ỨNG DỤNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA β-1,3/1,6-GLUCAN VÀ VITAMIN C LÊN ĐỘ MẪN CẢM ĐỐI VỚI VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (White spot syndrome virus-WSSV) CỦA TÔM SÚ (Penaeus monodon)

ỨNG DỤNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA β-1,3/1,6-GLUCAN VÀ VITAMIN C LÊN ĐỘ MẪN CẢM ĐỐI VỚI VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (White spot syndrome virus-WSSV) CỦA TÔM SÚ (Penaeus monodon)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** ĐẶNG TRẦN QN ỨNG DỤNG MƠ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA β-1,3/1,6-GLUCAN VÀ VITAMIN C LÊN ĐỘ MẪN CẢM ĐỐI VỚI VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (White spot syndrome virus-WSSV) CỦA TÔM SÚ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** ỨNG DỤNG MƠ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA β-1,3/1,6-GLUCAN VÀ VITAMIN C LÊN ĐỘ MẪN CẢM ĐỐI VỚI VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (White spot syndrome virus-WSSV) CỦA TÔM SÚ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn TS NGUYỄN VĂN HẢO ThS NGÔ XUÂN TUYẾN Sinh viên thực ĐẶNG TRẦN QUÂN KHÓA: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006- MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  APPLICATION OF STANDARDIZIED CHALLENGE MODEL TO TEST THE EFFICACY OF β-1,3/1,6-GLUCAN AND VITAMIN C ON THE SUCCEPTIBILITY OF BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon) TO WHITE SPOT SYNDROME VIRUS (WSSV) GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Dr NGUYEN VAN HAO MSc NGO XUAN TUYEN Student DANG TRAN QUAN TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cám ơn quý thầy trƣờng Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh truyền đạt cho kiến thức năm học vừa qua Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp này, nhận giúp nhiều từ thầy cô anh chị công tác Viện Nghiên Cứu Ni Trồng Thủy Sản II Trong tơi xin chân thành cảm ơn: - TS Nguyễn Văn Hảo tận tình giải đáp vƣớng mắc trình thực tập, giúp tơi hồn thành tốt đề tài tốt nghiệp - ThS Ngô Xuân Tuyến ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn phƣơng pháp nghiên cứu, tài liệu khoa học, giúp tơi hồn thành tốt đề tài tốt nghiệp - Kỹ sƣ Phạm Thị Tuyết Anh tận tình hƣớng dẫn tơi mặt thao tác phịng thí nghiệm, giúp đỡ tơi nhiều q trình thực tập - Các anh chị phịng Mơ, anh chị trại thực nghiệm Thủ Đức tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực tập vừa qua Cuối cảm ơn bạn lớp Công nghệ sinh học 28 thân mến đồng hành suốt chặng đƣờng đại học Tp.Hồ Chí Minh, ngày…tháng…năm 2006 Sinh viên Đặng Trần Qn iv TĨM TẮT Trong cơng nghệ ni tơm nay, đặc biệt mơ hình ni tơm mật độ cao, việc áp dụng giải pháp, phƣơng thức quản lý nhằm tăng cƣờng hiệu sản xuất đóng góp đáng kể vào suất ni Giải pháp quản lý sử sụng sản phẩm sinh học tăng cƣờng sức khỏe cho tôm thông qua việc tăng cƣờng hiệu đáp ứng miễn dịch tôm với mầm bệnh, với mầm bệnh virus, đƣợc xem giải pháp quan trọng Trong thí nghiệm này, chúng tơi đánh giá thay đổi tính mẫn cảm tôm sú tiền trƣởng thành Penaeus monodon virus đốm trắng (WSSV) sau ứng dụng giải pháp bổ sung chất kích thích miễn dịch, vitamin C β1,3/1,6-glucan vào thức ăn nuôi tôm khoảng thời gian định Sử dụng mơ hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn đƣợc xây dựng Phịng thí nghiệm virus - Đại học Gent, Vƣơng Quốc Bỉ, kỹ thuật xét nghiệm hóa mơ miễn dịch phƣơng pháp tiêm mơ dịch gốc virus đốm trắng dòng Việt Nam (WSSV-VN) đƣợc tinh xác định độc lực thông qua chuẩn độ để xác định thay đổi độ mẫn cảm virus tơm Thí nghiệm đƣợc tiến hành với hai liều tiêm cao thấp độ chuẩn SID50 dịch gốc WSSV-VN cho tôm sú tiền trƣởng thành sau nuôi với nghiệm thức thức ăn có bổ sung β-1,3/1,6-glucan (10g/kg thức ăn), bổ sung vitamin C (5g/kg thức ăn) không bổ sung thời gian 15 ngày Gây nhiễm thực nghiệm cho tôm liều thấp (101,5SID50) liều cao (104SID50) dịch virus WSSV-VN cho nhóm tơm thuộc nghiệm thức Thu mẫu tôm thời điểm khác sau gây nhiễm: 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120 giờ, để khảo sát thay đổi độ mẫn cảm thông qua đánh giá biến đổi tình trạng sức khỏe tơm tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV tôm nghiệm thức Kết thu đƣợc thí nghiệm gây nhiễm với liều thấp, tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV tôm nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan, vitamin C đối chứng lần lƣợt 4,12, 3,49 4,94% Sự khác biệt tỷ lệ tế bào nhiễm nghiệm thức khơng có ý nghĩa (P>0,05) Các dấu hiệu lâm sàng bệnh đốm trắng xuất sớm nghiệm thức đối chứng so với nghiệm thức lại Chƣa thấy rõ khác biệt nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan vitamin C Thí nghiệm gây nhiễm với liều cao, tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV tôm nghiệm thức β-1,3/1,6glucan, vitamin C đối chứng lần lƣợt 3,04, 3,69 4,49% Chỉ có khác biệt có ý nghĩa (P0,05) Ở nhóm tiêm với liều cao, dấu hiệu lâm sàng bệnh đốm trắng đến sớm nhóm tiêm liều thấp vi MỤC LỤC Trang tựa i Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng ix Danh sách hình x PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Nội dung 1.3 Mục tiêu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Hệ miễn dịch tôm sú 2.2 Bệnh đốm trắng tôm sú 2.2.1 Lịch sử phân bố bệnh đốm trắng 2.2.2 Tác nhân gây bệnh 2.2.3 Dấu hiệu bệnh lý 2.2.4 Phƣơng thức lan truyền 2.3 Các phƣơng thức quản lý nhằm tăng cƣờng sức chịu đựng tôm bệnh đốm trắng 2.3.1 Chất kích thích miễn dịch 2.3.2 Vaccin 10 2.3.3 Vitamin 11 2.3.4 Fucoidan 12 2.4 Mơ hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn WSSV tôm 13 2.4.1 Sơ lƣợc mơ hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn 13 2.4.2 Ứng dụng mơ hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn 14 2.5 Sơ lƣợc hóa mơ miễn dịch 15 2.5.1 Nguyên lý 15 2.5.2 Các phƣơng pháp nhuộm 15 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIỆN CỨU 16 3.1 Thời gian địa điểm 16 3.2 Vật liệu nghiên cứu 16 3.2.1 Vật liệu sinh học 16 3.2.2 Dụng cụ hóa chất 16 3.2.2.1 Dụng cụ 16 3.2.2.2 Hoa chất 17 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 3.3.1 Phƣơng pháp pha loãng dịch huyền phù virus 19 3.3.2 Phƣơng pháp gây nhiễm WSSV tôm sú 19 3.3.3 Phƣơng pháp thu mẫu cho IHC 19 3.3.4 Phƣơng pháp xác định WSSV tôm kỹ thuật IHC 19 3.3.5 Phƣơng pháp tính tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) tơm thí nghiệm20 3.3.6 Phƣơng pháp đo số yếu tố môi trƣờng nƣớc 20 3.3.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu 20 vii 3.4 Bố trí thí nghiệm 21 3.4.1 Chuẩn bị vật liệu cho thí nghiệm gây nhiễm chuẩn 21 3.4.2 Bố trí thí nghiệm gây nhiễm chuẩn cho tôm với dịch virus WSSV-VN chuẩn độ (105,2SID50/ml) 21 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Đáng giá vật liệu phục vụ cho thí nghiệm gây nhiễm chuẩn 23 4.2 Khảo sát ảnh hƣởng phƣơng thức quản lý khác lên độ mẫn cảm tôm WSSV 24 4.2.1 Kết thí nghiệm gây nhiễm tơm sú với liều thấp (101,5SID50/ml) 24 4.2.2 Kết thí nghiệm gây nhiễm tôm sú với liều cao (101,5SID50/ml) 28 4.2.3 Kết so sánh độ mẫn cảm với liều gây nhiễm tôm phƣơng thức quản lý 32 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 5.1 Kết luận 35 5.2 Đề nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO …37 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT WSD: White spot disease WSSV: White spot syndrome Virus WSSV-VN: White spot syndrome virus Vietnam IHC: Immunohistochemistry proPO: prophenoloxidase LPS: Lipopolysaccharide BGBP: Beta-glucan biding protein VP19: envelope protein (19 kDa) VP28: envelope protein (28 kDa) DNA: Deoxiribonucleotide acid RNA: Ribonucleotide acid MBV: Monodon Baculovirus YHV: Yellow Head Vius IHHNV: Infectious hypodermal hemotopoietic necrosis virus PCR: Polymerase chain reaction PAP: peroxidase anti peroxidase ABC: avidin-biotin complex LSAB: labelled streptavidin-biotin BPS: Buffer phosphate saline DAB: 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride SID50/ml: Shrimp infectious dose 50% enpoint ix DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm ni tơm sú với phƣơng thức quản lý khác 20 Bảng 3.2 Các thời điểm thu mẫu đợt thí nghiệm 21 Bảng 4.1 Kết theo dõi tiêu mơi trƣờng q trình thí nghiệm 23 Bảng 4.2 Kết tăng trọng tôm sau 15 ngày nuôi 23 Bảng 4.3 Kết theo dõi thực nghiệm dấu hiệu lâm sàng bệnh đốm trắng sau gây nhiễm liều thấp…………………………………………… 24 Bảng 4.4 Kết tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV tôm kiểm tra IHC liều thấp 25 Bảng 4.5 Kết kiểm tra tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) tôm IHC theo thời gian thu mẫu liều thấp………………………………………26 Bảng 4.6 Kết theo dõi thực nghiệm dấu hiệu lâm sàng bệnh đốm trắng sau gây nhiễm liều cao 28 Bảng 4.7 Kết tỷ lệ nhiễm WSSV tôm nghiệm thức liều cao 30 Bảng 4.8 Kết kiểm tra tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV tôm IHC thời điểm thu mẫu liều cao…… ………………………………………30 Bảng 4.9 So sánh kết theo dõi thực nghiệm phân tích tỷ lệ cảm nhiễm (IHC) liều tiêm……………………………………………… 32 Bảng 4.10 Tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) tôm phƣơng thức quản lý đƣợc gây nhiễm với liều tiêm………………………………………………33 x 38 10 Chaivisuchangkura P Tangkhabuanbutra J., Longyang S., Sithigorngul W., Rukpartanporn S., Menasveta P., Sithigorngul P., 2004 Monoclonal antibodies against a truncated viral envelope protein (VP28) can detect white spot syndrom virus (WSSV) infections in shrimp Science Asia 30: 359-363 11 Cheng-Fang Changa, Mao-Sen Sub, Houng-Yung Chenc,*, I-Chiu Laob, 2002 Dietary -1,3-glucan effectively improves immunity and survival of Peneaus monodon challenged with white spot syndrome virus Fish & Shellfish immunology 15:297-310 12 Clarissa B Granja*, Oscar M Vidal, Gustavo Parra, Marcella salazar, 2006 Hyperthermia resduces viral load of White spot syndrome virus in Peneaus vannamei Disease of Aquatic Organism, Vol.68: 175-180 13 C M Escobedo-Bonilla1,2, M Wille1, V Alday Sanz3, P Sorgeloos1, M B Pensaert2, H J Nauwynck2,*, 2005 In vivo titration of white spot syndrome virus (WSSV) in specific pathogen-free Litopeneaus vannamei by intramuscular and oral routes Disease of Aquatic Oranisms, Vol 66:163-170, 2005 14 Francisco Vargas-Albores*, Gloria Yepiz-Plascencia, 2000 Beta glucan biding protein and its role in shrimp immune response.Aquaculture 191:13-21 15 Joroen Witteveldt, Carolina C Cifuentes, Just M Vlak*, and Marielle C W van Hulten, 2004 Protection of Peneaus monodon against White Spot Syndrome Virus by Oral Vaccination Journal of Virology, vol 78, No.4,p.2057-2061 16 Joseph E Burgents, Karen G Burnett *, Louis E Burnett, 2004 Disease resistance of Paciffic white shrimp, litopeneaus vannamei, following the dietary administration of a yeast culture food supplement Aquaculture 231:1-8 17 Kimbrell, D A and, B Beutler, 2001 The evolution and genetics of innate immunity Nat Rev Gen 2:256-267 18 Lightner DV, Hasson KW, White BL, Redman RM, 1998 Experimental infection pf western hemisphere penaeid shrimp with asian white spot syndrome virus and asian yellow head virus Journal of aquatic animal health 10:217-281 19 Machie, G., kontara, E.K.M., Lavens, P., Robles, R., Kurmaly, K., Sogeloos, P., 1998 Effect of vitamin C and astaxanthin on stress and disease resistance of postlarval tiger shrimp Penaeus monodon (Fabricius) Aquac Res 29:579-585 20 Mário Arala-Chavesa,*, Teresa Sequeriab, 2000 Is there any kind of adaptive 39 immunity in invertebrate? Aquaculture 191:247-258 21 Nelda Lópeza, Gerard Cuzonb, Gabrila Gaxiolac, Gabriel Taboadac, Manuel Valenzuelac, Cristina Pascualc, Ariadna Sánchezc, Carlos rosasc,*, 2003 Physiological, nutritional, and immunological role of dietary ascorbic acid 2-monophosphate in 1-3 glucan and Litopeneaus vannamei juveniles.Aquaculture 224:223-243 22 Poulos B.T., Pantoja C.R., Bradley-Dunlop D., Aguilar J., Lightner D.V., 2001 Development and application of monoclonal antibodies for the detection of white spot syndrome virus of penaeid shrimp.Disease of Aquatic Organisms 47:13-23 23 Quiong Wang *, Brenda L.White, Rita M Redman, Donald V Lightner, 1999 Per os challenge of Litopenaeus Vannamei postlarvae and Farfantepenaeus duorarum juveniles with six geographic isolates of white spot syndrome virus Aquaculture 170:179-194 24 Raa, J., 1996 The use of immunostimulatory Substances in fish and shellfish farming Reviews in fisheries science 4:229-288 25 Raa, J., 2000 The use of immune-stimulants in fish and shellfish feeds In: Cruzsúarez, L.E., Ricque-Marie, D., Tapia-Salazar, M., Olvera-Novoa, M.A.yCivera-Cerecedo, R.,(Eds) Avances en Nutrition Acuícola V Memorias del V Simposium Internacional de Nutrición Accola Mérida, Yucatán, Mexico 26 Shiau, S.-Y., 998 Nutrition requirement of penaeid shrimp Aquaculture 64:77-93 27 Song YL, Liu JJ, Chan LC, Sung HH, 1997 Glucan-induced disease resistance in tiger shrimp (Peneaus monodon) Fish Vaccinol 90:11-17 28 Toshiaki Itamia,*, Masaya Asanob, Kazuo Tokushigeb, Kazushige Kubonob, Atsushi Nakagawab, Noboru Takenob, Hiroyuki Nishimuraa, Masakazu Kondoc, Yukinori Takahashia, 1998 Enhancement of disease resistance of kuruma shrimp, Peneaus japonicus, after oral administration of peptidoglycan derived from Bifidobacterium thermophilum Aquaculture 164:277-288 29 van Hulten, Martin Reijns, Angela M G Vermeesch, Fokko Zandbergen and Vlak, 2002 Identification of VP19 and VP15 of white spot syndrome virus 40 (WSSV) and glycosylation status of the WSSV major structural proteins Journal of General Virology 83: 257 – 265 30 J.M., 2002 Identification of VP19 and VP15 of white spot syndrome virus (WSSV) and glycosylation status of the WSSV major structural proteins Journal of General Virology 83: 257 – 265 31 Vlak J.M., Bonami J.R., Flegel T.W., Kou G.H., Lightner D.V., Lo C.F., Loh P.C and Walker P.J., 2002 Nimaviridae - A new virus family infecting aquatic invertebrates XII Congress of Virology 2002, Paris 32 V Vetvicka 1* , P Sima, 2004 -Glucan on invertebrates ISJ 1:60-65 33 Yang F., Jun He, Xionghui Lin, Qin Li, Deng Pan, Xiaobo Zhang, and Xun Xu, 2001 Complete Genome Sequence of the Shrimp White Spot Bacilliform Virus Journal of Virology 75, p.11811-11820 Tài liệu internet 34 http://www.imucell.com/imucell/pages/checkout/glucan.htm 35 http://www.chemistry.wustl.edu/ /ascorbic.htm 41 PHỤ LỤC KẾT QUẢ THEO DÕI CÁC THÍ NGHIỆM Chuẩn bị vật liệu: ni tơm sú với phƣơng thức quản lý khác β-1,3/1,6Glucan 8h 27/5/0 28/5/0 14h Biểu 8h 14h Biểu 8h 29/5/0 14h Biểu 8h 30/5/0 14h Biểu 8h 31/5/0 14h Biểu 8h 01/6/0 14h Biểu 02/6/0 8h Vitamin C Đối chứng pH = 7.35, DO = 6.32mg/l, to = 27.5oC pH=7.4, DO=6.25mg/l, to = 28oC Ăn hết thức ăn sau 1h pH=7.48, to = 28oC pH=7.45, to = 28oC Tơm bình thƣờng, ăn hết thức ăn sau 1h pH = 7.66, to = 28oC pH = 7.68, to = 28oC Tôm ăn chậm hơn, rụng râu, chậm chạp pH = 7.72, to = 28oC pH = 7.69, to = 28oC Khoảng 2h hết thức ăn pH = 7.71, to = 28oC pH = 7.78, to = 28oC Còn thừa thức ăn (10%) pH = 7.72, to = 28oC pH = 7.68, to = 28oC Phản xạ linh hoạt hơn, 2h hết thức ăn pH=7.37, DO=6.4mg/l, to=27.5oC Ăn hết thức ăn khoảng 1h pH=7.48, to =28oC pH=7.45, to =28oC pH=7.56, DO=6.56mg/l, to=28oC pH=7.55, DO=6.72mg/l, to =28oC Ăn hết thức ăn khoảng 1h pH=7.52, to =28oC pH=7.49, to =28oC Ăn hết thức ăn khoảng 1h Ăn hết thức ăn khoảng 1h pH=7.65, to =28oC pH=7.58, to =28oC pH=7.63, to =28oC pH=7.63, to =28oC Rụng râu, phản ứng chậm Rụng râu, phản ứng chậm pH=7.52, to =28oC pH=7.62, to =28oC pH=7.56, to =28oC pH=7.61, to =28oC Khoảng 2h hết thức ăn Khoảng 2h hết thức ăn pH=7.63, to =28oC pH=7.65, to =28oC pH=7.65, to =28oC pH=7.66, to =28oC Khoảng 2h hết thức ăn Khoảng 2h hết thức ăn pH=7.69, to =28oC pH=7.71,to =28oC pH=7.66 to =28oC pH=7.69 to =28oC Phản xạ nhanh hơn, hết thức ăn Phản xạ nhanh, hết thức ăn pH=7.58,to =28oC pH=7.64, to =28oC, pH = 7.52,DO = pH=7.4, DO=6.4mg/l, to =28oC 42 6.25 mg/l , t = 28oC,NH3 = 0.5mg/l pH = 7.49, DO = 6.25mg/l, to = 28oC D0=6.35mg/l, NH3=0.5mg/l D0=6.48mg/l,NH3= 0.5mg/l pH=7.57, DO=6.4mg/l, to =28oC pH=7.63,to=28oC, DO=6.48 mg/l Hoạt động bình thƣờng, 1h hết thức ăn 1h hết thức ăn pH=7.59, to =28oC pH=7.69, to =28oC pH=7.6, to =28oC pH=7.7, to =28oC 1h hết thức ăn 1h hết thức ăn pH=7.58, to =28oC pH=7.68, to =28oC pH=7.54, to =28oC pH=7.62, to =28oC 1h hết thức ăn 1h hết thức ăn pH=7.61, to =28oC pH=7.65, to =28oC pH=7.58, to =28oC pH=7.68, to =28oC 1h hết thức ăn 1h hết thức ăn pH=7.62,to=28oC pH=7.72,to=28oC pH=7.61.to=28oC pH=7.73.to=28oC 1h hết thức ăn 1h hết thức ăn pH=7.57,to=28oC pH=7.71,to=28oC pH=7.6,to=28oC pH=7.67,to=28oC 1h hết thức ăn 1h hết thức ăn pH=7.49,to=28oC pH=7.56,to=28oC pH=7.53,to=28oC pH=7.6,to=28oC Phản xạ nhanh, ăn hết thức ăn Phản xạ nhanh, 1h hết thức ăn Họat động bình thƣờng, 1h hết thức ăn pH = 7.61, toC = 28oC pH = 7.63, to = pH=7.52,to=28oC pH=7.53,to=28oC pH=7.58,to=28oC pH=7.58,to=28oC o 14h Biểu 8h 03/6/0 14h Biểu 8h 04/6/0 14h Biểu 8h 05/6/0 14h Biểu 8h 06/6/0 14h Biểu 8h 07/6/0 14h Biểu 8h 08/6/0 14h Biểu 09/6/0 8h 14h Tôm ăn nhanh hơn, 1h hết thức ăn pH = 7.44, to = 28oC pH = 7.41, to = 28oC Tơm bình thƣờng, ăn hết thức ăn pH = 7.6, to = 28oC pH = 7.55, to = 28oC Tôm ăn nhanh (chƣa đƣợc 1h) pH = 7.67, to = 28oC pH = 7.63, to = 28oC Phản xạ nhanh, ăn hết thức ăn pH = 7.58, to = 28oC pH = 7.6, to = 28oC Phản xạ nhanh mạnh, hết thức ăn pH = 7.49, to = 28oC pH = 7.46, to = 28oC Ăn hết thức ăn, phản xạ nhanh pH = 7.53, to = 28oC pH = 7.59, to = 28oC 43 Biểu 8h 10/6/0 14h Biểu 28oC Phản xa nhanh, ăn hết thức ăn pH = 7.71, to = 28oC NH3 = 0.5 mg/l pH = 7.69, to = 28oC Phản xạ nhanh, ăn hết thức ăn 1h hết thức ăn 1h hết thức ăn pH=7.62,to=28oC NH3=0.5mg/l pH=7.62,to=28oC, NH3=0.5mg/l pH=7.64,to=28oC pH=7.64,to=28oC 1h hết thức ăn 1h hết thức ăn 44 Thí nghiệm gây nhiễm với liều thấp (101,5SID50/ml) β-1,3/1,6-glucan 12 16 20 24 Vitamin C Màu bình thƣờng Màu bình thƣờng Màu bình thƣờng Màu bình thƣờng Màu bình thƣờng Màu bình thƣờng Màu bình thƣờng Màu bình thƣờng Đỏ thân (1/24) Đỏ đuôi (4/24), Hơi đỏ thân (2/24) 27 33 Đỏ thân (1/24), Hơi đỏ thân (3/24) Đỏ thân (4/24) Hơi đỏ thân (3/24) Đỏ đuôi (2/24 37 Hơi đỏ thân (1/21) Đỏ thân (1/21) 40 Hơi đỏ thân (1/21) Đỏ thân (1/21) 44 Hơi đỏ thân (1/21) Đỏ (1/21) Đốm trắng (1/21) Hơi đỏ thân (3/21), Đỏ thân (4/21), Đỏ đuôi (2/21) Hơi đỏ thân (3/21) Đỏ thân (4/21) Đỏ đuôi (2/21) Hơi đỏ thân (6/21), Đỏ thân (3/21) Đỏ đuôi (1/21) Đỏ thân (4/21) Đỏ đuôi (1/21) 48 Đỏ thân (1/21) 51 Đỏ thân (1/18) Đốm trắng (5/18) Hơi đỏ thân (2/18) Đỏ thân (3/18) Đốm trắng (9/18) 56 Đỏ thân (1/18) Đốm trắng (7/18) 62 Màu bình thƣờng Đốm trắng (6/15) 68 Màu bình thƣờng Đốm trắng (6/15) 73 Màu bình thƣờng Đốm trắng (10/12) 78 Đỏ thân (1/12) Đốm trắng (10/12) Hơi đỏ thân (4/18) Đỏ thân (3/18) Đốm trắng (10/18) Hơi đỏ thân (3/15) Đỏ thân (2/15) Đốm trắng (9/15) Chết (2/15) Hơi đỏ thân (1/13) Đỏ thân (2/13) Đốm trắng(7/13) Chết (1/10) Đỏ thân (3/9) Đốm trắng (5/9) Chết(1/9) Đỏ thân (3/8) Đốm trắng (1/8) Đối chứng Hơi đỏ (1/27) Màu bình thƣờng Đỏ đuôi (5/24) Đỏ thân (1/27), Đỏđuôi (4/27) Hơi đỏthân (4/24), Đỏ thân (1/24), Đỏ đuôi (9/24) Đỏ thân (8/24), Hơi đỏ thân (2/24) Đỏ đuôi (3/24) Đốm trắng (1/24) Đỏ thân (8/21.) Hơi đỏ(2/21) Đỏ đuôi (3/21) Đỏ thân (8/21) Hơi đỏ (2/21) Đỏ đuôi (3/21 Hởi đỏ thân (3/21) Đỏ thân (5/21) Đỏ đuôi (1/21) Chết (3/21) Đỏ thân (2/18) Hơi đỏ (1/18) Hơi đỏ thân (2/15) Đỏ thân (2/15), Đốm trắng (14/15) Chết (1/15) Hơi đỏ thân (2/14) Đỏ thân (3/14) Đốm trắng (13/14) Hơi đỏ thân (3/11) Đỏ thân (2/11) Đốm trắng (8/11) Chết (1/11) Đỏ thân (1/10) Đốm trắng (7/10) Hơi đỏ (1/8) Đốm trắng (6/8) Chết (1/8) Hơi đỏ(1/7) Đốm trắng (5/7) 45 85 90 94 100 106 120giờ Chết (2/9) Màu bình thƣờng Đốm trắng (4/7) Màu bình thƣờng Đốm trắng (4/7) Đỏ thân (2/5) Đốm trắng (1/5) Chết (1/5) Đỏ thân (2/4) Đốm trắng (1/4) Hơi đỏ thân (2/7) Đốm trắng (2/7) Chết (3/7) Đốm trắng (2/3) Màu bình thƣờng Hơi đỏ thân (1/3) Đốm trắng (2/3) Đỏ thân (2/4) Đốm trắng (1/4) Chết (1/4) Đỏ thân, đốm trắng (1/2) Đốm trắng (1/1) Màu bình thƣờng Đỏ thân, đốm trắng (1/2) Đã chết hết trƣớc * )Tơm chết có dấu hiệu đốm trắng Đỏ thân (2/6) Đốm trắng (3/6) Đỏ thân (2/6) Đốm trắng (3/6) Đốm trắng (2/6) Chết (1/6) Đốm trắng (2/3) Đốm trắng (2/3 ) Đốm trắng (1/1) Hơi đỏ thân(1/1) 46 Thí nghiệm gây nhiễm với liều cao (104SID50) 12 -1,3/1,6-Glucan Màu bình thƣờng Vitamin C Màu bình thƣờng Đối chứng Màu bình thƣờng 18 21 Màu bình thƣờng Đỏ thân(2/27) 24 Hơi đỏ thân (3/27) 27 Hơi đỏ thân (3/24) 31 Hơi đỏ thân (3/24) đỏ thân(1/27) Hơi đỏ thân (3/27) Đỏ thân (4/27) Hơi đỏ thân (7/27) Đỏ thân (1/27) Hơi đỏ thân (7/24) Đỏ thân (1/24) Đỏ thân (1/24) 38 Hơi đỏ thân (3/21) 41 Hơi đỏ thân (3/21) Đốm trắng (3/21) đỏ thân (2/27) Hơi đỏ thân (4/27) Đỏ thân (3/27) Hơi đỏ (3/27) Đỏ thân (1/27) Hơi đỏ thân (5/24) Đỏ thân (1/24) Đỏ thân (1/24) Đốm trắng (2/24) Chết (2/21) Hơi đỏ thân (5/19) Hơi đỏ thân (6/19) Đốm trắng (14/19) 44 Hơi đỏ thân (3/21) Đốm trắng (6/21) 50 Đỏ thân (1/18) Đốm trắng(8/18) 53 Hơi đỏ thân (2/18) Đỏ thân (1/18) Đốm trắng (8/18) 57 Đỏ thân (1/18) Đốm trắng (8/18) 61 Đỏ thân (2/15), Hơi đỏ thân (6/15) Đốm trắng (8/15) 64 Hơi đỏ (6/15) Đốm trắng (8/15) 69 Hơi đỏ thân (4/15) Đỏ thân (2/15) Đốm trắng (8/15) Chết (2/15) Hơi đỏ thân (1/10) Đỏ thân (2/10) Đốm trắng (5/10) Hơi đỏ thân (2/10) 75 80 Hơi đỏ thân (5/21) Đỏ thân(1/21) Hơi đỏ thân (5/21) Đỏ thân (1/21) Đốm trắng (3/21) Hơi đỏ thân (4/21) Đỏ thân (1/21) Đốm trắng (4/21) Hơi đỏ thân (3/18) Đỏ thân (2/18) Đốm trắng (12/18) Hơi đỏ thân (3/18) Đỏ thân (1/18) Đốm trắng (12/18) Chết (1/18) Hơi đỏ thân (3/17) Đỏ thân (1/17) Đốm trắng(12/17) Chết (1/14) Hơi đỏ thân (3/13) Đỏ thân (1/13) Đốm trắng(9/13) Hơi đỏ thân (3/13) Đỏ thân (1/13) Đốm trắng (9/13) Hơi đỏ thân (3/13) Đỏ thân (1/13) Đốm trắng (9/13) Chết (1/13) Hơi đỏ(3/9), Đỏ (1/9) Đốm trắng (5/9) Hơi đỏ(4/9) Chết (1/19) Hơi đỏ thân (6/18) Đốm trắng (13/18) Chết(1/15) Hơi đỏ thân (4/14) Đốm trắng (11/14) Hơi đỏ thân (4/14) Đốm trắng (11/14) Hơi đỏ thân (4/14) Đốm trắng (11/14) Hơi đỏ (3/12) Đốm trắng (10/12) Hơi đỏ (3/12) Đốm trắng (10/12) Chết (1/12) Đỏ thân (3/11) Đốm trắng (9/11) Hơi đỏ thân (3/9) Đốm trắng (7/9) Hơi đỏ thân (4/9) 47 Đỏ thân (2/10) Đốm trắng (5/10) Hơi đỏ thân (3/9) Đốm trắng (2/9) Đỏ thân (1/9) Đốm trắng (5/9) Hơi đỏ (2/7) Đốm trắng (2/7) Hơi đỏ thân (1/9) Đốm trắng(3/9) Hơi đỏ thân (3/7) Đỏ thân (1/7) Đốm trắng (2/7) 100 Đỏ thân (1/6) Đốm trắng (3/6) Hơi đỏ(2/5) Đốm trắng (4/5) Hơi đỏ thân (1/6) Đốm trắng (4/6) Chết (1/6) Hơi đỏ(2/4) Đốm trắng (3/4) 107 Hơi đỏ(1/6) Đốm trắng (3/6) Hơi đỏ thân (2/5) Đốm trắng (4/5) Hơi đỏ thân (2/4) Đốm trắng (3/4) 120 Hơi đỏ thân (1/3), Đỏ thân (1/3/) Đốm trắng (3/3) Chết (1/2) Hơi đỏ thân (1/1) Đốm trắng (1/1) Hơi đỏ thân (2/3) Đốm trắng (2/3) 86 92 * )Tơm chết có dấu hiệu đốm trắng Đốm trắng (7/9) Hơi đỏ (1/7), Đỏ (1/7) Đốm trắng (5/7) Hấp hối (1/7) 48 PHỤ LỤC KẾT QUẢ ĐỌC MẪU IHC Thí nghiệm gây nhiễm WSSV với liều thấp (101,5SID50/ml) β-1,3/1,6-glucan Vitamin C Đối chứng TB TB TLN(% TB TB TLN(% TB TB TLN(% Thời gian + ) + ) + ) 0,00 0,00 0,00 0h 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 12h 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 21 595 3,53 414 0,24 400 0,00 24h 256 0,78 300 0,33 368 0,54 400 1,50 370 0,54 270 1,85 24 495 4,85 21 376 5,59 16 370 4,32 36h 20 489 4,09 452 1,99 23 400 5,75 27 325 8,31 15 527 2,85 32 500 6,40 18 264 6,82 15 495 3,03 23 371 6,20 48h 10 250 4,00 24 555 4,32 56 489 11,45 10 360 2,78 24 524 4,58 34 585 5,81 31 293 10,58 32 415 7,71 26 434 5,99 60h 37 384 9,64 23 369 6,23 12 200 6,00 20 295 6,78 23 454 5,07 22 250 8,80 19 647 2,94 15 635 2,36 37 150 24,67 72h 27 343 7,87 715 1,26 19 400 4,75 14 249 5,62 16 523 3,06 20 390 5,13 63 196 32,14 16 698 2,29 21 260 8,08 84h 11 173 6,36 13 355 3,66 20 390 5,13 363 2,20 17 527 3,23 22 450 4,89 405 0,99 15 404 3,71 18 400 4,50 96h 580 0,69 13 220 5,91 11 210 5,24 291 3,09 22 476 4,62 15 300 5,00 12 258 4,65 29 538 5,39 16 340 4,71 108h 400 0,75 39 313 12,46 12 264 4,55 415 1,45 22 342 6,43 14 422 3,32 360 1,11 27 396 6,82 35 530 6,60 120h 385 1,82 12 420 2,86 29 274 10,58 463 0,65 44 500 8,80 308 2,92 Trung bình 4,12 3,50 4,94 - TB+: tế bào mang nhiễm WSSV - TB-: Tế bào mang không nhiễm WSSV - TLN: Tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) 49 Thí nghiệm gây nhiễm WSSV với liều cao (104SID50) β-1,3/1,6-glucan Thời gian 0h 12h 24h 36h 48h 60h 72h 84h 96h 108h 120h Đối chứng Vitamin C TB+ TB- TLN(%) TB+ TB- TLN(%) TB+ 0 0 11 11 15 10 37 33 27 18 12 17 11 13 44 23 10 11 0,00 0,00 0,00 0,18 0,00 0,00 3,99 0,79 0,94 2,42 2,39 2,72 1,33 8,85 9,43 5,51 2,70 7,11 1,17 2,76 3,31 5,06 2,31 1,80 3,44 13,17 1,81 6,55 4,00 2,75 1,03 1,41 1,27 0,00 0,00 0,00 0,23 0,18 0,00 1,39 2,58 3,57 3,35 5,18 4,25 3,86 4,41 10,14 9,97 5,36 4,14 2,09 2,54 2,29 2,32 3,50 4,92 10,63 4,63 3,42 9,69 1,75 2,88 4,68 4,47 3,41 552 276 380 640 455 628 368 450 418 350 490 222 253 341 326 363 336 477 501 378 334 441 351 250 400 390 355 472 0 1 14 25 13 22 19 15 45 39 27 22 14 11 10 12 16 17 13 13 19 10 25 14 11 431 541 432 543 700 388 425 212 492 340 444 391 504 532 671 433 350 431 343 325 160 281 380 196 228 347 534 313 323 Trung 3,04 bình - TB+: tế bào mang nhiễm WSSV - TB-: Tế bào mang không nhiễm WSSV - TLN: Tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) 3,69 0 0 9 20 19 25 31 38 15 20 18 12 16 70 13 16 14 16 11 22 12 24 18 TB- TLN(%) 754 425 400 360 233 393 480 525 440 235 260 520 290 310 310 450 250 375 125 240 360 390 155 220 260 357 446 523 0,00 0,00 0,00 0,00 0,13 0,00 1,18 2,25 2,50 0,86 5,09 3,96 4,76 7,05 16,17 5,77 3,85 6,21 3,87 5,16 15,56 5,20 4,27 11,20 6,67 3,06 5,64 7,74 10,91 1,92 5,04 1,12 1,15 4,49 50 PHỤ LỤC Analysis of Variance for LIEUTHAP.TLN - Type III Sums of Squares Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level MAIN EFFECTS A:LIEUTHAP.TG 672.23599 10 67.223599 4.564 0001 B:LIEUTHAP.Pthuc 34.88619 17.443094 1.184 3124 INTERACTIONS AB 454.34352 20 22.717176 1.542 0966 RESIDUAL 972.02306 66 14.727622 TOTAL (CORRECTED) 2133.4888 98 missing values have been excluded All F-ratios are based on the residual mean square error Multiple range analysis for LIEUTHAP.TLN by LIEUTHAP.Pthuc Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups 33 3.4953117 X 33 4.1205538 X 33 4.9448320 X contrast difference limits - 0.62524 1.88671 - -0.82428 1.88671 - -1.44952 1.88671 * denotes a statistically significant difference Analysis of Variance for LIEUCAO.TLN - Type III Sums of Squares Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level MAIN EFFECTS A:LIEUCAO.TG 501.42635 10 50.142635 6.327 0000 B:LIEUCAO.Pthuc 35.13158 17.565788 2.217 1170 INTERACTIONS AB 111.56945 20 5.5784726 704 8080 RESIDUAL 523.03884 66 7.9248309 TOTAL (CORRECTED) 1171.1662 98 missing values have been excluded All F-ratios are based on the residual mean square error 51 Multiple range analysis for LIEUCAO.TLN by LIEUCAO.Pthuc Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups 33 3.0362019 X 33 3.6915225 XX 33 4.4929352 X contrast difference limits - -0.65532 1.38400 - -1.45673 1.38400 * - -0.80141 1.38400 * denotes a statistically significant difference Analysis of Variance for GLCAN.TLN - Type III Sums of Squares Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level MAIN EFFECTS A:GLCAN.TG 435.65127 10 43.565127 2.623 0135 B:GLCAN.LieuTiem 19.40102 19.401016 1.168 2857 INTERACTIONS AB 243.02687 10 24.302687 1.463 1857 RESIDUAL 730.78846 44 16.608829 TOTAL (CORRECTED) 1428.8676 65 missing values have been excluded All F-ratios are based on the residual mean square error Multiple range analysis for GLCAN.TLN by GLCAN.LieuTiem Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups 33 3.0362019 X 33 4.1205538 X contrast difference limits - 1.08435 2.02247 * denotes a statistically significant difference Analysis of Variance for VITAMINC.TLN - Type III Sums of Squares Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level MAIN EFFECTS A:VITAMINC.TG 336.69225 10 33.669225 8.104 0000 B:VITAMINC.lieutiem 63523 635228 153 7018 INTERACTIONS AB 40.236593 10 4.0236593 968 4837 RESIDUAL 182.80989 44 4.1547702 TOTAL (CORRECTED) 560.37396 65 missing values have been excluded All F-ratios are based on the residual mean square error 52 Multiple range analysis for VITAMINC.TLN by VITAMINC.lieutiem Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups 33 3.4953117 X 33 3.6915225 X contrast difference limits - -0.19621 1.01155 * denotes a statistically significant difference Analysis of Variance for DOICHUNG.TLN - Type III Sums of Squares Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level MAIN EFFECTS A:DOICHUNG.TG 614.87793 10 61.487793 4.653 0002 B:DOICHUNG.Lieutiem 3.36948 3.369477 255 6215 INTERACTIONS AB 69.090386 10 6.9090386 523 8647 RESIDUAL 581.46356 44 13.215081 TOTAL (CORRECTED) 1268.8014 65 missing values have been excluded All F-ratios are based on the residual mean square error Multiple range analysis for DOICHUNG.TLN by DOICHUNG.Lieutiem Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups 33 4.4929352 X 33 4.9448320 X contrast difference limits - 0.45190 1.80404 - * denotes a statistically significant difference ... β-1,3/1,6-GLUCAN VÀ VITAMIN C LÊN ĐỘ MẪN C? ??M ĐỐI VỚI VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (White spot syndrome virus- WSSV) C? ??A TÔM SÚ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: C? ?NG NGHỆ SINH H? ?C Giáo viên... lệ nghiệm th? ?c đối chứng với β-1,3/1,6-glucan C? ?c v dấu hiệu lâm sàng bệnh đốm trắng xuất sớm nghiệm th? ?c đối chứng so với nghiệm th? ?c lại β-1,3/1,6-glucan thể rõ t? ?c dụng làm giảm độ mẫn c? ??m với. .. thí nghiệm gây nhiễm chuẩn cho tôm với dịch virus WSSV-VN chuẩn độ (105,2SID50/ml) Tiến hành thí nghiệm gây nhiễm chuẩn cho tôm với nồng độ dịch virus WSSV-VN đƣ? ?c chuẩn độ x? ?c định liều gây nhiễm