Với những đặc điểm nêu trên, mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn có nhiều ứng dụng quan trọng:
Đánh giá sự khác nhau về độ mẫn cảm của vật chủ ở các giai đoạn sống khác nhau hay giữa các loài có quan hệ gần gũi với cùng một tác nhân gây bệnh (Plumb và Zilberg, 1999). Cụ thể ở tôm, có sự khác biệt về tính mẫn cảm với WSSV ở các giai đoạn sống khác nhau (Yoganandhan và ctv, 2003) hay giữa các loài tôm (Lightner và ctv, 1998).
Độc tính hay khả năng gây bệnh của mầm bệnh là một đặc tính có thể đo lƣờng đƣợc (Shapiro-Ilan và ctv, 2005). Do đó ứng dụng mô hình cảm nhiễm chuẩn, ta có thể so sánh độc lực của các chủng WSSV khác nhau.
Mô hình cảm nhiễm chuẩn còn giúp ta đánh giá hiệu quả của các phƣơng thức quản lý sức khỏe tôm nhƣ dùng các chất kích thích miễn dịch, các chất diệt virus (antivirals), vaccine… nhằm mục đích giảm tác động của bệnh đốm trắng.
Nhằm hỗ trợ trong việc thiết lập các phƣơng thức quản lý mới trong phòng ngừa bệnh đốm trắng có thể áp dụng trong thực tiễn, các nghiên cứu về quá trình phát sinh bệnh của WSSV có vai trò rất quan trọng. Bonilla và ctv (2005) đã sử dụng mô hình cảm nhiễm chuẩn để nghiên cứu quá trình phát sinh bệnh của WSSV trên
Litopenaeus vannamei. Tôm đƣợc chủng WSSV qua đƣờng miệng với liều thấp (101,5SID50) và liều cao (104SID50). Ở mỗi liều cảm nhiễm, mẫu tôm đƣợc thu ở 0, 6, 12, 18, 24, 36, 48 và 60 giờ sau gây nhiễm. Vị trí của các tế bào bị nhiễm WSSV trên mô đƣợc xác định bằng kỹ thuật Hóa mô miễn dịch (immunohistochemistry – IHC) và trong huyết tƣơng bằng kỹ thuật Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (Indirect
immunofluorescence – IIF). Các tác giả đã rút ra kết luận rằng ruột giữa và mang là những vị trí đầu tiên cho sự tái bản của WSSV. Sự lan truyền mang tính hệ thống của WSSV diễn ra chủ yếu trên các tế bào tự do và mang, ruột trƣớc, mô trung gian (integument), tuyến anten là các cơ quan đích chính của virus này.
2.5 Sơ lƣợc về hoá mô miễn dịch 2.5.1 Nguyên lý
Theo IHC world (2005) hoá mô miễn dịch là phƣơng pháp định vị kháng nguyên trên mặt cắt của mô bằng cách sử dụng kháng thể đã đƣợc đánh dấu nhƣ là thuốc thử đặc hiệu. Phƣơng pháp này dựa trên cơ sở tƣơng tác đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể có thể nhìn thấy qua các chất nhuộm hiện màu là enzyme khi chúng tác dụng với cơ chất.
Nghiên cứu ứng dụng kháng thể đơn dòng để phát hiện virus WSSV trên tôm đã đƣợc phát triển bởi Poulos và ctv (2001). Chaivisuchangkura và ctv (2004), phát triển ứng dụng kháng thể đơn dòng kháng protein envelop VP28 để phát hiện virus WSSV trên tôm nhiễm bệnh.
2.5.2 Các phƣơng pháp nhuộm
Có nhiều phƣơng pháp hoá mô miễn dịch có thể dùng để định vị kháng nguyên. Việc lựa chọn phƣơng pháp thích hợp dựa trên các thông số nhƣ loại mẫu vật và độ nhạy yêu cầu (IHC world, 2005). Theo Boenisch và ctv (2002), có 5 phƣơng pháp nhuộm có thể đƣợc sử dung:
A. Trực tiếp (direct method): Đây là kỹ thuật cổ điển nhất. Quá trình thực hiện nhƣ sau: Một kháng thể sơ cấp đƣợc đánh dấu enzyme phản ứng với kháng nguyên trên mô, sau đó sử dụng cơ chất tạo màu để phát hiện phản ứng. Phƣơng pháp này tiết kiệm đƣợc thời gian nhƣng tín hiệu thu đƣợc rất ít, không dủ nhạy để đáp ứng nhu cầu ngày nay.
B. Gián tiếp hai bước (two-step indirect method): Đầu tiên cho một kháng thể sơ cấp (thƣờng là đơn dòng) kết hợp với kháng nguyên, sau đó bổ sung một kháng thể thứ cấp (thƣờng là đa dòng) đánh dấu enzyme kháng lại kháng thể sơ cấp (bây giờ là kháng nguyên), và cuối cùng bổ sung cơ chất tạo màu. Phƣơng pháp này linh hoạt và nhạy hơn phƣơng pháp nhuộm trực tiếp..
C. Gián tiếp ba bước (three-step indirect method): Từ phƣơng pháp B, bổ sung thêm một kháng thể thứ cấp 2 kháng lại kháng thể thứ cấp 1. Cả hai kháng thể thứ cấp này phải đƣợc đánh dấu với cùng enzyme. Việc bổ sung thêm một lớp kháng thể thứ 3 là để khuyếch đại tín hiệu. Phƣơng pháp này đặc biệt hữu dụng khi nhuộm những kháng nguyên có ít epitope.
D.Phương pháp phức hợp miễn dịch enzyme tan: Tuỳ theo phúc hợp miễn dịch enzyme, ta có các phƣơng pháp khác nhau.Ví dụ: Phƣơng pháp PAP (peroxidase anti peroxidase) sử dụng phức hợp peroxidase – kháng peroxidase. Trƣớc tiên cho kháng thể sơ cấp và phức hợp enzyme – kháng thể kháng enzyme phản ứng với kháng nguyên, sau đó bổ sung kháng thể thứ cấp với một lƣợng thừa để một vị trí Fab sẽ gắn với kháng thể sơ cấp, vị trí còn lại gắn với kháng thể trong phức hợp miễn dịch của enzyme. Kháng thể sơ cấp và kháng thể của enzyme phải tạo ra từ cùng một loài. Kháng thể thứ cấp phải trực tiếp kháng lại globulin miễn dịch của loài đó.
E.Phương pháp (strept)avidin-biotin: Phƣơng pháp nhuộm này dựa trên ái lực lớn giữa (strept)avidin (Streptomyces avidinii ) và avidin (trứng gà) với biotin với độ nhạy và khả năng khuyếch đại rất cao. Thành phần cơ bản gồm kháng thể sơ cấp kháng kháng nguyên, kháng thể thứ cấp có gắn biotin kháng kháng thể sơ cấp, phức hợp enzyme-(strept)avidin-biotin (kỹ thuật avidin-biotin complex – ABC) hay streptavidin có đánh dấu enzyme (kỹ thuật labelled streptavidin-biotin – LSAB), và cuối cùng là dung dịch cơ chất. Enzyme đánh dấu thƣờng đƣợc sử dụng nhất là horseradish peroxidase và alkaline phosphatase.
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm
A. Thời gian tiến hành nghiên cứu: 2/2006 – 8/2006
B. Địa điểm:
Trại thực nghiệm nuôi thuỷ sản Thủ Đức, 658 Kha vạn cân, phƣờng Linh Đông, quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh.
Phòng Mô Học – Trung tâm Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trƣờng và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Khu Vực Nam Bộ – Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II.
3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Vật liệu sinh học 3.2.1 Vật liệu sinh học
Tôm sú 45 ngày tuổi.
Nƣớc biển đƣợc xử lý các bƣớc: cơ học – hoá học - trung hoà. Dòng virus WSSV-VN đã đƣợc chuẩn độ:105,2SID50/ml.
Vitamine C dạng muối polyphosphate - sản phẩm C Vits của công ty Svaks, Ấn Độ.
β-1,3/1,6-glucan - sản phẩm PIOMOS của công ty PIOTECH, Mỹ. Thức ăn viên C.P 9003-P sản xuất tại Công ty TNHH Chăn nuôi C.P. Việt Nam.
3.2.2 Dụng cụ và hoá chất 3.2.2.1 Dụng cụ
a) Dụng cụ cho quản lý bể nuôi tôm Bể composite 1 m3.
Máy bơm, vợt, máy đo thủy hoá… b) Dụng cụ gây nhiễm WSSV cho tôm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kim Isulin 0,5 ml, cỡ đầu kim 26.
Micropipet 100 µl, 1000 µl, eppendoff 2 ml, găng tay, bông gòn tiệt trùng.
Bể kính 126 lit.
Vợt và thức ăn tôm lớn. c) Dụng cụ cho IHC
Panh, dao, kéo vô trùng.
Máy xử lý mẫu tự động, máy cắt microtome, tủ ấm 37oC, bàn làm lạnh mẫu, nồi nƣớc ấm, bình rót paraffin electrothermal, kính hiển vi quang học.
3.2.2.2 Hoá chất
a) Hóa chất cho quản lý bể nuôi tôm
Chlorine, Na2S2O3 để xử lý nƣớc biển.
Hóa chất dùng phân tích mẫu nƣớc: NaOH, KI, KMnO4, Na2S2O3, H2SO4, hồ tinh bột,...
b) Hóa chất cho gây nhiễm WSSV cho tôm
Dung dịch đệm BPS 10X (1000 ml): + Na2HPO4: 96,72 g + KH2PO4: 20,005 g + KCl: 19,98 g Cồn 70%
c) Hóa chất cho IHC:
Cồn 50, 70, 95 và 99,6%.
Parafin, nƣớc cất khử ion, Tris–NaCl, Tris–HCl, xylene.
Thuốc nhuộm Hematoxylin, keo dán Baume Canada, chloroform. Dung dịch Davidson có thành phần nhƣ sau:
+ Cồn 95%: 330 ml + Formalin: 220 ml + Acid acetic glacial: 115 ml + Nƣớc cất: 335 ml Hoá chất là lam dƣơng:
+ Aceton: 250 ml + (3 – amino propyl) triethoxysaline: 5 ml
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1 Phƣơng pháp pha loãng dịch huyền phù virus
Từ dịch huyền phù virus ban đầu (10oC) hút 100 µl cho vào eppendorf có chứa 900 µl dung dịch BPS 1X. Ta đƣợc độ pha loãng 10-1.
Hút 100 µl từ độ pha loãng 10-1 cho vào eppendorf chứa 900 µl dung dịch BPS 1X. Ta đƣợc độ pha loãng 10-2.
Tiếp tục làm nhƣ trên, ta sẽ đƣợc độ pha loãng mong muốn.
3.3.2 Phƣơng pháp gây nhiễm virus WSSV trên tôm sú
Mỗi tôm đƣợc tiêm 100 µl dịch virus WSSV-VN đã chuẩn độ vào giữa mặt bên của đốt thứ 2 hoặc 3.
3.3.3 Phƣơng pháp thu mẫu cho IHC
Cắt đầu tôm, tách vỏ, lấy phần mang và gan tụy, để vào mảnh vải mùng nhỏ, cho vào cassette, đóng nắp và ngâm trong dung dịch Davidson trong thời gian từ 24 – 48 giờ. Tỷ lệ mẫu : Davidson = 1 : 10
3.3.4 Phƣơng pháp xác định WSSV trên tôm sú bằng kỹ thuật IHC
Để đáp ứng mục tiêu là chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng trên tôm sú, trong điều kiện của phòng thí nghiệm, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp ABC (avidin-biotin complex) theo protocol của Đại học Ghent (Bỉ). Trong đó, ta tiến hành nhộm mẫu với kháng thể sơ cấp 8B7 của chuột kháng protein WSSV VP28 (WSSV - 8B7 mAb) (4oC) (công ty Diagxotics), kháng thể thứ cấp gắn biotin, phức hợp streptavidin-biotinylated horseradish peroxidase và cơ chất là 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB). Đọc kết quả trên kính hiển vi quang học ở vật kính 10X, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
40X, 100X. Tế bào nhiễm WSSV có thể vùi dạng Crowdry A đặc trƣng, nhân trƣơng to và bắt màu nâu. Quy trình thực hiện:
3.3.5 Phƣơng pháp xác định tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV trên tôm thí nghiệm
Đọc mẫu nhuộm IHC dƣới kính hiển vi quang học (vật kính 40X). Chọn vùng mô có nhiều tế bào nhiễm WSSV nhất, đếm số tế bào nhiễm và tế bào không nhiễm. Từ đó tính tỷ lệ tế bào nhiễm TLN (%):
3.3.6 Phƣơng pháp đo một số yếu tố môi trƣờng nƣớc
Đo nhiệt độ bằng nhiệt kế bách phân. Đo NH3: đo bằng bộ test nhỏ giọt Vera. Đo pH: đo bằng pH kế Scan 2.
Xác định Oxy hoà tan (DO) theo phƣơng pháp chuẩn độ Winkler trong thí nghiệm.
3.3.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số tế bào nhiễm TLN (%) =
Số tế bào không nhiễm X100 Ủ mẫu trong 24 – 72 giờ
giờ . Nhận mẫu Cố định mẫu Xử lý mẫu Đúc mẫu 12,5 giờ Cắt mẫu Làm lạnh
Chuyển mẫu lên lam
Ủ mẫu ở 40oC đến khi mẫu dính chặt vào lam
Nhuộm và đọc kết quả dƣới kínhhiển vi
Xử lý số liệu bằng phần mềm thống kê Stagraphics 7.0.
3.4 Bố trí thí nghiệm:
3.4.1Chuẩn bị vật liệu cho thí nghiệm gây nhiễm chuẩn
Bố trí 3 bể composite 1 m3
Vì số lƣợng tôm cần cho gây nhiễm chuẩn 66 con/nghiệm thức nên chúng tôi bố trí: 100 con tôm/bể.
Phƣơng thức Bể Thức ăn viên + chất kích thích miễn dịch IM1 100 con IM2 100 con
Thức ăn viên C 100 con
Bảng 3.1 Bố trí nuôi tôm sú với các phƣơng thức quản lý khác nhau IM1: Thức ăn viên trộn vitamin C với lƣợng 5 g/kg thức ăn.
IM2: Thức ăn viên trộn -1,3/1,6-glucan với lƣợng 10 g/kg thức ăn.
Cách trộn: cân hợp chất, trộn trong dầu mực và áo bên ngoài viên thức ăn, để khô 60 phút rồi cho ăn.
Tôm ở mỗi bể đƣợc cho ăn 3% trọng lƣợng cơ thể /ngày, chia làm 5lần: 7, 11, 15, 19 và 23 giờ.
Chỉ tiêu đƣợc duy trì ổn định:
+ Nhiệt độ: 27oC + Độ mặn: 20o/oo + Độ kiềm tổng: 120 mg/L Chỉ tiêu môi trƣờng nƣớc đƣợc theo dõi:
+ Trong ngày: pH, oxy hòa tan (DO) ở 8 giờ và 14 giờ. + Trong tuần: Amoniac ở 8 giờ ngày đầu tuần.
Tôm đƣợc nuôi và cho ăn 15 ngày và chuyển sang bố trí thí nghiệm gây nhiễm chuẩn WSSV. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.4.2Bố trí thí nghiệm gây nhiễm chuẩn cho tôm với dịch virus WSSV-VN đã chuẩn độ (105,2SID50/ml) chuẩn độ (105,2SID50/ml)
Tiến hành 2 thí nghiệm gây nhiễm chuẩn cho tôm với 2 nồng độ của dịch virus WSSV-VN đã đƣợc chuẩn độ xác định liều gây nhiễm 50% tôm thí nghiệm (105,32SID50/ml) là: liều thấp (101.5SID50) và liều cao (104SID50).
Mỗi thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design, CRD), 3 nghiệm thức (β-1,3/1,6-glucan, vitamin C và đối chứng) Mỗi nghiệm thức bố trí 11 bể gây nhiễm cho 11 đợt thu mẫu + 1 bể đối chứng tiêm PBS. Số tôm ở mỗi bể là 3 con cho 3 lần lặp lại.
Thời gian thu mẫu tôm:
Bảng 3.2 Các thời điểm thu mẫu ở mỗi đợt thí nghiệm.
0 giờ 12 giờ 24 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ 72 giờ 84 giờ 96 giờ 108 giờ 120 giờ
Ghi chú: Thu ở 0 giờ là để xem hiệu quả tiêm.
Các nghiệm thức đƣợc cho ăn ngày 3 lần: 8, 13 và 18 giờ. Chỉ tiêu đƣợc duy trì ổn định:
+ Nhiệt độ: 27oC + Độ mặn: 20o/oo + Độ kiềm tổng: 120 mg/L
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Đánh giá nguồn vật liệu phục vụ cho thí nghiệm gây nhiễm chuẩn
Nhìn chung, trong suốt 15 ngày nuôi, qua các chỉ tiêu theo dõi, nhận thấy điều kiện môi trƣờng nuôi là phù hợp cho tôm nuôi ở cả 3 phƣơng thức quản lý.
Bảng 4.1 Kết quả theo dõi các chỉ tiêu môi trƣờng trong quá trình nuôi (Phụ lục 1)
Tốc độ tăng trọng của tôm:
Bảng 4.2 Tốc độ tăng trọng trung bình của tôm sau 15 ngày nuôi
Phƣơng thức Tăng trọng trung bình (g/ngày)
β-1,3/1,6-glucan 0,078
Vitamin C 0,138
Đối chứng 0,094
Trong quá trình nuôi, tôm ở 3 phƣơng thức quản lý có biểu hiện bình thƣờng. Tôm chết trong quá trình nuôi là do ăn nhau khi ở giai đọan lột xác. Đến cuối đợt, số tôm còn lại ở mỗi bể:
-1,3/1,6-glucan: 98 con (98% số tôm ban đầu).
Vitamin C: 98 con (98% số tôm ban đầu).
Đối chứng: 95 con (95% số tôm đầu)
Nhìn chung đã tạo đƣợc nguồn tôm phù hợp cho các thí nghiệm gây nhiễm chuẩn tiếp theo.
Hình 4.1 Bể nuôi tôm với hệ thống lọc tuần hoàn
Phƣơng thức Khoảng dao động pH Nhiệt độ Amoniac Oxy hòa tan β-1,3/1,6 -glucan 7,35 – 7,72
28oC <1mg/L > 6 mg/L
Vitamin C 7,37 – 7,69
4.2. Khảo sát ảnh hƣởng của các phƣơng thức quản lý khác nhau lên độ mẫn cảm của tôm sú đối với WSSV của tôm sú đối với WSSV
4.2.1. Kết quả ở thí nghiệm gây nhiễm WSSV trên tôm sú với liều thấp (101,5SID50) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả theo dõi thực nghiệm cho thấy, tôm ở nghiệm thức đối chứng có biểu hiện bất thƣờng xuất hiện sớm nhất sau gây nhiễm WSSV so với 2 nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan và vitamin C. Cụ thể, tôm ở nghiệm thức này có dấu hiệu đỏ đuôi ở 20 giờ, đỏ thân ở 24 giờ sau gây nhiễm, trong khi hai nghiệm thức còn lại dấu hiệu đỏ thân xuất hiện trễ hơn (Bảng 4.3). Dấu hiệu điển hình của bệnh đốm trắng xuất hiện sớm nhất là ở nghiệm thức đối chứng (33 giờ). Tôm bị chết sớm nhất là ở nghiệm thức đối chứng (49 giờ sau gây nhiễm) và trễ nhất là ở nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan (83 giờ sau gây nhiễm). Kết thúc thí nghiệm gây nhiễm với liều thấp, số tôm chết đƣợc ghi nhận ở cả 3 nghiệm thức đối chứng, vitamin C và β-1,3/1,6-glucan lần lƣợt là 7, 6 và 5 con đều cho kết quả IHC dƣơng tính với WSSV. Tôm đối chứng tiêm PBS vẫn khỏe đến cuối đợt thí nghiệm.
Bảng 4.3 Kết quả theo dõi thực nghiệm dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng sau khi gây nhiễm liều thấp
Nghiệm thức
Thời điểm xuất hiện đỏ thân (giờ)
Thời điểm xuất hiện đốm trắng (giờ)
Thời điểm tôm bị chết (giờ) Tổng số tôm chết β-1,3/1,6-glucan 27 44 83 5 Vitamin C 33 49 68 6 Đối chứng 24 33 49 7
Kết quả phân tích tại phòng thí nghiệm về tỷ lệ và cƣờng độ cảm nhiễm của WSSV bằng IHC cho thấy, ở cả ba nghiệm thức tôm đã bị nhiễm WSSV ở thời điểm 24 giờ sau gây nhiễm. Ở thời điểm 24 giờ đã quan sát thấy tế bào tôm bị nhiễm WSSV đƣợc thu mẫu từ tôm ở cả 3 nghiệm thức (Hình 4.2).
Hình 4.2 Hình chụp mẫu mô mang của tôm đƣợc nhuộm IHC (vật kính 40X) thời điểm 24 giờ sau gây nhiễm WSSV
A: Nghiệm thức -1,3/1,6-glucan, B: Nghiệm thức vitamin C, D: Đối chứng ( chỉ tế bào nhiễm WSSV)
Kết quả ghi nhận về cƣờng độ nhiễm WSSV bằng IHC, đƣợc đánh giá thông qua tỷ lệ (%) tế bào nhiễm trên tổng số tế bào không nhiễm trong một thị trƣờng tại vùng có mật độ tế bào nhiễm WSSV cao nhất của mô mang, cho thấy tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV trên lô đối chứng là cao nhất (Bảng 4.4), tỷ lệ tế bào nhiễm trung bình trên vùng khảo sát là 4,94%, kế đến là nghiệm thức cho ăn thức ăn trộn β-1,3/1,6-