bội với colchicine (0.5%) trong 24-48 giờ

2.3 Các bước vi nhân giống và những hiện tượng thường gặp

2.3.1 Các bước vi nhân giống

- Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng - Tạo thể nhân giống in-vitro - Nhân giống in-vitro

- Tạo cây con hoàn chỉnh in-vitro và huấn luyện cây con - Chuyển cây ra vườn ươm

- Nhân giống lên luống ươm - Đưa cây con vào bầu đất

- Trồng cây ra ruộng - Chọn lọc cây đầu dòng

2.3.2 Những trường hợp thường gặp trong nuôi cấy

2.3.2.3 Hiện tượng thuỷ tinh thể

Là một dạng bệnh lý của cây, thân lá cây trong suốt và chứa nhiều nước, khó nhân giống Để hạn chế quá trình hoá thuỷ tinh thể, cần tăng nồng độ đường hoặc giảm nồng độ đạm trong môi trường nuôi cấy, tạo thông gió, tăng ánh sáng hay giảm nhiệt độ phòng nuôi cấy

2.4 Tình hình sản xuất lan trên thế giới và Việt Nam

2.4.2 Tại Việt Nam

Nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, ẩm độ trung bình cao (82%), nhiệt độ trung bình hằng năm 27C, năng lượng bình quân 500 kcal/m2, rất thích hợp cho sự tăng trưởng và phát triển của lan Theo Phạm Hoàng Hộ (1993), lan rừng Việt Nam được biết có hơn 750 loài khác nhau Với số lượng đó, Việt Nam cũng là một trong những nước có lan nhiều trên thế giới Dựa vào điều kiện tự nhiên mà người ta phân bố vùng trồng lan nước ta chia làm 2 vùng:

Vùng có khí hậu nóng ẩm: Thành Phố Hồ Chí Minh, các tỉnh Nam Bộ, Trung Bộ… ngoài những chủng lan rừng còn có các giống lan lai nhập nội như: Vanda, Dendrobium, Oncidium, Mokara, Phalaenopsis

Vùng khí hậu lạnh: Đà Lạt và các tỉnh phía Đông Bắc trồng chủ yếu là Cymbidium, Phalaenopsis, Oncidium

2.5 Vai trò các chất điều hoà sinh trưởng dịch chiết hữu cơ trong nuôi cấy in-vitro

Các chất điều hoà sinh trưởng là những chất có bản chất hoá học khác nhau nhưng có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng, phát triển của cây

Trong nuôi cấy in-vitro, thường sử dụng hai nhóm chính có vai trò cơ bản là

auxin và cytokinin Ngoài hai nhóm chất căn bản trên, các chất điều hoà khác có thể cần thiết nhưng phần lớn thời gian chúng chỉ kích thích hoặc làm thuận lợi cho mô và hiếm khi là chất thiết yếu (Bùi Trang Việt, 2000)

2.5.1 Auxin

Auxin được tổng hợp từ các thực vật bậc cao, tảo, nấm, và cả vi khuẩn Cơ quan tổng hợp auxin trong cây chủ yếu là đỉnh sinh trưởng ngọn, càng xa đỉnh ngọn hàm lượng auxin càng giảm Ngoài đỉnh ngọn, auxin còn được tổng hợp ở một số cơ quan đang sinh trưởng như lá non, trái non, phôi hạt nhưng rất ít

2.5.1.1 Tính chất sinh lí của auxin

- Tác động rõ ràng lên sự kéo dài tế bào - Thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào

- Kích thích phân bào ở tượng tầng phát sinh gỗ và kết hợp với cytokinin trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

- Kích thích phát sinh rễ - Tạo ưu thế ngọn

- Làm chậm quá trình lão hoá ở lá

- Ức chế hay thúc đẩy (thông qua ethylene) sự rụng lá và trái - Làm chậm chín

2.5.1.2 Auxin trong cây trồng

Auxin tự nhiên được tìm thấy ở thực vật là indole-3-acetic acid (IAA), hiện diện cao trong vùng phân sinh mô của thực vật

2.5.1.3 Các chất auxin tổng hợp

Auxin tổng hợp được sử dụng rộng rãi nhất là indole-3-butyric acid napthaleneacetic acid (NAA) và 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) Các auxin này thường được kết hợp liên kết với cytokinin

(IBA),alpha-Trong thực tế, auxin có thể được sử dụng, nó ít độc nhưng cũng ít hiệu quả Chính vì vậy mà các chất tổng hợp đã thay thế chất auxin, mặc dù các nguy hại về độc tính thì cao hơn Trong những ứng dụng thực tiễn, các chất có cấu trúc auxin được sử dụng để giâm cành, chúng cũng được tìm thấy trong các ứng dụng quan trọng trong ngành cây ăn quả để làm sáng các quả, đậu quả hoặc làm chậm sự thu hoạch quả

2.5.2 Các cytokinine

Cytokinine hình thành chủ yếu trong hệ rễ thực vật Ngoài ra ở một số cơ quan của cây còn non, đang sinh trưởng mạnh cũng có khả năng tổng hợp cytokinine như chồi, lá non, trái non,

Cytokinine là các chất adenine được thay thế, có hai nhóm nội sinh là: - Zeatine

- Isopentenyladenine (IPA), cytokinine tự nhiên và các chất tổng hợp Có hai loại được sử dụng nhiều nhất là:

Kinetine (6 furfuryl – aminopurine)

Benzyladenine (BAP) (6 – benzyl – aminopurine)

Các adenine được thay thế khác được dùng dưới dạng tự do hoặc liên kết với một chất đường

Tính chất sinh lí của cytokinine:

- Phát sinh phân bào trong nuôi cấy mô (có mặt auxin) - Kích thích sự tăng trưởng chồi

- Kích thích phát sinh chồi bên trong điều kiện có ưu thế ngọn

- Nở lá

- Làm chậm lão hoá lá

- Tích tụ diệp lục và thúc đẩy chuyển hoá etioplast vào diệp lục

2.5.3 Dịch chiết xuất hữu cơ từ trái cây, củ quả

Dịch chiết hữu cơ có thể kích thích có hiệu quả qua việc cung cấp các thành phần dinh dưỡng acid hữu cơ không xác định và các thành phần có tác dụng như chất kích thích sinh trưởng (Trần Văn Minh, 2004)

2.5.3.1 Nước dừa

Nước dừa giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng

thực vật khó nuôi cấy (Trần Văn Minh 2004)

Một lít nước dừa có 40g glucid, 2-3g acid amin, 4g chất khoáng (48meq kalium, 2meq natrium, 45meq clor, 7meq calcium, 6meq magie…và các yếu tố vi lượng như sắt, mangan, lithium), vitamin, hầu như không có lipid và có rất ít sinh tố

2.5.3.2 Khoai tây

Thành phần dinh dưỡng của khoai tây: Nước: 75%; Gluxit: 21%; Protein: 2%; Xenluloza: 1%; Năng lượng: 92 Kcal/100g; Ca: 10mg%; P: 50mg%; Fe: 1,2mg%; Vitamin C: 15mg% (Theo bảng thành phần dinh dưỡng thực phẩm Việt Nam 2000)

2.5.3.3 Chuối xanh

Chuối xanh cung cấp nhiều kali, phốt pho, magiê, sắt, canxi, tinh bột và một ít đường, vitamin A, C, B

2.6 Giới thiệu về lan Renanthera sp

Tên khoa học: Renanthera sp

Họ: Orchidaceae

Nhóm phụ: Sarcanthirae

2.6.1 Nguồn gốc

Renanthera sp được biết đến trong tập hợp lan ở Nam Á Hoa có màu đỏ, vàng,

trắng nở vào nhiều mùa Có 12 loài rải rác từ miền nam Trung Quốc xuống đến Đông Dương, Thái Lan, Malaysia, Philippine Phân nửa chúng được thuần dưỡng phổ biến như Ren.storiei, Ren coccinea, Ren.monichica, Ren.imschootiana, Ren.Philippinesis và Ren.clongata

2.6.2 Đặc điểm thực vật học

Lan Ren là thực vật biểu sinh, Thuộc nhóm cây đơn thân (monopodial) với các đặc điểm thực vật học như sau:

Hình 2.1: Đặc điểm thực vật học của lan Ren

Thân: Cây thuộc nhóm đơn thân không có giả hành, mọc thẳng đứng, cao đến 1,5m

Thân cây mập với nhiều rễ to

Lá: Lá dài, hẹp màu lục đậm, mọc cách được xếp thành 2 hàng đối nhau

Hoa: Kiểu phát hoa ngang thường phân nhánh từ 3 đến 6 cành hoa Phát hoa xuất hiện

từ nách lá, phát hoa mọc song song với lá và thẳng góc với rễ Hoa có kích thước lớn và trung bình, không thơm, có cánh hẹp, lá đài ở mặt lưng, môi nhỏ Màu hoa đỏ hoặc vàng thuần túy hay cả đỏ pha lẫn vàng Hoa nở vào mùa nắng, nhiều nhất vào tháng 2, tháng 3

Rễ: Rễ tròn, dài và mọc từ thân thẳng góc với lá, rễ treo lơ lững trên thân Bên cạnh

việc hút chất dinh dưỡng rễ còn có nhiệm vụ quang hợp

2.6.3 Đặc điểm sinh thái

Nhiệt độ: Ren là loại lan chịu nóng, nhiệt độ thích hợp cho lan ban ngày từ 270C – 320C, ban đêm 150C

2.6.4.2 Tưới nước

Mùa hè nên tưới 2-3 lần một ngày, tưới cho đến khi rễ trở nên xanh thẫm và đợi

cho khô rễ rồi mới tưới Mùa đông nên bớt tưới nước tùy theo nhiệt độ và độ ẩm

2.6.4.3 Bón phân

Ren ưa bón phân 30-10-10 vào mùa hè hoặc 15-15-15 quanh năm với nồng độ nhẹ tức là ¼ thìa cà phê cho 4 lít nước Bón phân mỗi ngày một lần, sau khi tưới nước Ngưng bón phân vào mùa đông

2.6.4.4 Thay chậu và nhân giống

Khi thay chậu cần chú ý không nên thay chậu quá to sẽ ảnh hưởng đế chế độ tưới và không phải toàn bộ rễ đều nằm trong chậu

Khi cây quá cao, có thể cắt cành để có thêm cây nữa Khúc này cần phải có it nhất là 2 rễ và dài trên 50 cm , khúc dưới cũng vậy Khoảng một hay hai tháng sau khúc dưới sẽ ra mầm mới tùy theo rễ tốt hay không Thời gian tốt nhất để cắt là vào mùa xuân , khi nhiệt độ ban đêm đã trên 16°C như vậy cây sẽ chóng lại sức hơn Nếu cắt muộn quá, hoặc tưới bón không đủ, cây sẽ khó lòng ra hoa.

a) b) c)

Hình 2.2: Một số giống hoa lan Ren

a) Norodom Sihanouk; b) Ren Akihito; c) Ren Alex Hawkes; d) Ren Bella × Kalsom; e) Renanthera Cape Sabel; f) Ren Kalsom; g) Ren Susita; h) Ren Lena Rowold; i) Ren

Singapore; j) Ren Yen; k) Ren Mok York Seng và l) Renanthera Singapore

3 Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành từ 2/6/08 đến 2/10/08, tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô – Bộ môn Di Truyền-Giống – khoa Nông Học – trường ĐH Nông Lâm TP.HCM

3.2 Phương tiện thí nghiệm

3.2.1 Đối tượng thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành trên cây lan Ren từ mẫu của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô– Bộ môn Di Truyền-Giống – khoa Nông Học

3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ

Phòng chuẩn bị:

- Nồi hấp vô trùng - Tủ lạnh

- Bể rửa chai lọ - Bếp điện

- Bình chứa môi trường nuôi cấy, pipet, ống đong - Cân

Buồng cấy:

- Tủ cấy vô trùng

- Bàn để môi trường và mẫu cấy

- Các dụng cụ thao tác: dao, kéo, pen, đèn cồn, bình tia, bông gòn thấm nước Ghi chú: Tất cả đã được hấp vô trùng

Dụng cụ thí nghiệm: Đèn cồn, kéo, pen, bông gòn (loại thấm nước và không thấm

nước), chai nước biển, ống nghiệm, ống đong, giấy, cồn 960 và cồn 700

Môi trường nuôi cấy: Môi trường cơ bản dùng trong thí nghiệm là môi trường MS

(Murashige and Skoog, 1962)

MnSO4.H2O 16,9 Na2MoO4.2H2O 0,25 ZnSO4.7H2O 8,60

Vitamin:

Glycine 2 Myo-inositol 100 Nicotinic acid (B5) 0,5 Pyridoxine HCl (B6) 0,5 Thiamin HCl (B1) 0,1

Ngoài ra trong môi trường cải tiến còn thêm đường, agar, các chất điều hoà sinh trưởng BAP (6- Benzylaminopurine), NAA (α – Naphytylacetic acid) Các dịch chiết hữu cơ được sử dụng gồm: nước dừa, khoai tây và chuối xanh Môi trường cấy được hiệu chỉnh pH=5,8

3.3 Phương pháp thí nghiệm

3.3.1 Điều kiện nuôi cấy

Môi trường cấy được khử trùng bằng Autoclave ở 1 atm, 1180c, 14 phút sử dụng chai thủy tinh 500ml chứa 50ml môi trường để nuôi cấy

Ẩm độ trung bình: 70-80%; cường độ chiếu sáng: 2000 lux; thời gian chiếu sáng 161giờ /ngày; nhiệt độ phòng nuôi cây: 262 0C Phòng nuôi cây phải khô ráo, các thao tác nuôi cấy được tiến hành trong điều kiện vô trùng

3.3.2 Tiến hành thí nghiệm

3.3.2.1 Môi trường nền

Môi trường MS + 8,5agar + 30g/l sucrose + 0,5g/l than

3.3.2.2 Theo dõi ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng sinh trưởng của lan Ren in-vitro

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 2 yếu tố, 3 lặp lại ba lần

Thí nghiệm 1: Theo dõi 5 nồng độ BAP và 2 nồng độ NAA

Các nghiệm thức NAA (mg/lít) BAP (mg/lít)

3.3.2.3 Thí nghiệm theo dõi ảnh hưởng của các dịch chiết hữu cơ đến khả năng sinh trưởng, phát triển của giống lan Ren in-vitro

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yết tố, 3 lần lặp lại,

Thí nghiệm 3: Theo dõi ảnh hưởng của dịch chiết nước dừa đến sự sinh trưởng, phát triển của cây lan Ren

Các nghiệm thức: NT1: MTN (ĐC)

NT2: MTN + 50ml/lít nước dừa NT3: MTN + 100ml/lít nước dừa NT4: MTN + 150ml/lít nước dừa NT5: MTN + 200ml/lít nước dừa NT6: MTN + 250ml/lít nước dừa

Thí nghiệm 4: Theo dõi ảnh hưởng của dịch chiết khoa tây đến sự sinh trưởng, phát triển của cây lan Ren

NT1: MTN (ĐC)

NT2: MTN + 25ml/lít dịch chiết khoai tây NT3: MTN + 50ml/lít dịch chiết khoai tây NT4: MTN + 100ml/lít dịch chiết khoai tây NT5: MTN + 150ml/lít dịch chiết khoai tây

Thí nghiệm 5: Theo dõi ảnh hưởng của dịch chiết chuối xanh đến sự sinh trưởng, phát triển của cây lan Ren

NT1: MTN (ĐC)

NT2: MTN + 25ml/lít dịch chiết chuối xanh NT3: MTN + 50ml/lít dịch chiết chuối xanh NT4: MTN + 100ml/lít dịch chiết chuối xanh NT5: MTN + 150ml/lít dịch chiết chuối xanh

3.3.3 Chỉ tiêu theo dõi

- Chiều cao chồi: đo chiều cao chồi

- Số lá: đếm tổng số lá qua từng giai đoạn theo dõi - Chiều dài lá: đo chiều dài lá từ thân chính

- Số rễ: đếm tổng số rễ qua từng giai đoạn

- Chiều dài rễ: đo chiều dài rễ các nghiệm thức - Trọng lượng tươi

Tiến hành theo dõi vào các giai đoạn 30, 60 và 90 NSC, sử dụng thước kẹp để đo chiều dài và dùng cân tiểu li để cân trọng lượng tươi các chỉ tiêu theo dõi

3.3.4 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu thu thập được xử lý trên phần mềm Microsoft excel và phần mềm thống kê MSTATC

4 Chương 4

4.1 Thí nghiệm theo dõi ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng đến sinh trưởng, phát triển của lan Ren

4.1.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của 5 nồng độ BAP và 2 nồng độ NAA đến khả

năng sinh trưởng, phát triển của lan Ren in-vitro

Ren là giống lan có tốc độ sinh trưởng chậm vì vậy trong in-vitro cần phải chọn

một số chất điều hòa sinh trưởng ở nồng độ thích hợp để rút ngắn quá trình sinh trưởng của cây BAP và NAA là hai chất điều hòa sinh trưởng thường được sử dụng trong nuôi cấy mô nhằm tăng sinh khối và kích thích tạo rễ cho cây.Đối với lan Ren việc phối hợp 2 chất này trong cùng môi trường nuôi cấy hay tách riêng chúng là thích hợp và nồng độ là bao nhiêu để Ren sinh trưởng, phát triển tốt nhất Những thí nghiệm dưới đây được tiến hành nhằm tìm ra nồng độ thích hợp của các chất điều hòa sinh trưởng cho sinh trưởng và phát triển của lan Ren

4.1.1.1 Ảnh hưởng của BAP và NAA đến số lá và chiều dài lá lan Ren in-vitro

Xét về chỉ tiêu số lá:

Bảng 4.1 cho thấy: Giai đoạn 30 NSC: với số lá ban đầu là 3 lá Số lá trên cây có chiều hướng tăng dần khi nồng độ BAP tăng từ 0,5 đến 1,5mg/lít, cao nhất ở NT3 và 8 có nồng độ 1,5mg/lít BAP cho số lá trung bình là 4,3lá, khi tiếp tục tăng nồng độ BAP lên 2 đến 2,5mg/lít thì số lá ở các NT giảm dần NT3 (1,5mg/lít BAP không kết hợp với NAA) cho số lá nhiều nhất (4,3 lá), NT1 có số lá thấp nhất (3,2 lá) và các NT còn lại có số lá biến động từ 3,3 đến 4,2 lá

Giai đoạn 60 NSC: Giai đoạn này số lá tăng thêm từ 0,7 đến 1,7 lá ở các nghiệm thức NT 3 và 8 có số lá trung bình cao nhất (5,2 lá) NT3 cho số lá nhiều nhất (5,3 lá), NT5 có số lá ít nhất (4,6 lá) và các NT còn lại có số lá biến động từ 4,8 đến 5,2 lá

Bảng 4.1: Ảnh hưởng BAP và NAA đến chỉ tiêu số lá (lá/chồi) của lan Ren in-vitro

NSC (mg/lít) BAP 0,0 0,2 NAA (mg/lít) Trung bình BAP

Giai đoạn 90 NSC: Số lá tăng dần khi nồng độ BAP tăng từ 0,5 đến 1,5mg/lít Nồng độ thích hợp cho lan Ren tạo lá nhiều nhất là 1,5mg/lít cho 6,5 lá có sự khác biệt có ý nghĩa trong thống kê so với các NT khác, qua ngưỡng 1,5mg/lít là từ 2 đến 2,5mg/lít số lá có chiều hướng giảm dần Số lá trung bình các NT không kết hợp với NAA và những NT có kết hợp BAP và 0,2mg/lít NAA không có sự chênh lệch Kết quả xử lý thống kê cho thấy sự khác biệt giữa các nghiệm thức không có ý nghĩa trong thống kê

Tuy nhiên NT3 cho số lá nhiều nhất (6,7 lá), thấp nhất là NT5 (5,4 lá) và các NT còn lại có số lá biến động từ 5,7 đến 6,4 lá Tốc độ mọc lá từ giai đoạn 30 đến 60NSC ở NT1 nhanh nhất là 2 lá và chậm nhất ở NT4 (0,6 lá), ở giai đoạn 60 đến 90NSC thì ngược lại NT1 (0,5 lá) và NT4 (1,6 lá) Nhìn chung, những NT chỉ có BAP không kết hợp NAA có số lá trung bình cao hơn số lá trung bình ở những NT có kết hợp BAP và 0,2mg/lít NAA vì môi trường nuôi cấy ở các NT không kết hợp với NAA

chỉ chứa chất kích thích sinh trưởng BAP nên cây có nhiều lá hơn

Xét về chiều dài lá:

Bảng 4.2: Ảnh hưởng BAP và NAA đến chỉ tiêu chiều dài lá (mm) của lan Ren

NSC (mg/lít) BAP 0 NAA (mg/lít)0,2 Trung bình BAP

Bảng 4.2 cho thấy:

Giai đoạn 30 NSC: Các tại NT có 1,5mg/lít BAP có chiều dài lá trung bình dài nhất, thấp nhất ở NT có 0,5mg/lít BAP NT3 cho chiều dài lá dài nhất (8,9 mm) NT6 cây lan có chiều dài lá ngắn nhất (7,3mm) Các NT còn lại chiều dài lá biến động từ 7,7 đến 8,5mm

Giai đoạn 60 NSC: Các NT có 1,5mg/lít BAP có chiều dài lá trung bình dài nhất, thấp nhất ở NT có 0,5mg/lít BAP Tương tự với 30 NSC, chất dinh dưỡng cũng được dồn phần lớn cho việc nuôi lá ở các NT chỉ bổ sung BAP vào môi trường nuôi cấy Trong đó NT3 và 8 có chiều dài lá cao nhất lần lượt là 10,5 và 10,3mm thì sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê, NT6 cây lan có chiều dài lá ngắn nhất (8mm), các NT còn lại chiều dài lá biến động từ 8,6 đến 10,2mm

Giai đoạn 90 NSC: Tốc độ tăng chiều dài lá gấp đôi tốc độ tăng chiều dài lá giai đoạn 30 đến 60NSC, cụ thể là ở các NT ở giai đoạn 60NSC lá dài thêm 1,2 đến 1,7mm

tới giai đoạn 90NSC lá dài thêm 2 đến 3,8mm Tại thời điểm này, NT3 cho lá đạt chiều dài lên đến 14mm dài nhất trong các NT, thấp nhất NT5 (10,4mm) còn các NT khác chiều dài lá dao động từ 11,6 đến 13,9mm

Qua thí nghiệm cho thấy chiều dài lá của những NT chỉ có BAP dài hơn so với các nghiệm thức còn lại Nguyên nhân là do BAP kích thích việc phát triển lá của cây lan Ren mạnh hơn khi có sự kết hợp BAP với NAA với nồng độ BAP (1,5mg/lít) không kết hợp NAA sau 90 ngày nuôi cấy cho chiều dài lá dài nhất Thực nghiệm cũng cho thấy rằng nồng độ BAP khi cho vào môi trường vượt quá ngưỡng sẽ không giúp cây phát triển tốt mà còn gây ảnh hưởng đến sự phát triển của cây Kết quả thí nghiệm giúp xác định được ngưỡng chất điều hoà sinh trưởng để bổ sung vào môi trường nuôi cấy cho phù hợp, tránh lãng phí

4.1.1.2 Ảnh hưởng của BAP và NAA đến số rễ và chiều dài rễ lan Ren in-vitro

đó NT8 có số rễ nhiều nhất (1,7 rễ), NT1 và 2 có số rễ thấp nhất (1,2 rễ) và các NT còn lại có số rễ biến động từ 1,3 đến 1,6 rễ

Giai đoạn 60 NSC: Ở các nghiệm thức số rễ tăng thêm từ 2,7 rễ đến 3,1 rễ NT3 và 8 cho số rễ trung bình nhiều nhất là 4,6 rễ, NT1 và 2 cho số rễ trung bình ít nhất (4 rễ) Khi môi trường nuôi cấy có bổ sung thêm NAA thì cây lan Ren được kích thích ra rễ nhiều hơn Trong đó, NT8 có số rễ nhiều nhất (5,1 rễ), NT1 có số rễ ít nhất (3,4 rễ), các nghiệm thức còn lại số rễ biến động từ 3,5 đến 5 rễ

Giai đoạn 90 NSC: Kết quả xử lý thông kê cho thấy sự khác biệt giữa các nghiệm thức ở mức rất có ý nghĩa Số rễ tăng dần khi nồng độ BAP tăng từ 0,5 mg/lít đến 1.5 mg/lít, tại nồng độ 1,5mg/lít cây có số rễ trung bình nhiều nhất (7,3 rễ) và giảm dần khi nồng độ BAP tăng thêm từ 2 đến 2,5 mg/lít NT8 cho số rễ nhiều nhất (7,9 rễ), số rễ ít nhất ở NT5 (5,4 rễ) và số rễ biến động từ 5,7 đến 7,3 rễ ở các NT còn lại

Tốc độ ra rễ ở những NT có kết hợp giữa BAP và 0,2mg/lít NAA nhanh hơn những NT chỉ có BAP Những NT chỉ có BAP tăng thêm từ 2,2 đến 2,9 rễ, những NT có kết hợp BAP và 0,2mg/lít NAA từ 3,1 đến 3,3 rễ còn giai đoạn từ 60 đến 90NSC: Những NT chỉ có BAP tăng thêm từ 1,7 đến 2,5 rễ, các NT có kết hợp giữa BAP và 0,2mg/lít NAA tăng từ 2,2 đến 2,8 rễ

Kết quả thí nghiệm cho thấy với nồng độ BAP (1,5mg/lít) kết hợp NAA (0,2mg/lít) sau 90 ngày nuôi cấy cho số rễ nhiều nhất

Xét về chỉ tiêu chiều dài rễ:

Kết quả theo dõi chiều dài rễ được tiến hành ở giai đoạn cuối thí nghiệm (90NSC) và được trình bày ở bảng 4.4

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của BAP và NAA đến chiều dài rễ (mm) lan Ren sau 90NSC

BAP (mg/lít)

Số liệu bảng 4.4 cho thấy: Giai đoạn 90 NSC: Kết quả xử lý thống kê cho thấy có sự khác biệt ở mức rất có ý nghĩa giữa các nghiệm thức, hai NT có nồng độ BAP 1,5mg/lít cho chiều dài rễ trung bình dài nhất (6,6mm), chiều dài rễ trung bình tăng dần khi nồng độ BAP tăng dần và giảm dần khi nồng độ BAP tăng vượt ngưỡng 1,5 mg/lít Trong đó, NT8 cho chiều dài rễ dài nhất (7mm), NT6 cho chiều dài rễ thấp nhất (4,6mm) và các nghiệm thức còn lại có chiều dài rễ biến động từ 4,7 đến 6,2mm

Qua theo dõi chiều dài rễ nhận thấy NT8 với nồng độ BAP (1,5mg/lít) kết hợp NAA (0,2mg/lít) sau 90 ngày nuôi cấy cho chiều dài rễ dài nhất Số liệu bảng 4.4 chỉ ra rằng nồng độ BAP khi cho vào môi trường vượt quá ngưỡng sẽ không giúp cây phát triển tốt mà còn gây ảnh hưởng đến sự phát triển

4.1.1.3 Ảnh hưởng của BAP và NAA đến chiều cao chồi và trọng lượng tươi lan Ren

Xét về chỉ tiêu chiều cao chồi:

Bảng 4.5: Ảnh hưởng BAP và NAA đến chỉ tiêu chiều cao chồi (mm) lan Ren in-vitro

NSC (mg/lít) BAP NAA (mg/lít) Trung bình BAP

Số liệu bảng 4.5 cho thấy: Giai đoạn 30 NSC: Các NT có bổ sung 1,5mg/lít BAP có chiều cao chồi trung bình cao nhất (4,4mm), chiều cao chồi tăng dần khi nồng

độ BAP tăng 0,5 đến 1,5mg/lít và giảm dần khi nồng độ BAP cao hơn 1,5mg/lít NT8 cho chiều cao chồi cao nhất là 4,6mm, NT3 cây có chiều cao chồi thấp nhất là 3,4mm, các NT còn lại có chiều cao chồi biến động từ 3,5 đến 4,2mm

Giai đoạn 60 NSC: Các NT có bổ sung 1,5mg/lít BAP có chiều cao chồi trung bình cao nhất (5,6mm), các NT có 2,5mg/lít BAP có chiều cao chồi trung bình thấp nhất (4,6mm) Ở NT8 cho chiều cao chồi cao nhất (6mm), thấp nhất ở NT5 và 10 (4,6mm), các NT còn lại chiều cao chồi biến động từ 4,8 đến 5,4mm.

Giai đoạn 90 NSC: Chiều cao chồi trung bình có chiều hướng tăng dần từ 0,5 đến 1,5mg/lít BAP, ở nồng độ 1,5mg/lít BAP cây có chiều cao trung bình cao nhất và khi vượt qua ngưỡng 1,5mg/lít BAP chiều cao trung bình có xu hướng giảm xuống Kết quả xử lý thống kê cho thấy sự khác biệt giữa các nghiệm thức ở mức có ý nghĩa, trong đó NT8 có chiều cao cao nhất (7,3mm), thấp nhất ở NT5 (6,0mm), các NT còn lại biến động từ 6,1 đến 6,6mm.

Những NT chỉ có BAP có chiều cao chồi trung bình thấp hơn những NT có kết hợp BAP và 0,2mg/lít NAA do đặc tính của BAP thuộc nhóm cytokinin có tác dụng kích thích chồi bên, giảm ảnh hưởng ngọn Trong khi NAA thuộc nhóm auxin có tác dụng kích thích hệ thống rễ đồng thời có ưu thế ngọn

Ở môi trường có kết hợp giữa BAP với NAA cây phát triển chiều cao tốt hơn Kết quả thí nghiệm cho thấy với nồng độ BAP (1,5mg/lít) kết hợp với 0,2mg/lít NAA cho chiều cao chối cao nhất

Xét về chỉ tiêu trọng lượng tươi:

Bảng 4.6: Ảnh hưởng BAP và NAA đến trọng lượng tươi (g) lan Ren in-vitro

BAP (mg/lít)

BAP 0,0 0,2

Ghi chú: Ký tự theo sau giá trị trung bình khác nhau trên cùng một cột có sự khác biệt trong thống kê (*: α = 0,05; **: α = 0,01)