Ứng dụng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn đánh giá ảnh hưởng của các phương thức quản lý khác nhau lên độ mẫn cảm đối với virus gây hội chứng đốm trắng

Trong công nghệ nuôi tôm hiện nay, đặc biệt là các mô hình nuôi tôm mật độ cao, việc áp dụng các giải pháp, phương thức quản lý nhằm tăng cường hiệu quả sản xuất đóng góp đáng kể vào năng s

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện TS NGUYỄN VĂN HẢO ĐẶNG TRẦN QUÂN ThS NGÔ XUÂN TUYẾN KHÓA: 2002 – 2006

Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006-

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY



APPLICATION OF STANDARDIZIED

CHALLENGE MODEL TO TEST THE EFFICACY OF β-1,3/1,6-GLUCAN AND VITAMIN C ON THE

SUCCEPTIBILITY OF BLACK TIGER SHRIMP

(Penaeus monodon) TO WHITE SPOT SYNDROME

VIRUS (WSSV)

GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY

Professor Student

Dr NGUYEN VAN HAO DANG TRAN QUAN MSc NGO XUAN TUYEN TERM: 2002 - 2006

HCMC, 09/2006

- TS Nguyễn Văn Hảo đã tận tình giải đáp những vướng mắc trong quá trình thực tập, giúp tôi hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp

- ThS Ngô Xuân Tuyến là người đã trực tiếp hướng dẫn về phương pháp nghiên

cứu, tài liệu khoa học, giúp tôi hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp

- Kỹ sư Phạm Thị Tuyết Anh đã tận tình hướng dẫn tôi về mặt thao tác trong phòng thí nghiệm, giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực tập

- Các anh chị ở phòng Mô, các anh chị ở trại thực nghiệm Thủ Đức đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập vừa qua

Cuối cùng là cảm ơn các bạn lớp Công nghệ sinh học 28 thân mến đã cùng tôi đồng hành trên suốt chặng đường đại học

Tp.Hồ Chí Minh, ngày…tháng…năm 2006 Sinh viên

Đặng Trần Quân

v

TÓM TẮT

Trong công nghệ nuôi tôm hiện nay, đặc biệt là các mô hình nuôi tôm mật độ cao, việc áp dụng các giải pháp, phương thức quản lý nhằm tăng cường hiệu quả sản xuất đóng góp đáng kể vào năng suất nuôi Giải pháp quản lý sử sụng các sản phẩm sinh học tăng cường sức khỏe cho tôm thông qua việc tăng cường hiệu quả đáp ứng miễn dịch của tôm với mầm bệnh, nhất là với mầm bệnh virus, được xem là giải pháp khá quan trọng Trong thí nghiệm này, chúng tôi đánh giá sự thay đổi tính mẫn cảm

của tôm sú tiền trưởng thành Penaeus monodon đối với virus đốm trắng (WSSV) sau

khi ứng dụng các giải pháp bổ sung các chất kích thích miễn dịch, vitamin C và 1,3/1,6-glucan vào thức ăn nuôi tôm trong khoảng thời gian nhất định Sử dụng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn được xây dựng bởi Phòng thí nghiệm virus - Đại học Gent, Vương Quốc Bỉ, kỹ thuật xét nghiệm hóa mô miễn dịch và phương pháp tiêm mô dịch gốc virus đốm trắng dòng Việt Nam (WSSV-VN) đã được tinh sạch và xác định độc lực thông qua chuẩn độ để xác định sự thay đổi độ mẫn cảm đối với virus của tôm Thí nghiệm được tiến hành với hai liều tiêm cao và thấp của độ chuẩn SID50

β-của dịch gốc WSSV-VN cho tôm sú tiền trưởng thành sau khi đã nuôi với 3 nghiệm thức thức ăn có bổ sung β-1,3/1,6-glucan (10g/kg thức ăn), bổ sung vitamin C (5g/kg thức ăn) và không bổ sung trong thời gian 15 ngày Gây nhiễm thực nghiệm cho tôm ở liều thấp (101,5SID50) và liều cao (104SID50) của dịch virus WSSV-VN cho 3 nhóm tôm thuộc 3 nghiệm thức trên Thu mẫu tôm ở các thời điểm khác nhau sau gây nhiễm: 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120 giờ, để khảo sát sự thay đổi độ mẫn cảm thông qua đánh giá sự biến đổi tình trạng sức khỏe tôm và tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV trên tôm giữa các nghiệm thức Kết quả thu được ở thí nghiệm gây nhiễm với liều thấp, tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV của tôm ở 3 nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan, vitamin C và đối chứng lần lượt là 4,12, 3,49 và 4,94% Sự khác biệt về tỷ lệ tế bào nhiễm giữa 3 nghiệm thức này không có ý nghĩa (P>0,05) Các dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng xuất hiện sớm hơn ở nghiệm thức đối chứng so với 2 nghiệm thức còn lại Chưa thấy rõ sự khác biệt giữa nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan và vitamin C Thí nghiệm gây nhiễm với liều cao, tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV của tôm ở 3 nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan, vitamin C và đối chứng lần lượt là 3,04, 3,69 và 4,49% Chỉ có sự khác biệt có ý nghĩa (P<0,05) về tỷ lệ này giữa nghiệm thức đối chứng với β-1,3/1,6-glucan Các

vi

dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng xuất hiện sớm hơn ở nghiệm thức đối chứng so với 2 nghiệm thức còn lại β-1,3/1,6-glucan thể hiện rõ tác dụng làm giảm độ mẫn cảm với WSSV của tôm sú Trong từng phương thức quản lý, tỷ lệ tế bào nhiễm ở 2 liều tiêm không có sự khác biệt (P>0,05) Ở nhóm tiêm với liều cao, các dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng đến sớm hơn nhóm tiêm liều thấp

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Hệ miễn dịch của tôm sú 3

2.2 Bệnh đốm trắng trên tôm sú 5

2.2.1 Lịch sử và phân bố bệnh đốm trắng 5

2.2.2 Tác nhân gây bệnh 5

2.2.3 Dấu hiệu bệnh lý 6

2.2.4 Phương thức lan truyền 6

2.3 Các phương thức quản lý nhằm tăng cường sức chịu đựng của tôm đối với bệnh đốm trắng 7

2.3.1 Chất kích thích miễn dịch 7

2.3.2 Vaccin 10

2.3.3 Vitamin 11

2.3.4 Fucoidan 12

2.4 Mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn WSSV trên tôm 13

2.4.1 Sơ lược về mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn 13

2.4.2 Ứng dụng của mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn 14

2.5 Sơ lược về hóa mô miễn dịch 15

2.5.1 Nguyên lý 15

2.5.2 Các phương pháp nhuộm 15

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIỆN CỨU 16

3.1 Thời gian và địa điểm 16

3.2 Vật liệu nghiên cứu 16

3.2.1 Vật liệu sinh học 16

3.2.2 Dụng cụ và hóa chất 16

3.2.2.1 Dụng cụ 16

3.2.2.2 Hoa chất 17

3.3 Phương pháp nghiên cứu 19

3.3.1 Phương pháp pha loãng dịch huyền phù virus 19

3.3.2 Phương pháp gây nhiễm WSSV trên tôm sú 19

3.3.3 Phương pháp thu mẫu cho IHC 19

3.3.4 Phương pháp xác định WSSV trên tôm bằng kỹ thuật IHC 19

3.3.5 Phương pháp tính tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) trên tôm thí nghiệm20 3.3.6 Phương pháp đo một số yếu tố môi trường nước 20

3.3.7 Phương pháp xử lý số liệu 20

viii

3.4 Bố trí thí nghiệm 21

3.4.1 Chuẩn bị vật liệu cho thí nghiệm gây nhiễm chuẩn 21

3.4.2 Bố trí thí nghiệm gây nhiễm chuẩn cho tôm với dịch virus WSSV-VN đã chuẩn độ (105,2SID50/ml) 21

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Đáng giá vật liệu phục vụ cho thí nghiệm gây nhiễm chuẩn 23

4.2 Khảo sát ảnh hưởng của các phương thức quản lý khác nhau lên độ mẫn cảm của tôm đối với WSSV 24

4.2.1 Kết quả ở thí nghiệm gây nhiễm trên tôm sú với liều thấp (101,5SID50/ml) 24

4.2.2 Kết quả ở thí nghiệm gây nhiễm trên tôm sú với liều cao (101,5SID50/ml) 28

4.2.3 Kết quả so sánh độ mẫn cảm với 2 liều gây nhiễm của tôm ở từng phương thức quản lý 32

ix

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

WSD: White spot disease

WSSV: White spot syndrome Virus

WSSV-VN: White spot syndrome virus Vietnam IHC: Immunohistochemistry

proPO: prophenoloxidase LPS: Lipopolysaccharide

BGBP: Beta-glucan biding protein VP19: envelope protein (19 kDa) VP28: envelope protein (28 kDa) DNA: Deoxiribonucleotide acid RNA: Ribonucleotide acid MBV: Monodon Baculovirus YHV: Yellow Head Vius

IHHNV: Infectious hypodermal hemotopoietic necrosis virus PCR: Polymerase chain reaction

PAP: peroxidase anti peroxidase ABC: avidin-biotin complex LSAB: labelled streptavidin-biotin BPS: Buffer phosphate saline

DAB: 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride SID50/ml:Shrimp infectious dose 50% enpoint

trắng sau khi gây nhiễm liều thấp……… 24

Bảng 4.4 Kết quả tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV của tôm kiểm tra bằng

IHC ở liều thấp 25

Bảng 4.5 Kết quả kiểm tra tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) trên tôm bằng

IHC theo thời gian thu mẫu ở liều thấp………26

Bảng 4.6 Kết quả theo dõi thực nghiệm dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm

trắng sau khi gây nhiễm liều cao 28

Bảng 4.7 Kết quả tỷ lệ nhiễm WSSV của tôm ở 3 nghiệm thức ở liều cao 30 Bảng 4.8 Kết quả kiểm tra tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV trên tôm bằng IHC ở

các thời điểm thu mẫu ở liều cao…… ………30

Bảng 4.9 So sánh kết quả theo dõi thực nghiệm và phân tích tỷ lệ cảm

nhiễm (IHC) giữa 2 liều tiêm……… 32

Bảng 4.10 Tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) của tôm ở từng phương thức quản lý

được gây nhiễm với 2 liều tiêm………33

xi

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Sơ đồ sự kích hoạt của β-glucan và Lipopolysaccharide lên các tế

bào máu cùa giáp xác 4

Hình 2.2 Virus hội chứng đốm trắng 6

Hình 2.3 Tôm nhiễm WSSV và tế bào nhiễm WSSV 6

Hình 2.4 Cấu trúc hóa học của -1,3/1,6-glucan 9

Hình 2.5 Cấu trúc hóa học của vitamin C 12

Hình 3.1 Gây nhiễm WSSV cho tôm bằng cách tiêm 19

Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng quát chẩn đoán IHC 20

Hình 3.2 Hình bố trí thí nghiệm cảm nhiễm WSSV cho tôm 21

Hình 4.1 Bể nuôi tôm với hệ thống lọc tuần hoàn 23

Hình 4.2 Hình chụp mẫu mô mang ở tôm đƣợc nhuộm IHC (vật kính 40X) thời điểm 24 giờ sau gây nhiễm WSSV 25

Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ nhiễm WSSV (%) của tôm ở liều thấp 26

Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) của tôm theo thời gian ở liều thấp 26

Hình 4.3 Tôm đối chứng chết thời điểm 38 giờ sau gây nhiễm WSSV 29

Hình 4.4 Hình chụp mẫu mô mang ở tôm đƣợc nhuộm IHC (vật kính 40X) thời điểm 12 giờ sau gây nhiễm WSSV ở liều cao 29

Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ nhiễm WSSV (%) của tôm ở liều cao 30

Biểu đồ 4.4 Tỷ lệ nhiễm WSSV (%) của tôm theo thời gian thu mẫu ở liều cao 31

Hình 4.5 Tôm đƣợc bổ sung β-1,3/1,6-glucan ở 120 giờ sau gây nhiễm 32

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Từ thực tế phải đối đầu với bệnh đốm trắng (White Spot Disease – WSD) do virus gây hội chứng đốm trắng (White spot syndrome virus – WSSV) gây nhiều thiệt hại nặng nề cho ngành nuôi tôm Việt Nam cũng như thế giới trong những năm qua, nhiều biện pháp kỹ thuật đã được nghiên cứu và áp dụng ở hầu hết các giai đoạn của một vụ nuôi tạo nên giải pháp “phòng ngừa tổng hợp” nhằm hạn chế tối đa dịch bệnh đốm trắng xảy ra

Mặc dù vậy, cho đến nay biện pháp hữu hiệu để phòng bệnh đốm trắng trên tôm vẫn còn bỏ ngỏ Đã có nhiều nghiên cứu về việc sử dụng các vaccine hay chất kích thích miễn dịch (immunostimulants) nhằm nâng cao sức đề kháng của tôm đối với WSSV Tuy nhiên việc đánh giá một cách chính xác và khoa học hiệu quả của các biện pháp này là rất khó

Thông qua mô hình cảm nhiễm chuẩn, sẽ cho phép chúng ta đánh giá một cách khoa học mức độ ảnh hưởng của một số giải pháp kỹ thuật ứng dụng trong phòng bệnh đốm trắng trên tôm nuôi, cụ thể là việc sử dụng các chất kích thích tăng cường hệ miễn dịch của tôm

Đi từ cơ sở thực tiễn đó, được sự phân công của bộ môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh và sự chấp thuận của Viện

Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II, chúng tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp: “Ứng

dụng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn đánh giá ảnh hưởng của các phương thức quản lý khác nhau lên độ mẫn cảm đối với virus gây hội chứng đốm trắng (White spot syndrome virus–WSSV) của tôm sú (Peneaus monodon)”

1.2 Nội dung

Trong đề tài, chúng tôi bổ sung vào thức ăn cho tôm 2 hợp chất là Vitamin C và -1,3/1,6-glucan, được xem như là các chất kích thích tăng cường hoạt động của hệ thống miễn dịch không đặc hiệu (insufficient immune system) của tôm, trong điều kiện phòng thí nghiệm Sau đó gây gây nhiễm các đàn tôm với 2 liều gây nhiễm 101,5SID50và 104

SID50 của dòng WSSV-VN đã được chuẩn độ trong cùng điều kiện Thu mẫu và

tiến hành kiểm tra sự nhiễm WSSV trên tôm bằng kỹ thuật IHC (Immunohistochemistry)

1.3 Mục tiêu

Đánh giá ảnh hưởng của hai hợp chất vitamin C và -1,3/1,6-glucan lên độ mẫn cảm đối với WSSV của tôm sú

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Hệ miễn dịch của tôm sú

Ngành nuôi tôm phát triển, tôm thường được nuôi với mật độ cao trong môi trường tồn tại nhiều tác nhân gây bệnh Tuy nhiên ở điều kiện bình thường thì giữa sinh vật (vật chủ), mầm bệnh và môi trường giữ trạng thái cân bằng Bản thân vật chủ duy trì cho mình tình trạng khoẻ mạnh bằng cách chống lại sự tấn công của các tác

nhân gây bệnh

Cơ chế kháng bệnh chủ yếu của tôm sú là miễn dịch không đặc hiệu , điều này có hạn chế so với động vật có xương sống do sự khác biệt tiến hoá biểu hiện ở chỗ không có và không tạo ra được kháng thể đáp ứng lại kháng nguyên lạ xâm nhập (Văn Thị Hạnh và ctv, 2003) Lớp biểu bì là hàng rào lý hoá hữu hiệu chống lại sự bám dính và xâm nhập của mầm bệnh Một khi hàng rào này bị hư hại, các vi sinh vật đi vào cơ thể, vào máu chúng sẽ gặp những cơ chế phòng vệ bẩm sinh bao gồm các đáp ứng miễn dịch tế bào và thể dịch Đầu tiên, hệ thống hoạt hoá prophenoloxidase (proPO) được kích hoạt dẫn đến sự tổng hợp melanin và tạo ra các yếu tố liên quan đến các phản ứng miễn dịch khác như peroxinectin Tiếp đến, các tế bào máu tham gia vào việc dọn dẹp các mầm bệnh bằng các cơ chế thực bào vi sinh vật hay bẫy chúng trong các khối tế bào máu, đóng gói (encapsulation) các vi sinh vật lớn hơn Các phản ứng độc tế bào cũng được kích hoạt Cuối cùng các phân tử cảm ứng như các peptide kháng khuẩn, các yếu tố cần cho quá trình Opsonin cũng được tạo ra (Cerenius và Söderhäll, 2004)

Theo Lê Hồng Phước (2002), trong nghiên cứu về phản ứng loại thải vi sinh vật của tế bào máu trên tôm sú, từ máu tôm sú có thể tìm thấy 5 lọai tế bào máu: hyalinocyte (chiếm 37%), small-granular semi-granulocyte (25%), large-granular semi-granulocyte (15%), small-granular granulocyte (6%) và large-granular

granulocyte (17%) Trong thí nghiệm này, tôm với trọng lượng trung bình

3,28 ± 1,12 g được tiêm vi khuẩn Gram âm Vibrio anguillarum với liều 30 µl/g tôm

(mật độ vi khuẩn: 107 – 108 CFU/ml) Sau 7 ngày tiêm, hầu hết không thấy sự hiện

diện của vi khuẩn trên các cơ quan khảo sát: mô liên kết, tim, gan tụy, mô tạo máu, cơ quan lympho Khả năng loại thải vi sinh vật của các loại tế bào máu khác nhau cũng khác nhau Semi-granulocyte có chỉ số thực bào cao nhất so với các lọai tế bào khác Granulocyte và hyalinocyte có chỉ số thực bào thấp nhất

Ở tôm cũng như hầu hết các loài giáp xác khác tồn tại những cơ chế để phát hiện sự xâm nhập của các tác nhân lạ từ bên ngoài (vi khuẩn, nấm) thông qua sự nhận diện những thành phần vách tế bào của chúng như lipopolysaccharides (LPS) và β-glucan bởi các protein nhận biết trong huyết tương như BGBP (Beta Glucan Biding Protein) Phức hợp β-glucan - BGBP kích thích sự hoạt hóa prophenoloxidase (proPO) thành phenoloxidse (PO), enzyme điều khiển quá trình tổng hợp melanin Chất này cùng với các tiền chất của nó có vai trò như các chất diệt khuẩn (Vargas-Albores và ctv, 2000).Trong một nghiên cứu của mình, Chang và ctv (2002) đã chứng minh được tác dụng của β-1,3-glucan giúp tăng cường đáp ứng miễn dịch của tôm sú đối với virus gây hội chứng đốm trắng

Hình 2.1 Sơ đồ sự kích hoạt của β-glucan và Lipopolysaccharide lên các tế bào máu

cùa giáp xác (Vargas-Albores và ctv, 1998)

Theo Krimbrell và ctv (2001), ở tôm cũng như hầu hết các động vật không xương sống thiếu một hệ đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và chỉ dựa hoàn toàn vào các đáp ứng miễn dịch tự nhiên Tuy nhiên theo như Witteveldt và ctv (2003), những tôm sống sót sau khi bị nhiễm WSSV có tỷ lệ sống cao hơn ở lần gây nhiễm WSSV tiếp theo Sự phát hiện này cùng với nghiên cứu thử nghiệm cấp vaccine tiểu đơn vị chứa protein vỏ

của WSSV (VP19, VP28) cho tôm sú (Penaeus monodon) thông qua đường miệng đã

chứng minh được rằng một khả năng đáp ứng miễn dịch đặc hiệu có thể được kích thích sau khi cấp vaccin Trong nghiên cứu này, tỷ lệ tôm được cấp vaccine chứa

VP28 sống sau khi gây nhiễm WSSV bằng cách ngâm là 61% Nhóm đối chứng không được cấp vaccine có tỷ lệ chết 67%

Hiện nay, còn hiếm các thông tin về các công trình nghiên cứu sự tồn tại các peptide kháng khuẩn ở giáp xác Tuy nhiên, gần đây đã xác định được từ tế bào máu

của tôm sú P.monodon các protein có hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn rộng, bao

gồm cả vi khuẩn Gram

và Gram+ (Somboonwiwat và ctv, 2005)

Tóm lại, hệ miễn dịch của tôm sú nói riêng và các loài giáp xác nói chung còn ở mức độ tiến hóa thấp, chủ yếu dựa trên các đáp ứng miễn dịch tự nhiên Trong đó, vai trò của các bạch cầu và hệ thống proPO hết sức quan trọng Vì thế, việc tăng cường sức đề kháng cho các đối tượng nuôi thủy sản thuộc nhóm giáp xác không thể dựa vào việc sử dụng các loại vaccine mà chủ yếu là các biện pháp tăng cường hiệu quả đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu thông qua cải thiện điều kiện môi trường nuôi và sử dụng các chất kích thích miễn dịch (immunostimulant) (Đỗ Thị Hoà và ctv, 2000)

2.2 Bệnh đốm trắng trên tôm sú

2.2.1 Lịch sử và phân bố bệnh đốm trắng

Bệnh đốm trắng xuất hiện đầu tiên tại Bắc Á vào năm 1992 – 1993, đồng thời nhanh chóng lan rộng khắp khu vực Châu Á và thế giới nhất là các nước có hình thức nuôi tôm công nghiệp thâm canh Dịch bệnh đốm trắng phát hiện lận đầu tiên tại Đài Loan – 1992, Trung Quốc – 1993, Nhật Bản – 1994, sau đó là các nước Indonesia, Thái Lan, Malaysia, Ấn Độ, Bangladesh, Texas (Hoa Kỳ, 1995) gây tổn thất nghiêm trọng về sản lượng tôm nuôi

2.2.2 Tác nhân gây bệnh:

Virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) thuộc một họ virus mới, Nimaviridae (Vlak và ctv, 2002) Virus dạng hình trứng, kích thước 120 x 275 nm, có một đôi phụ bộ ở một đầu kích thước 70 x 300 nm (Wang và ctv, 1995)

Hạt virus cấu trúc bao gồm 3 phần: bao màng (envelope), nucleocapside và vật chất di truyền Virion chứa 5 protein chính: VP28, VP26, VP24, VP19 và VP15 có trọng lượng phân tử tương ứng là 28, 26, 24, 19 và 15 kDa

Hiện nay virus WSSV đã được giải mã trình tự hoàn chỉnh (Yang và ctv, 2001) Genome của WSSV là DNA vòng kép lớn, kích thước thay đổi từ 293 đến 308 kbp (van Hulten và ctv, 2001) tùy theo các mẫu phân lập từ các vị trí địa lí khác nhau

Hình 2.2 Virus gây hội chứng đốm trắng (Jo-ann Leong, 2005)

A Mô hình cấu trúc WSSV

B Ảnh hiển vi điện tử của WSSV

2.2.3 Dấu hiệu bênh lý

Tôm nhiễm bệnh có thể có màu hồng đến nâu đỏ Bên trong vỏ giáp xuất hiện những đốm trắng đường kính từ 0,5 đến 2 mm, xuất hiện đầu tiên ở vỏ giáp (carapace) và đốt bụng thứ V,VI Gan tuỵ trương có màu trắng hoặc hơi vàng Tôm có các biểu hiện bỏ ăn, lờ đờ, kém hoạt động, thường có khuynh hướng cặp mé bờ, sau đó chết và chìm xuống đáy Tôm có dấu hiệu trương nhân trong tế bào bị nhiễm Vài trường hợp tôm ở trạng thái hấp hối chuyển sang màu đỏ hoặc hồng, tỉ lệ chết tăng dần đến 80 hay 100% trong vòng 7 – 10 ngày (Bùi Quang Tề, 2003)

Hình 2.3 Tôm nhiễm WSSV và tế bào nhiễm WSSV (Vlak., 2002)

(A) Tôm bị nhiễm WSSV

(B) Tế bào bị nhiễm WSSV trong mang của tôm sông

2.2.4 Phương thức lan truyền bệnh

Mầm bệnh WSSV có thể lan truyền theo 2 trục:

Trục ngang: là con đường chủ yếu Từ nguồn nước, từ thức ăn, từ các loài giáp xác hoang dã trong ao hoặc ngoài ao xâm nhập trong quá trình thay nước Đặc biệt, khi tôm ăn xác những con tôm chết do bệnh đốm trắng trong ao sẽ dẫn đến sự lan truyền bệnh rất nhanh và gây chết hàng loạt (Tookwinas, 1998) Ngoài ra, chó, mèo, các loài chim ăn thịt và con người cũng là trung gian mang mầm bệnh từ ao này sang ao khác

Trục dọc: biểu hiện sự truyền bệnh từ bố mẹ sang con Tuy nhiên khả năng truyền theo trục dọc vẫn chưa được chứng minh mặc dù WSSV đã được phát hiện trong một số giai đoạn trứng tôm khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử (Tookwinas, 1998)

2.3 Các phương thức quản lý nhằm tăng cường sức chịu đựng của tôm nuôi đối với bệnh đốm trắng

Dịch bệnh bùng phát không phải chỉ do sự hiện diện của tác nhân gây bệnh mà đó là kết quả của sự tương tác rất phức tạp giữa mầm bệnh, vật chủ và môi trường Vật chủ phải mẫn cảm với mầm bệnh và điều này chịu ảnh hưởng của yếu tố di truyền, tình trạng dinh dưỡng, tuổi và sự hiện diện của virus ở các giai đoạn sớm của chu kỳ sống, trạng thái sinh lý của vật chủ, sự hiện diện và ảnh hưởng của các yếu tố gây stress lên vật chủ cũng như chất lượng môi trường nuôi (Newman, 1999)

Do đặc điểm cơ chế kháng bệnh của tôm chủ yếu dựa vào các đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu, cho đến nay việc phòng ngừa dịch bệnh virus trên tôm nói chung và bệnh đốm trắng nói riêng còn rất hạn chế Hiện không có biện pháp đáng tin cậy nào để phòng ngừa dịch bệnh đốm trắng xảy ra mà biện pháp đang được sử dụng rộng rãi trên thế giới là “Phòng ngừa tổng hợp” Bước đầu tiên trong việc quản lý sức khoẻ tôm nuôi là tăng cường các biện pháp an toàn nghiêm ngặt để ngăn chặn các mầm bệnh lây lan đến hệ thống nuôi như:

- Loại bỏ mầm bệnh trong ao và nước trước khi thả giống - Sử dụng nguồn giống khoẻ mạnh, không mang mầm bệnh - Loại trừ các con đường truyền bệnh

Tiếp đến, trong quá trình nuôi, một yếu tố quan trọng là giảm tối thiểu tình trạng stress bởi sự thay đổi đột ngột của chất lượng nước ao nuôi sẽ làm tôm bị sốc Đây là điều kiện để dịch bệnh bùng phát trong đó có bệnh đốm trắng Các yếu tố đặc biệt quan trọng là oxy hòa tan, nhiệt độ, độ mặn và pH Vidal (2001) đã xác định được

mối liên hệ giữa bệnh đốm trắng và nhiệt độ của nước Nghiên cứu này chỉ ra rằng với nhiệt độ 25oC, khả năng 100% tôm chết do bệnh đốm trắng; nếu nhiệt độ tăng lên 32oC thì tỷ lệ chết của tôm chỉ khoảng 20% Kết quả này được giải thích là do nhiệt độ của nước tăng lên làm giảm khả năng tái tạo của WSSV Song song đó, việc bổ sung vào khẩu phần ăn của tôm các chất chất kích thích miễn dịch, vitamin, vaccine… là cần thiết nhằm tăng cường đáp ứng miễn dịch của tôm chống lại mầm bệnh

2.3.1 Chất kích thích miễn dịch

Chất kích thích miễn dịch là các hợp chất hóa học có khả năng làm tăng họat tính của các tế bào bạch cầu và vì thế chúng có thể giúp tăng cường tính kháng của vật nuôi đối với sự xâm nhiễm của virus, vi khuẩn, nấm và các vật ký sinh khác Bên cạnh đó các chất này cũng giúp chống lại các tế bào ung thư ở người nhờ vào khả năng hoạt hóa các tế bào bạch cầu nhận ra và tiêu diệt các tế bào khối u (Jan Raa, 2000)

Hầu hết các chất kích thích miễn dịch được tạo ra từ các phân tử cấu trúc của tế bào vi khuẩn, nấm sợi và nấm men Theo Raa (1996), các chất này có 7 nhóm:

Các phân tử cấu trúc của vi khuẩn (lipopolysaccharide , lipopeptide,

Schizophyllum commune được sử dụng với lượng 2 – 10 g/kg thức ăn trong thời gian

20 ngày, thời gian giản cách 10 ngày là phù hợp cho tôm sú (Chang và ctv, 2002)

Việc sử dụng chất kích thích miễn dịch nhằm tăng cường tính kháng của tôm sú đối với virus WSSV đã được nghiên cứu trong những năm gần đây Trong đó -glucan đã được nghiên cứu khá kĩ Đây là một loại hợp chất đường thu được từ nhiều nguồn khác nhau: nấm men, vi khuẩn, các loại nấm khác Mỗi loại có cấu trúc đặc trưng riêng tùy theo liên kết giữa các phân tử glucose như ở nấm men -glucan có phân nhánh -1,3 và -1,6

Hình 2.4 Cấu trúc hóa học của -1,3/1,6-glucan

(http://www.imucell.com/imucell/pages/checkout/glucan.htm)

Song và ctv (1997) đã chứng minh được rằng β-1,3/1,6-glucan từ thành tế bào

nấm men Saccharomyces cerevisiae có khả năng tăng cường tính kháng của

P.monodon đối với WSSV Tỉ lệ sống của PL66 và PL113 lần lượt là 59% và 24% sau

khi cảm nhiễm tôm bằng cách ngâm với WSSV trong 6 giờ Trong một nghiên cứu

gần đây, Chang và ctv (2002) đã bổ sung β-1,3-glucan từ vào thức ăn viên của tôm

với các liều 0, 1, 2, 10, và 20 g/kg thức ăn Nghiên cứu này được tiến hành trên tôm ở giai đoạn Juvenile (6,5 ± 0,4 g) Thời gian cho ăn là 20 ngày và sau đó sẽ tiến hành gây nhiễm với WSSV Kết quả cho thấy tôm ở các nghiệm thức có bổ sung β-1,3-glucan với liều nhỏ hơn 1 g/kg thức ăn chết hết đến ngày 12 sau khi gây nhiễm Trái lại ở nghiệm thức 10 g/kg thức ăn, tỷ lệ tôm sống đến ngày thứ 12 sau gây nhiễm là 42,2%, cao hơn một cách có ý nghĩa so với các nghiệm thức khác (P<0,05) Những tôm sống ở các nghiệm thức tiếp tục được quan sát đến ngày 60 sau cảm nhiễm Kết quả như sau:

Ở nghiệm thức 2 g/kg thức ăn, tỷ lệ tôm sống là 66,7% (20% quần thể ban đầu) Ở nghiệm thức 10 g/kg thức ăn, tỷ lệ tôm sống là 75% (31% quần thể ban đầu)

Ở nghiệm thức 20 g/kg thức ăn, tỷ lệ tôm sống là 75% (18,3% quần thể ban đầu)

Trọng lượng cơ thể của tôm tại thời điểm này là 10 – 15 g So với nghiệm thức đối chứng (không gây nhiễm virus), tỷ lệ tôm sống và trọng lượng cơ thể tôm là 77% và 11 – 15 g Song song với những kết quả trên, các tác giả cũng nghiên cứu sự biến động các thành phần của hệ đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu như số lượng và khả năng thực bào của tế bào máu, hoạt tính enzyme phenoloxidase, superoxide dismutase, nồng độ ion superoxide Nhận thấy rằng ở các nghiệm thức bổ sung 2, 10 và 20 g/kg thức ăn, sau khi cảm nhiễm, các thành phần trên biến đổi theo chiều hướng suy giảm nhưng phục hồi và đạt cực đại một vài ngày sau đó Sự biến đổi này có tác dụng làm tăng cường sức chịu đựng của tôm đối với WSSV

2.3.2 Vaccine

Vaccine là một sản phẩm được tạo nên từ chính các tác nhân gây bệnh, hay các độc tố do các tác nhân gây bệnh tiết ra, nhằm tác động vào hệ thống miễn dịch đặc hiệu của động vật có xương sống trong đó có cá để tạo ra các phản ứng miễn dịch (Lê

Thanh Hùng, 2000)

Hiện có 5 loại vaccine đang được dùng trong nuôi trồng thủy sản: Vaccine bất hoạt hoá (Inactivate), Vaccine hoạt lực yếu (Live Attenuated), Vaccine tái tổ hợp (Recombinant), Vaccine là DNA và Vaccine được sản xuất từ nội tạng của cá bị bệnh Các vaccine này được dùng để phòng các bệnh do virus (Viral vaccines), do vi khuẩn (Bacterial vaccines) và do ký sinh trùng (parasite vaccines) cho động vật thủy sản (Lê Thanh Hùng, 2000)

Việc sử dụng vaccine cho tôm hay các loài động vật giáp xác nói chung còn đang trong giai đoạn nghiên cứu Do đặc điểm cơ thể thiếu hệ đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và chỉ dựa hoàn toàn vào các đáp ứng miễn dịch tự nhiên nên có ý kiến cho rằng việc sử dụng vaccine cho tôm là không thực tế Tuy nhiên trong các nghiên cứu gần

đây trên tôm sú P.monodon, Witteveldt và ctv (2003) đã chứng minh được rằng một cơ

chế bảo hộ và đáp ứng miễn dịch chuyên biệt có thể được kích thích sau khi cấp vaccine tiểu đơn vị Bản chất của các vaccine này là các vi khuẩn được chuyển nạp gen biểu hiện các protein cấu trúc vỏ VP19 và VP28 của WSSV Đây là các protein hiện diện nhiều trên vỏ của WSSV và tương tác một cách mạnh mẽ với các kháng thể đa dòng được tạo ra từ thỏ (Van Hulten và ctv, 2000b) Vaccine được trộn với thức ăn

và cung cấp cho tôm trong 7 ngày Sau đó, tiến hành cảm nhiễm bằng cách ngâm tôm trong nước biển chứa WSSV trong 7 giờ Kết quả cho thấy ở các nhóm tôm được cấp vaccine chứa VP28 và hỗn hợp VP28 + VP19 cho tỷ lệ chết tích lũy (30% và 50%) thấp hơn so với nhóm tôm được cấp vaccine là các vector rỗng (empty vector) và các nhóm đối chứng dương Chọn ngẫu nhiên các cá thể còn sống để kiểm tra sự hiện diện của WSSV, tất cả đều cho kết quả âm tính Song song đó, các tác giả cũng nghiên cứu thời điểm khởi đầu và thời gian bảo hộ của vaccine Nhóm tôm được cấp vaccine chứa VP28 (vaccine cho tỷ lệ tôm sống cao) được chia làm 3 nhóm nhỏ hơn để tiến hành cảm nhiễm ở các thời điểm khác nhau 3, 7 và 21 ngày sau khi ngừng cấp vaccine Tỷ lệ tôm sống cao đáng kể ở các nghiệm thức 3 và 7 ngày sau khi cấp vaccine (64% và 77%) Trong khi đó, ở nghiệm thức 21 ngày, tôm sống với tỷ lệ thấp (21%) Điều này chứng tỏ hiệu quả bảo hộ của vaccine đã giảm

Qua nghiên cứu trên mặc dù chưa hiểu rõ cơ chế tác động của các vaccine tiểu đơn vị lên hệ miễn dịch của tôm nhưng cũng cho thấy ở tôm có tồn tại một bộ nhớ miễn dịch đặc hiệu Chính vì vậy việc cấp vaccine qua đường miệng cho tôm chống lại WSSV là có thể Nó mở ra một hướng đi mới trong việc thiết lập những phương thức quản lý thực tế nhằm ngăn ngừa WSSV cũng như các tác nhân gây bệnh khác cho tôm nuôi

2.3.3 Vitamin

Vitamin được định nghĩa như nhóm chất hữu cơ hiện diện trong thúc ăn với một lượng rất nhỏ mà cơ thể sinh vật không tổng hợp được hay tổng hợp không đủ cho nhu cầu cơ thể Chất hữu cơ này không phải là các amino acid hay acid béo thiết yếu, chúng giữ vai trò rất quan trọng trong dinh dưỡng và sự thiếu hụt lâu dài các dưỡng thường bị mất đi trong quá trình chế biến thức ăn cho động vật thủy sản Do đó chất này sẽ dẫn đến sự xuất hiện các triệu chứng bệnh cho động vật (Lê Thanh Hùng,

2000)

Hầu hết các vitamin có vai trò như một co-enzyme hay các tác nhân bổ trợ các enzyme thực hiện các phản ứng sinh hoá trong cơ thể sinh vật Vitamin C (acid ascorbic) cũng không ngoại lệ Chất này dễ bị phân huỷ ở nhiệt độ cao (60oC) nên thường được bổ sung vào thức ăn cho tôm với hàm lượng khá cao Shiau và ctv (1994) đã xác định được nhu cầu vitamin C cho tôm sú đạt mức tăng trưởng tối đa vào khoảng 2000 mg/kg thức ăn Do tan nhiều trong nước, vitamin C được sử dụng trong thức ăn

tôm sú dưới dạng các dẫn xuất: ascorbyl 2-monophosphate Mg (C2MP-Mg), ascorbyl 2-monophosphate Na (C2MP-Na), L-ascorbyl 2-sulphate (C2PP)

L-Hình 2.5 Cấu trúc hóa học của vitamin C

(www.chemistry.wustl.edu/ /ascorbic.htm)

Chưa có nhiều nghiên cứu về cơ chế tăng cường đáp ứng miễn dịch của tôm của vitamin C Tuy nhiên, Merchie (1998) thấy rằng lượng vitamin C tăng từ 100 lên 3400 mg/kg trong khẩu phần ăn sẽ làm giảm tức thời tỷ lệ chết của tôm sú postlarval do bị sốc thấm lọc López và ctv (2003) đã chứng được vitamin C có tác dụng cải thiện tốc độ tăng trưởng ở tôm Hàm lượng protein máu, tổng lượng tế bào máu, lượng tế bào hạt (granular cell) và hoạt tính Prophenoloxidase ở nhóm tôm được bổ sung vitamin C trong 40 ngày cao hơn các nhóm khác

Cơ chế tác động của vitamin C có giống như một chất kích thích miễn dịch hay không vẫn chưa được xác định rõ Tuy nhiên nó có tác dụng như một chất chống oxy hóa, có vai trò trong việc bảo vệ các tế bào máu, giúp tăng cường hệ miễn dịch của tôm (López và ctv, 2002)

2.3.4 Fucoidan

Wilaiwan Chotigeat và ctv (2003) đã chứng minh được rằng việc bổ sung

fucoidan thô ly trích được từ một loài tảo biển Sargassum polycystum có thể làm giảm

tác động của bệnh đốm trắng do WSSV gây ra trên tôm sú Trong thí nghiệm này, fucoidan được trộn vào thức ăn cho 2 nhóm tôm có khối lượng 5 – 8 và 12 – 15 g Tôm được cho ăn khoảng 4 ngày trước khi gây nhiễm bằng cách ngâm tôm với dịch WSSV trong 2,5 giờ Sau đó tiếp tục cho ăn 15 ngày Kết quả thu được ở thời điểm10 ngày sau khi gây nhiễm, nhóm tôm được cho ăn fucoidan, tỷ lê sống cao nhất là 46% và 93% tương ứng với từng khối lượng Trong khi đó ở nhóm đối chứng, tôm chết 50% từ 3 – 5 ngày sau khi gây nhiễm Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy fucoidan

đóng vai trò như một chất kích thích miễn dịch giúp tăng cường hoạt động thực bào so với nhóm đối chứng

Bên cạnh những phương thức nêu trên việc sử dụng các chất diệt virus (antiviral) để ngăn chặn sự tổng hợp DNA hay sự dịch mã RNA của WSSV, cung cấp cho tôm những peptid diệt khuẩn giúp nâng cao sức sống của tôm nhiễm WSSV cũng được xem là các hướng đi có khả năng (Bonilla và ctv, 2005) Tuy nhiên, để ứng dụng vào thực tiễn sản xuất tôm thương phẩm thì cần có những công trình nghiên cứu nhằm đánh giá một cách chính xác và khoa học hiệu quả của tất cả các phương đánh thức này

2.4 Mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn WSSV trên tôm: 2.4.1 Sơ lược về mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn:

WSSV nhiễm trên một vài loài tôm nuôi và gây ra thiệt hại nghiêm trọng do tỷ lệ tôm chết có thể đến 100% trong 10 ngày sau khi bệnh phát (Karanusagar và ctv, 1997) Để giảm tác động của WSSV, một vài phương thức quản lý sức khoẻ tôm đã được đề xuất và thử nghiệm Tuy nhiên việc giá hiệu quả các phương thức này là rất khó Nguyên nhân là do trong các thí nghiệm này, việc gây nhiễm virus cho tôm được mô phỏng theo các con đường truyền nhiễm của WSSV trong tự nhiên Cụ thể, tôm thí nghiệm được ngâm trong nước có chứa dịch dịch huyền phù WSSV vô bào, nuôi chung với các vật chủ đã bị nhiễm WSSV, cho tôm ăn những mô đã bị nhiễm WSSV Trong đó, nhiễm virus qua đường miệng được xem là quan trọng nhất trong điều kiện tự nhiên và nuôi thương phẩm Tuy nhiên, những phương pháp này tồn tại một hạn chế rất lớn là lượng virus gây nhiễm cho mỗi tôm thì không được biết Hơn nữa phương thức này thì không đảm bảo được mỗi tôm đều nhận được một lượng virus như nhau

Theo Bonilla và ctv (2005) mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn sử dụng một dịch huyền phù virus đã được chuẩn độ để đánh giá hiệu quả các chiến lược nhằm làm giảm tác động của WSSV Theo đó, một mô hình gây nhiễm chuẩn cần 2 yếu tố chính:

Động vật thí nghiệm có tính biến dị di truyền thấp, có tính mẫn cảm cao với virus và không mang các mầm bệnh đặc biệt Trong các thí nghiệm gây nhiễm chuẩn thực hiện trong đề tài này, tôm sẽ được kiểm tra không mang các mầm bệnh như WSSV, MBV (Monodon Baculovirus), YHV (Yellow Head Vius), IHHNV (Infectious hypodermal hemotopoietic necrosis virus)… bằng các phương pháp mô học truyền thống (Histopathology), PCR (Polymerase chain reaction)…

Một dịch stock virus WSSV đã được chuẩn độ để xác định số đơn vị gây nhiễm 50% tôm thí nghiệm SID50(Shrimp infectious dose 50% endpoint)/ml dung dịch Một đơn vị SID50 là lượng virus sẽ gây nhiễm cho 50% tôm thí nghiệm Cho đến nay, trên thế giới vẫn chưa tìm ra môi trường nuôi cấy tế bào tôm do đó việc chuẩn độ

chỉ được thực hiện trên môi trường in vivo Một dãy các độ pha loãng theo cơ số 10

của dịch WSSV gốc được gây nhiễm cho tôm thí nghiệm bằng cách tiêm vào cơ hay qua đường miệng Dựa vào tỷ lệ tôm nhiễm ở mỗi độ pha loãng sẽ tính được hiệu giá gây nhiễm SID50 /ml của dịch virus theo công thức của Reed – Muench (1938)

2.4.2 Ứng dụng của mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn:

Với những đặc điểm nêu trên, mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn có nhiều ứng dụng quan trọng:

Đánh giá sự khác nhau về độ mẫn cảm của vật chủ ở các giai đoạn sống khác nhau hay giữa các loài có quan hệ gần gũi với cùng một tác nhân gây bệnh (Plumb và Zilberg, 1999) Cụ thể ở tôm, có sự khác biệt về tính mẫn cảm với WSSV ở các giai đoạn sống khác nhau (Yoganandhan và ctv, 2003) hay giữa các loài tôm (Lightner và ctv, 1998)

Độc tính hay khả năng gây bệnh của mầm bệnh là một đặc tính có thể đo lường được (Shapiro-Ilan và ctv, 2005) Do đó ứng dụng mô hình cảm nhiễm chuẩn, ta có thể so sánh độc lực của các chủng WSSV khác nhau

Mô hình cảm nhiễm chuẩn còn giúp ta đánh giá hiệu quả của các phương thức quản lý sức khỏe tôm như dùng các chất kích thích miễn dịch, các chất diệt virus (antivirals), vaccine… nhằm mục đích giảm tác động của bệnh đốm trắng

Nhằm hỗ trợ trong việc thiết lập các phương thức quản lý mới trong phòng ngừa bệnh đốm trắng có thể áp dụng trong thực tiễn, các nghiên cứu về quá trình phát sinh bệnh của WSSV có vai trò rất quan trọng Bonilla và ctv (2005) đã sử dụng mô hình cảm nhiễm chuẩn để nghiên cứu quá trình phát sinh bệnh của WSSV trên

Litopenaeus vannamei Tôm được chủng WSSV qua đường miệng với liều thấp

(101,5SID50) và liều cao (104SID50) Ở mỗi liều cảm nhiễm, mẫu tôm được thu ở 0, 6, 12, 18, 24, 36, 48 và 60 giờ sau gây nhiễm Vị trí của các tế bào bị nhiễm WSSV trên mô được xác định bằng kỹ thuật Hóa mô miễn dịch (immunohistochemistry – IHC) và trong huyết tương bằng kỹ thuật Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (Indirect

immunofluorescence – IIF) Các tác giả đã rút ra kết luận rằng ruột giữa và mang là những vị trí đầu tiên cho sự tái bản của WSSV Sự lan truyền mang tính hệ thống của WSSV diễn ra chủ yếu trên các tế bào tự do và mang, ruột trước, mô trung gian (integument), tuyến anten là các cơ quan đích chính của virus này

2.5 Sơ lược về hoá mô miễn dịch 2.5.1 Nguyên lý

Theo IHC world (2005) hoá mô miễn dịch là phương pháp định vị kháng nguyên trên mặt cắt của mô bằng cách sử dụng kháng thể đã được đánh dấu như là thuốc thử đặc hiệu Phương pháp này dựa trên cơ sở tương tác đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể có thể nhìn thấy qua các chất nhuộm hiện màu là enzyme khi chúng tác dụng với cơ chất

Nghiên cứu ứng dụng kháng thể đơn dòng để phát hiện virus WSSV trên tôm đã được phát triển bởi Poulos và ctv (2001) Chaivisuchangkura và ctv (2004), phát triển ứng dụng kháng thể đơn dòng kháng protein envelop VP28 để phát hiện virus WSSV trên tôm nhiễm bệnh

2.5.2 Các phương pháp nhuộm

Có nhiều phương pháp hoá mô miễn dịch có thể dùng để định vị kháng nguyên Việc lựa chọn phương pháp thích hợp dựa trên các thông số như loại mẫu vật và độ nhạy yêu cầu (IHC world, 2005) Theo Boenisch và ctv (2002), có 5 phương pháp nhuộm có thể được sử dung:

A Trực tiếp (direct method): Đây là kỹ thuật cổ điển nhất Quá trình thực hiện

như sau: Một kháng thể sơ cấp được đánh dấu enzyme phản ứng với kháng nguyên trên mô, sau đó sử dụng cơ chất tạo màu để phát hiện phản ứng Phương pháp này tiết kiệm được thời gian nhưng tín hiệu thu được rất ít, không dủ nhạy để đáp ứng nhu cầu ngày nay

B Gián tiếp hai bước (two-step indirect method): Đầu tiên cho một kháng thể

sơ cấp (thường là đơn dòng) kết hợp với kháng nguyên, sau đó bổ sung một kháng thể thứ cấp (thường là đa dòng) đánh dấu enzyme kháng lại kháng thể sơ cấp (bây giờ là kháng nguyên), và cuối cùng bổ sung cơ chất tạo màu Phương pháp này linh hoạt và

nhạy hơn phương pháp nhuộm trực tiếp

C Gián tiếp ba bước (three-step indirect method): Từ phương pháp B, bổ sung

thêm một kháng thể thứ cấp 2 kháng lại kháng thể thứ cấp 1 Cả hai kháng thể thứ cấp này phải được đánh dấu với cùng enzyme Việc bổ sung thêm một lớp kháng thể thứ 3 là để khuyếch đại tín hiệu Phương pháp này đặc biệt hữu dụng khi nhuộm những kháng nguyên có ít epitope

D.Phương pháp phức hợp miễn dịch enzyme tan: Tuỳ theo phúc hợp miễn dịch

enzyme, ta có các phương pháp khác nhau.Ví dụ: Phương pháp PAP (peroxidase anti

peroxidase) sử dụng phức hợp peroxidase – kháng peroxidase Trước tiên cho kháng

thể sơ cấp và phức hợp enzyme – kháng thể kháng enzyme phản ứng với kháng nguyên, sau đó bổ sung kháng thể thứ cấp với một lượng thừa để một vị trí Fab sẽ gắn với kháng thể sơ cấp, vị trí còn lại gắn với kháng thể trong phức hợp miễn dịch của enzyme Kháng thể sơ cấp và kháng thể của enzyme phải tạo ra từ cùng một loài Kháng thể thứ cấp phải trực tiếp kháng lại globulin miễn dịch của loài đó

E.Phương pháp (strept)avidin-biotin: Phương pháp nhuộm này dựa trên ái lực

lớn giữa (strept)avidin (Streptomyces avidinii ) và avidin (trứng gà) với biotin với độ

nhạy và khả năng khuyếch đại rất cao Thành phần cơ bản gồm kháng thể sơ cấp kháng kháng nguyên, kháng thể thứ cấp có gắn biotin kháng kháng thể sơ cấp, phức hợp enzyme-(strept)avidin-biotin (kỹ thuật avidin-biotin complex – ABC) hay streptavidin có đánh dấu enzyme (kỹ thuật labelled streptavidin-biotin – LSAB), và cuối cùng là dung dịch cơ chất Enzyme đánh dấu thường được sử dụng nhất là horseradish peroxidase và alkaline phosphatase

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm

A Thời gian tiến hành nghiên cứu: 2/2006 – 8/2006 B Địa điểm:

Trại thực nghiệm nuôi thuỷ sản Thủ Đức, 658 Kha vạn cân, phường Linh Đông, quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh

Phòng Mô Học – Trung tâm Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Khu Vực Nam Bộ – Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II

3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Vật liệu sinh học

Tôm sú 45 ngày tuổi

Nước biển được xử lý các bước: cơ học – hoá học - trung hoà Dòng virus WSSV-VN đã được chuẩn độ:105,2SID50/ml

Vitamine C dạng muối polyphosphate - sản phẩm C Vits của công ty Svaks, Ấn Độ

β-1,3/1,6-glucan - sản phẩm PIOMOS của công ty PIOTECH, Mỹ Thức ăn viên C.P 9003-P sản xuất tại Công ty TNHH Chăn nuôi C.P Việt Nam

3.2.2 Dụng cụ và hoá chất 3.2.2.1 Dụng cụ

a) Dụng cụ cho quản lý bể nuôi tôm

Bể composite 1 m3.

Máy bơm, vợt, máy đo thủy hoá…

b) Dụng cụ gây nhiễm WSSV cho tôm

Kim Isulin 0,5 ml, cỡ đầu kim 26

Micropipet 100 µl, 1000 µl, eppendoff 2 ml, găng tay, bông gòn tiệt trùng

Máy bơm nước, sục khí, đá bọt, bộ lọc cơ

Bể kính 126 lit

Vợt và thức ăn tôm lớn

c) Dụng cụ cho IHC

Panh, dao, kéo vô trùng

Máy xử lý mẫu tự động, máy cắt microtome, tủ ấm 37oC, bàn làm lạnh mẫu, nồi nước ấm, bình rót paraffin electrothermal, kính hiển vi quang học

c) Hóa chất cho IHC:

Cồn 50, 70, 95 và 99,6%

Parafin, nước cất khử ion, Tris–NaCl, Tris–HCl, xylene

Thuốc nhuộm Hematoxylin, keo dán Baume Canada, chloroform Dung dịch Davidson có thành phần như sau:

+ Cồn 95%: 330 ml + Formalin: 220 ml + Acid acetic glacial: 115 ml + Nước cất: 335 ml Hoá chất là lam dương:

+ Aceton: 250 ml + (3 – amino propyl) triethoxysaline: 5 ml

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp pha loãng dịch huyền phù virus

Từ dịch huyền phù virus ban đầu (10oC) hút 100 µl cho vào eppendorf có chứa 900 µl dung dịch BPS 1X Ta được độ pha loãng 10-1

Hút 100 µl từ độ pha loãng 10-1 cho vào eppendorf chứa 900 µl dung dịch BPS 1X Ta được độ pha loãng 10-2

Tiếp tục làm như trên, ta sẽ được độ pha loãng mong muốn

3.3.2 Phương pháp gây nhiễm virus WSSV trên tôm sú

Mỗi tôm được tiêm 100 µl dịch virus WSSV-VN đã chuẩn độ vào giữa mặt bên của đốt thứ 2 hoặc 3

3.3.3 Phương pháp thu mẫu cho IHC

Cắt đầu tôm, tách vỏ, lấy phần mang và gan tụy, để vào mảnh vải mùng nhỏ, cho vào cassette, đóng nắp và ngâm trong dung dịch Davidson trong thời gian từ 24 – 48 giờ Tỷ lệ mẫu : Davidson = 1 : 10

3.3.4 Phương pháp xác định WSSV trên tôm sú bằng kỹ thuật IHC

Để đáp ứng mục tiêu là chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng trên tôm sú, trong điều kiện của phòng thí nghiệm, chúng tôi sử dụng phương pháp ABC (avidin-biotin complex) theo protocol của Đại học Ghent (Bỉ) Trong đó, ta tiến hành nhộm mẫu với kháng thể sơ cấp 8B7 của chuột kháng protein WSSV VP28 (WSSV - 8B7 mAb) (4oC) (công ty Diagxotics), kháng thể thứ cấp gắn biotin, phức hợp streptavidin-biotinylated horseradish peroxidase và cơ chất là 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) Đọc kết quả trên kính hiển vi quang học ở vật kính 10X,

Hình 3.1 Gây nhiễm WSSV cho tôm bằng cách tiêm

40X, 100X Tế bào nhiễm WSSV có thể vùi dạng Crowdry A đặc trưng, nhân trương to và bắt màu nâu Quy trình thực hiện:

3.3.5 Phương pháp xác định tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV trên tôm thí nghiệm

Đọc mẫu nhuộm IHC dưới kính hiển vi quang học (vật kính 40X) Chọn vùng mô có nhiều tế bào nhiễm WSSV nhất, đếm số tế bào nhiễm và tế bào không nhiễm Từ đó tính tỷ lệ tế bào nhiễm TLN (%):

3.3.6 Phương pháp đo một số yếu tố môi trường nước

Đo nhiệt độ bằng nhiệt kế bách phân Đo NH3: đo bằng bộ test nhỏ giọt Vera Đo pH: đo bằng pH kế Scan 2

Xác định Oxy hoà tan (DO) theo phương pháp chuẩn độ Winkler trong thí nghiệm

3.3.7 Phương pháp xử lý số liệu

Số tế bào nhiễm TLN (%) =

Số tế bào không nhiễm X100 Ủ mẫu trong 24 – 72 giờ

giờ Nhận mẫu

Chuyển mẫu lên lam

Ủ mẫu ở 40oC đến khi mẫu dính chặt vào lam Nhuộm và đọc kết quả dưới kính hiển vi

Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng quát chẩn đoán IHC