Ảnh hưởng của glucan và vitamin c đến độ mẫn cảm với virut gây hội chứng đốm trắng của tôm sú

Ảnh hưởng của glucan và vitamin c đến độ mẫn cảm với virut gây hội chứng đốm trắng của tôm sú

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** ĐẶNG TRẦN QUÂN ỨNG DỤNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA β-1,3/1,6-GLUCAN VÀ VITAMIN C LÊN ĐỘ MẪN CẢM ĐỐI VỚI VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (White spot syndrome virus-WSSV) CỦA TÔM SÚ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** ỨNG DỤNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA β-1,3/1,6-GLUCAN VÀ VITAMIN C LÊN ĐỘ MẪN CẢM ĐỐI VỚI VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (White spot syndrome virus-WSSV) CỦA TÔM SÚ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. NGUYỄN VĂN HẢO ĐẶNG TRẦN QUÂN ThS. NGÔ XUÂN TUYẾN KHÓA: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006- MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  APPLICATION OF STANDARDIZIED CHALLENGE MODEL TO TEST THE EFFICACY OF β-1,3/1,6-GLUCAN AND VITAMIN C ON THE SUCCEPTIBILITY OF BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon) TO WHITE SPOT SYNDROME VIRUS (WSSV) GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student Dr. NGUYEN VAN HAO DANG TRAN QUAN MSc. NGO XUAN TUYEN TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 iv LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cám ơn quý thầy cô trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã truyền đạt cho tôi kiến thức trong những năm học vừa qua. Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp này, tôi đã nhận sự giúp rất nhiều từ các thầy cô và các anh chị công tác ở Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. Trong đó tôi xin chân thành cảm ơn: - TS. Nguyễn Văn Hảo đã tận tình giải đáp những vƣớng mắc trong quá trình thực tập, giúp tôi hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp. - ThS. Ngô Xuân Tuyến là ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn về phƣơng pháp nghiên cứu, tài liệu khoa học, giúp tôi hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp. - Kỹ sƣ Phạm Thị Tuyết Anh đã tận tình hƣớng dẫn tôi về mặt thao tác trong phòng thí nghiệm, giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực tập. - Các anh chị ở phòng Mô, các anh chị ở trại thực nghiệm Thủ Đức đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập vừa qua. Cuối cùng là cảm ơn các bạn lớp Công nghệ sinh học 28 thân mến đã cùng tôi đồng hành trên suốt chặng đƣờng đại học. Tp.Hồ Chí Minh, ngày…tháng…năm 2006 Sinh viên Đặng Trần Quân v TÓM TẮT Trong công nghệ nuôi tôm hiện nay, đặc biệt là các mô hình nuôi tôm mật độ cao, việc áp dụng các giải pháp, phƣơng thức quản lý nhằm tăng cƣờng hiệu quả sản xuất đóng góp đáng kể vào năng suất nuôi. Giải pháp quản lý sử sụng các sản phẩm sinh học tăng cƣờng sức khỏe cho tôm thông qua việc tăng cƣờng hiệu quả đáp ứng miễn dịch của tôm với mầm bệnh, nhất là với mầm bệnh virus, đƣợc xem là giải pháp khá quan trọng. Trong thí nghiệm này, chúng tôi đánh giá sự thay đổi tính mẫn cảm của tôm sú tiền trƣởng thành Penaeus monodon đối với virus đốm trắng (WSSV) sau khi ứng dụng các giải pháp bổ sung các chất kích thích miễn dịch, vitamin C và β- 1,3/1,6-glucan vào thức ăn nuôi tôm trong khoảng thời gian nhất định. Sử dụng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn đƣợc xây dựng bởi Phòng thí nghiệm virus - Đại học Gent, Vƣơng Quốc Bỉ, kỹ thuật xét nghiệm hóa mô miễn dịch và phƣơng pháp tiêm mô dịch gốc virus đốm trắng dòng Việt Nam (WSSV-VN) đã đƣợc tinh sạch và xác định độc lực thông qua chuẩn độ để xác định sự thay đổi độ mẫn cảm đối với virus của tôm. Thí nghiệm đƣợc tiến hành với hai liều tiêm cao và thấp của độ chuẩn SID 50 của dịch gốc WSSV-VN cho tôm sú tiền trƣởng thành sau khi đã nuôi với 3 nghiệm thức thức ăn có bổ sung β-1,3/1,6-glucan (10g/kg thức ăn), bổ sung vitamin C (5g/kg thức ăn) và không bổ sung trong thời gian 15 ngày. Gây nhiễm thực nghiệm cho tôm ở liều thấp (10 1,5 SID 50 ) và liều cao (10 4 SID 50 ) của dịch virus WSSV-VN cho 3 nhóm tôm thuộc 3 nghiệm thức trên. Thu mẫu tôm ở các thời điểm khác nhau sau gây nhiễm: 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120 giờ, để khảo sát sự thay đổi độ mẫn cảm thông qua đánh giá sự biến đổi tình trạng sức khỏe tôm và tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV trên tôm giữa các nghiệm thức. Kết quả thu đƣợc ở thí nghiệm gây nhiễm với liều thấp, tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV của tôm ở 3 nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan, vitamin C và đối chứng lần lƣợt là 4,12, 3,49 và 4,94%. Sự khác biệt về tỷ lệ tế bào nhiễm giữa 3 nghiệm thức này không có ý nghĩa (P>0,05). Các dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng xuất hiện sớm hơn ở nghiệm thức đối chứng so với 2 nghiệm thức còn lại. Chƣa thấy rõ sự khác biệt giữa nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan và vitamin C. Thí nghiệm gây nhiễm với liều cao, tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV của tôm ở 3 nghiệm thức β-1,3/1,6- glucan, vitamin C và đối chứng lần lƣợt là 3,04, 3,69 và 4,49%. Chỉ có sự khác biệt có ý nghĩa (P<0,05) về tỷ lệ này giữa nghiệm thức đối chứng với β-1,3/1,6-glucan. Các vi dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng xuất hiện sớm hơn ở nghiệm thức đối chứng so với 2 nghiệm thức còn lại. β-1,3/1,6-glucan thể hiện rõ tác dụng làm giảm độ mẫn cảm với WSSV của tôm sú. Trong từng phƣơng thức quản lý, tỷ lệ tế bào nhiễm ở 2 liều tiêm không có sự khác biệt (P>0,05). Ở nhóm tiêm với liều cao, các dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng đến sớm hơn nhóm tiêm liều thấp. vii MỤC LỤC Trang tựa i Lời cảm ơn . iii Tóm tắt . iv Mục lục vi Danh sách các chữ viết tắt vii Danh sách các bảng . ix Danh sách các hình . x PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề . 1 1.2 Nội dung 1 1.3 Mục tiêu 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3 2.1 Hệ miễn dịch của tôm sú . 3 2.2 Bệnh đốm trắng trên tôm sú 5 2.2.1 Lịch sử và phân bố bệnh đốm trắng . 5 2.2.2 Tác nhân gây bệnh 5 2.2.3 Dấu hiệu bệnh lý . 6 2.2.4 Phƣơng thức lan truyền 6 2.3 Các phƣơng thức quản lý nhằm tăng cƣờng sức chịu đựng của tôm đối với bệnh đốm trắng . 7 2.3.1 Chất kích thích miễn dịch . 7 2.3.2 Vaccin . 10 2.3.3 Vitamin . 11 2.3.4 Fucoidan . 12 2.4 Mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn WSSV trên tôm . 13 2.4.1 Sơ lƣợc về mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn . 13 2.4.2 Ứng dụng của mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn 14 2.5 Sơ lƣợc về hóa mô miễn dịch . 15 2.5.1 Nguyên lý . 15 2.5.2 Các phƣơng pháp nhuộm 15 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIỆN CỨU 16 3.1 Thời gian và địa điểm . 16 3.2 Vật liệu nghiên cứu . 16 3.2.1 Vật liệu sinh học . 16 3.2.2 Dụng cụ và hóa chất . 16 3.2.2.1 Dụng cụ . 16 3.2.2.2 Hoa chất 17 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 3.3.1 Phƣơng pháp pha loãng dịch huyền phù virus . 19 3.3.2 Phƣơng pháp gây nhiễm WSSV trên tôm sú 19 3.3.3 Phƣơng pháp thu mẫu cho IHC 19 3.3.4 Phƣơng pháp xác định WSSV trên tôm bằng kỹ thuật IHC . 19 3.3.5 Phƣơng pháp tính tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) trên tôm thí nghiệm20 3.3.6 Phƣơng pháp đo một số yếu tố môi trƣờng nƣớc . 20 3.3.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu 20 viii 3.4 Bố trí thí nghiệm . 21 3.4.1 Chuẩn bị vật liệu cho thí nghiệm gây nhiễm chuẩn . 21 3.4.2 Bố trí thí nghiệm gây nhiễm chuẩn cho tôm với dịch virus WSSV-VN đã chuẩn độ (10 5,2 SID 50 /ml) . 21 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Đáng giá vật liệu phục vụ cho thí nghiệm gây nhiễm chuẩn 23 4.2 Khảo sát ảnh hƣởng của các phƣơng thức quản lý khác nhau lên độ mẫn cảm của tôm đối với WSSV 24 4.2.1 Kết quả ở thí nghiệm gây nhiễm trên tôm sú với liều thấp (10 1,5 SID 50 /ml) 24 4.2.2 Kết quả ở thí nghiệm gây nhiễm trên tôm sú với liều cao (10 1,5 SID 50 /ml) 28 4.2.3 Kết quả so sánh độ mẫn cảm với 2 liều gây nhiễm của tôm ở từng phƣơng thức quản lý 32 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 5.1 Kết luận . 35 5.2 Đề nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO …37 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT WSD: White spot disease. WSSV: White spot syndrome Virus. WSSV-VN: White spot syndrome virus Vietnam IHC: Immunohistochemistry. proPO: prophenoloxidase LPS: Lipopolysaccharide BGBP: Beta-glucan biding protein VP19: envelope protein (19 kDa). VP28: envelope protein (28 kDa). DNA: Deoxiribonucleotide acid. RNA: Ribonucleotide acid. MBV: Monodon Baculovirus YHV: Yellow Head Vius. IHHNV: Infectious hypodermal hemotopoietic necrosis virus. PCR: Polymerase chain reaction. PAP: peroxidase anti peroxidase ABC: avidin-biotin complex LSAB: labelled streptavidin-biotin BPS: Buffer phosphate saline DAB: 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride. SID 50 /ml: Shrimp infectious dose 50% enpoint x DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm nuôi tôm sú với các phƣơng thức quản lý khác nhau . 20 Bảng 3.2 Các thời điểm thu mẫu ở mỗi đợt thí nghiệm 21 Bảng 4.1 Kết quả theo dõi các chỉ tiêu môi trƣờng trong quá trình thí nghiệm . 23 Bảng 4.2 Kết quả tăng trọng của tôm sau 15 ngày nuôi . 23 Bảng 4.3 Kết quả theo dõi thực nghiệm dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng sau khi gây nhiễm liều thấp…………………………………………… 24 Bảng 4.4 Kết quả tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV của tôm kiểm tra bằng IHC ở liều thấp 25 Bảng 4.5 Kết quả kiểm tra tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) trên tôm bằng IHC theo thời gian thu mẫu ở liều thấp………………………………………26 Bảng 4.6 Kết quả theo dõi thực nghiệm dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng sau khi gây nhiễm liều cao 28 Bảng 4.7 Kết quả tỷ lệ nhiễm WSSV của tôm ở 3 nghiệm thức ở liều cao 30 Bảng 4.8 Kết quả kiểm tra tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV trên tôm bằng IHC ở các thời điểm thu mẫu ở liều cao…… ………………………………………30 Bảng 4.9 So sánh kết quả theo dõi thực nghiệm và phân tích tỷ lệ cảm nhiễm (IHC) giữa 2 liều tiêm……………………………………………… 32 Bảng 4.10 Tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) của tôm ở từng phƣơng thức quản lý đƣợc gây nhiễm với 2 liều tiêm………………………………………………33 [...]... hình gây nhiễm th c nghiệm chuẩn đánh giá ảnh hưởng c a c c phương th c quản lý kh c nhau lên độ mẫn c m đối với virus gây hội chứng đốm trắng (White spot syndrome virus–WSSV) c a tôm sú (Peneaus monodon)” 1.2 Nội dung Trong đề tài, chúng tôi bổ sung vào th c ăn cho tôm 2 hợp chất là Vitamin C và -1,3/1,6 -glucan, đƣ c xem nhƣ là c c chất kích thích tăng c ờng hoạt động c a hệ thống miễn dịch không đ c. .. nghiên c u c a mình, Chang và ctv (2002) đã chứng minh đƣ c t c dụng c a β-1,3 -glucan giúp tăng c ờng đáp ứng miễn dịch c a tôm sú đối với virus gây hội chứng đốm trắng Hình 2.1 Sơ đồ sự kích hoạt c a β -glucan và Lipopolysaccharide lên c c tế bào máu c a giáp x c (Vargas-Albores và ctv, 1998) Theo Krimbrell và ctv (2001), ở tôm c ng nhƣ hầu hết c c động vật không xƣơng sống thiếu một hệ đáp ứng miễn dịch... β-1,3/1,6 -glucan từ thành tế bào nấm men bánh mì (MacroGard, Betafectin) C c cấu tr c Carbohydrate (glycan) từ c c nguồn sinh h c kh c nhƣ tảo biển C c peptide từ c c dịch chiết c a động vật hay từ quá trình thủy phân enzyme c c protein từ c C c nucleotide C c sản phẩm tổng hợp (Bestatin, FK-156, Levamisole…) Chất kích thích miễn dịch c thể đƣ c cung c p cho tôm bằng c c cách nhƣ tiêm (ít dùng), cho tr c. .. 2.3.1 Chất kích thích miễn dịch Chất kích thích miễn dịch là c c hợp chất hóa h c có khả năng làm tăng họat tính c a c c tế bào bạch c u và vì thế chúng c thể giúp tăng c ờng tính kháng c a vật nuôi đối với sự xâm nhiễm c a virus, vi khuẩn, nấm và c c vật ký sinh kh c Bên c nh đó c c chất này c ng giúp chống lại c c tế bào ung thƣ ở ngƣời nhờ vào khả năng hoạt hóa c c tế bào bạch c u nhận ra và tiêu... th c tế Tuy nhiên trong c c nghiên c u gần đây trên tôm sú P.monodon, Witteveldt và ctv (2003) đã chứng minh đƣ c rằng một c chế bảo hộ và đáp ứng miễn dịch chuyên biệt c thể đƣ c kích thích sau khi c p vaccine tiểu đơn vị Bản chất c a c c vaccine này là c c vi khuẩn đƣ c chuyển nạp gen biểu hiện c c protein c u tr c vỏ VP19 và VP28 c a WSSV Đây là c c protein hiện diện nhiều trên vỏ c a WSSV và. .. t c một c ch mạnh mẽ với c c kháng thể đa dòng đƣ c tạo ra từ thỏ (Van Hulten và ctv, 2000b) Vaccine đƣ c trộn với th c ăn 11 và cung c p cho tôm trong 7 ngày Sau đó, tiến hành c m nhiễm bằng c ch ngâm tôm trong nƣ c biển chứa WSSV trong 7 giờ Kết quả cho thấy ở c c nhóm tôm đƣ c cấp vaccine chứa VP28 và hỗn hợp VP28 + VP19 cho tỷ lệ chết tích lũy (30% và 50%) thấp hơn so với nhóm tôm đƣ c cấp vaccine... là c c vector rỗng (empty vector) và c c nhóm đối chứng dƣơng Chọn ngẫu nhiên c c cá thể c n sống để kiểm tra sự hiện diện c a WSSV, tất c đều cho kết quả âm tính Song song đó, c c t c giả c ng nghiên c u thời điểm khởi đầu và thời gian bảo hộ c a vaccine Nhóm tôm đƣ c cấp vaccine chứa VP28 (vaccine cho tỷ lệ tôm sống cao) đƣ c chia làm 3 nhóm nhỏ hơn để tiến hành c m nhiễm ở c c thời điểm kh c nhau... ở c c nghiệm th c bổ sung 2, 10 và 20 g/kg th c ăn, sau khi c m nhiễm, c c thành phần trên biến đổi theo chiều hƣớng suy giảm nhƣng ph c hồi và đạt c c đại một vài ngày sau đó Sự biến đổi này c t c dụng làm tăng c ờng s c chịu đựng c a tôm đối với WSSV 2.3.2 Vaccine Vaccine là một sản phẩm đƣ c tạo nên từ chính c c t c nhân gây bệnh, hay c c đ c tố do c c t c nhân gây bệnh tiết ra, nhằm t c động vào... (Plumb và Zilberg, 1999) C thể ở tôm, c sự kh c biệt về tính mẫn c m với WSSV ở c c giai đoạn sống kh c nhau (Yoganandhan và ctv, 2003) hay giữa c c loài tôm (Lightner và ctv, 1998) Đ c tính hay khả năng gây bệnh c a mầm bệnh là một đ c tính c thể đo lƣờng đƣ c (Shapiro-Ilan và ctv, 2005) Do đó ứng dụng mô hình c m nhiễm chuẩn, ta c thể so sánh đ c l c c a c c chủng WSSV kh c nhau Mô hình c m nhiễm chuẩn... chỉ ra rằng với nhiệt độ 25oC, khả năng 100% tôm chết do bệnh đốm trắng; nếu nhiệt độ tăng lên 32oC thì tỷ lệ chết c a tôm chỉ khoảng 20% Kết quả này đƣ c giải thích là do nhiệt độ c a nƣ c tăng lên làm giảm khả năng tái tạo c a WSSV Song song đó, vi c bổ sung vào khẩu phần ăn c a tôm c c chất chất kích thích miễn dịch, vitamin, vaccine… là c n thiết nhằm tăng c ờng đáp ứng miễn dịch c a tôm chống lại . DỤNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM TH C NGHIỆM CHUẨN ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG C A β-1,3/1,6 -GLUCAN VÀ VITAMIN C LÊN ĐỘ MẪN C M ĐỐI VỚI VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (White. hình gây nhiễm th c nghiệm chuẩn đánh giá ảnh hưởng c a c c phương th c quản lý kh c nhau lên độ mẫn c m đối với virus gây hội chứng đốm trắng