Khảo sát quá trình cố định enzym nattokinase trong chất mang alginat

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU TRANG KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH CỐ ĐỊNH ENZYM NATTOKINASE TRONG CHẤT MANG ALGINAT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2020 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU TRANG MÃ SINH VIÊN: 1501511 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH CỐ ĐỊNH ENZYM NATTOKINASE TRONG CHẤT MANG ALGINAT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Kiều Thị Hồng Nơi thực hiện: Bộ môn Công Nghiệp Dược HÀ NỘI – 2020 LỜI CẢM ƠN Với tất kính trọng lịng biết ơn sâu sắc xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô giáo ThS Kiều Thị Hồng PGS.TS Đàm Thanh Xuân, giảng viên Bộ môn Công nghiệp Dược, người thầy quan tâm, trực tiếp tận tình hướng dẫn tơi thực khóa luận Đồng thời, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Lê Ngọc Khánh cho nhiều ý kiến đóng góp q báu giúp đỡ tơi suốt q trình thực khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược tạo điều kiện giúp đỡ tơi thực khóa luận Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến Ban giám hiệu tồn thể thầy giáo trường Đại học Dược Hà Nội dìu dắt, dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian học tập trường Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình tất người thân, bạn bè động viên, khích lệ, ủng hộ nhiệt thành giúp đỡ suốt thời gian học tập nghiên cứu vừa qua Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2020 Sinh viên Nguyễn Thu Trang MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ KIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Nattokinase 1.1.1 Nguồn gốc 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Đặc điểm cấu tạo tính chất 1.1.4 Tác dụng chế tác dụng 1.2 Alginat 1.2.1 Cấu trúc alginat 1.2.2 Tính chất alginat 1.2.3 Ứng dụng alginat 1.3 Tinh bột 1.4 Phương pháp cố định (bất động) enzym 1.4.1 Nguyên tắc 1.4.2 Các phương pháp bất động enzym 1.4.3 Ưu, nhược điểm enzym cố định 11 1.5 Một số nghiên cứu nước enzym Nattokinase 12 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị: 14 2.1.1 Enzym 14 2.1.2 Nguyên liệu, hóa chất thuốc thử 14 2.1.3 Máy móc dụng cụ 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.2.1 Khảo sát trình cố định enzym Nattokinase chất mang alginat alginat – tinh bột 15 2.2.2 Khảo sát khả phân giải casein mẫu hạt cố định enzym Nattokinase 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Phương pháp cố định enzym Nattokinase chất mang alginat alginat – tinh bột 16 2.3.2 Phương pháp thử hoạt tính enzym protease 17 2.3.3 Phương pháp đông khô 17 2.3.4 Phương pháp xác định đường kính vi nang 17 2.3.5 Phương pháp đánh giá vi nang mơi trường dịch tiêu hóa mơ 18 2.3.6 Phương phác xác định mức độ trương nở vi nang môi trường mô dịch dày 18 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 20 3.1 Khảo sát trình cố định enzym nattokinase chất mang alginat alginat – tinh bột 20 3.1.1 Cố định enzym Nattokinase chất mang alginat alginat – tinh bột, đánh giá số đặc tính hạt cố định 20 3.1.2 Đánh giá độ bền hạt cố định enzym Nattokinase môi trường dịch dày mô (SGF) 28 3.2 Khảo sát khả phân giải casein mẫu hạt cố định enzym Nattokinase 35 3.2.1 Định tính enzym Nattokinase mẫu hạt cố định thất mơi trường mô dịch dày 35 3.2.2 Khảo sát khả phân giải casein mẫu hạt cố định enzym Nattokinase dịch ruột mô 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 KẾT LUẬN 46 KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Alg : Alginat dd : Dung dịch DĐVN : Dược điển Việt Nam EZ : enzym MT : Môi trường Alg : Alginat NK : enzym Nattokinase SGF : Dịch dày mô (Simulated gastric fluid) SIF : Dịch ruột mô (Simulated intestinal fluid) TB : Tinh bột VK : vi khuẩn VSV : vi sinh vật N-Suc-AlaAla-Pro-Phe- : N-Succinyl-Alanin-Alanin-Propyl-Phenylalanin-p-nitroanilid pNA Ser-221 : Serin-221 His-64 : Histidin-64 Asp-32 : Aspartat-32 PMSF : Phenylmethylsulfonyl fluorid t-PA : Tissue plasminogen activator (Chất hoạt hóa plasminogen mô) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Nguyên liệu hóa chất sử dụng 14 Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 15 Bảng 3.1 Khối lượng (g) đường kính (mm) trung bình mẫu hạt cố định enzym Nattokinase sau đông khô 22 Bảng 3.2 Kết lần đo đường kính (mm) hạt cố định enzym Nattokinase trước sau lắc MT SGF 120 phút 31 Bảng 3.4 Mức độ trương nở (%) hạt cố định enzym Nattokinase sau lắc MT SGF 120 phút (n=15) 32 Bảng 3.5: Đường kính vịng phân giải casein mẫu hạt cố định enzym Nattokinase MT SIF sau ủ MT SGF (mm) 38 Bảng 3.6: Đường kính vịng phân giải casein (mm) mẫu hạt cố định enzym Nattokinase MT SIF 41 DANH MỤC HÌNH ẢNH VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cấu trúc phân tử Nattokinase từ Bacillus subtilis natto Hình 1.2 Hình ảnh mơ tả cấu trúc alginat Hình 1.3 Quá trình tạo gel phân tử calci alginat Hình 1.4 Các phương pháp bất động tế bào enzym 11 Hình 3.1 Hình ảnh hạt cố định enzym Nattokise trước – sau đông khô nồng độ TB tương ứng: 24 Hình 3.2 Kết khả phân giải casein dd CaCl2 sử dụng trình cố định enzym Nattokinase mẫu sử dụng nồng độ TB tương ứng: 27 Hình 3.3 Hình ảnh hạt cố định enzym Nattokinase trước - sau ủ MT SGF 120 phút nồng độ TB tương ứng: 29 Hình 3.4 Hình ảnh dịch dày mơ ly tâm sau ủ hạt cố định enzym Nattokinase nồng độ TB tương ứng: 30 Bảng 3.3 Đường kính trung bình (mm) hạt cố định enzym Nattokinase trước sau lắc MT SGF 120 phút 32 Hình 3.5 Biểu đồ so sánh mức độ trương nở hạt cố định enzym Nattokinase sau lắc MT SGF 120 phút nồng độ TB khác 33 Hình 3.6 Kết khả phân giải casein môi trường mô dịch dày sau ủ hạt cố định enzym Nattokinase nồng độ TB tương ứng: 36 Hình 3.7 Kết khả phân giải casein mẫu hạt cố định enzym Nattokinase MT SIF sau ủ MT SGF 38 Hình 3.8 Biểu đồ so sánh đường kính trung bình vịng phân giải casein mẫu hạt cố định enzym Nattokinase MT SIF (C: mẫu chứng) 42 Hình 3.9 Hình ảnh vịng phân giải casein hạt cố định enzym Nattokinase MT SIF nồng độ TB tương ứng: (C: mẫu chứng) 42 Hình 3.10 Biểu đồ so sánh đường kính trung bình vịng phân giải casein mẫu hạt cố định enzym Nattokinase MT SIF ủ không ủ MT SGF 43 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, chế phẩm enzym sản xuất sử dụng ngày rộng rãi nhiều lĩnh vực đời sống người Trong đó, protease – enzym phá vỡ liên kết peptid acid amin protein – enzym có nhiều ứng dụng số ngành chế biến thực phẩm, sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da… Đặc biệt lĩnh vực y tế, protease sử dụng làm thuốc điều trị cho hiệu tốt Vi khuẩn Bacillus subtilis natto thuộc chi Bacillus, loài Bacillus subtilis biết đến “nguyên liệu” ủ với đậu tương nấu chín, lên men tạo nên ăn truyền thống Natto Nhật Bản Năm 1980, giáo sư Sumi người Nhật phát Natto có chứa Nattokinase – enzym thuộc nhóm enzym protease có khả phân giải fibrin mạnh [25],[31],[43], dùng đường uống để phòng bệnh huyết khối Nattokinase khẳng định tác dụng sử dụng ngày rộng rãi giới Hiện nay, Nattokinase sản xuất từ VSV tái tổ hợp nhiều khai thác từ Natto [4],[9],[11],[20],[28],[29],[38] Các sản phẩm Nattokinase nhiều công ty dược phẩm nghiên cứu sản xuất Nattospes, Nattoenzym, Hạ áp Ích Nhân… Tuy nhiên có đặc điểm Nattokinase làm cho nhà sản xuất vô băn khoăn lo lắng sản phẩm lưu hành thị trường mức độ công dụng đạt nó, là: - Bản thân Nattokinase điều kiện bảo quản có nguy bị tụt hàm lượng - Khi sử dụng đường uống, Nattokinase bị phá hủy môi trường acid dịch vị (acid dày) [20], [46] Vì vậy, đề tài nghiên cứu cố định enzym Nattokinase chất mang alginat, có bổ sung tinh bột với kỳ vọng giúp enzym Nattokinase qua dày khơng bị hoạt tính thể tốt vai trị xuống đến ruột non (pH = E2: mẫu chứng (Enzym Nattokinase hịa tan dịch dày mơ pH 1,2) e) Nhận xét bàn luận: Mẫu chứng 2: mẫu enzym Nattokinase tự ủ môi trường dịch dày mô pH 1,2 120 phút, khơng xuất vịng phân giải casein Như vậy, enzym Nattokinase tự hoạt tính sau ủ 120 phút môi trường mô dịch dày pH 1,2 Các mẫu hạt cố định enzym Nattokinase chất mang alginat alginat – tinh bột cho vịng phân giải casein, có nghĩa mẫu hạt cố định enzym Nattokinase giữ hoạt tính chuyển sang dịch ruột mô sau ủ 120 phút dịch dày mô Tuy nhiên, đường kính vịng phân giải casein mẫu hạt cố định enzym Nattokinase nhỏ mẫu chứng enzym Nattokinase tự môi trường dịch ruột mô pH 6,8 (20,35±0,69 mm) Từ kết cho thấy, hoạt tính enzym Nattokinase mẫu hạt cố định bị giảm so với enzym Nattokinase tự Nguyên nhân thứ tác động trình cố định enzym Nattokinase chất mang alginat alginat - tinh bột làm thất thoát enzym làm giảm khả giải phóng enzym Nattokinase khỏi hạt cố định nguyên nhân thứ hai trình ủ hạt cố định enzym Nattokinase dịch dày mô pH 1,2 Theo nghiên cứu Đàm Thanh Xuân, Nguyễn Ngọc Chiến cộng (2016) [5], việc cố định chất mang alginat có bổ sung tinh bột giúp bảo vệ vật chất bên trong điều kiện acid không ảnh hưởng đến khả giải phóng chúng xuống đến ruột non Như vậy, bước đầu xác định việc cố định enzym Nattokinase chất mang alginat alginat – tinh bột giúp bảo vệ enzym qua dịch dày, nhiên chưa xác định việc ủ mẫu hạt cố định enzym Nattokinase môi trường mô dịch dày có làm suy giảm hoạt tính enzym Nattokinase đến ruột hay không? 39 3.2.2 Khảo sát khả phân giải casein mẫu hạt cố định enzym Nattokinase dịch ruột mô Mặc dù phương pháp cố định enzym Nattokinase chất mang alginat có nhiều ưu điểm như: cho phép sử dụng enzym nhiều lần, tiến hành trình liên tục ngừng phản ứng cần thiết Nhưng bên cạnh số nhược điểm phương pháp enzym thường bị giảm hoạt tính chịu ảnh hưởng phản ứng bất động enzym lên chất Do đó, khảo sát khả phân giải casein enzym Nattokinase hạt cố định để so sánh hoạt tính enzym trước – sau cố định so sánh hoạt tính enzym cố định chất mang alginat có bổ sung tinh bột nồng độ khác Đồng thời, khảo sát khả phân giải casein mẫu hạt cố định enzym Nattokinase dịch ruột mô pH 6,8 mà không qua giai đoạn ủ dịch dày mô pH 1,2 để xác định hoạt tính enzym Nattokinase mẫu hạt cố định đến ruột có bị ảnh hưởng giai đoạn qua dày hay không? a) Mục tiêu: Khảo sát khả phân giải casein mẫu hạt cố định enzym Nattokinase dịch ruột mô Xác định ảnh hưởng dịch dày hoạt tính enzym Nattokinase mẫu hạt cố định b) Tiến hành: Chuẩn bị dịch thử 1: Cân xác khoảng 1/3 khối lượng mẫu hạt cố định enzym Nattokinase đông khô (bảng 3.1) cho vào bình nón chứa 50,0 ml mơi trường dịch ruột mơ pH 6,8 (hoạt độ enzym Nattokinase tương đương khoảng 33,33 FU/ml) Ủ máy lắc 370C, tốc độ 75 vòng/phút Sau giờ, ly tâm mẫu lắc hạt cố định enzym Nattokinase dịch ruột tốc độ 4000 vòng/phút phút, thu lấy phần dịch làm dung dịch thử 40 Tiến hành thử khả phân giải casein mẫu theo phương pháp nêu mục 2.3.2 Mẫu trắng: Dung dịch đệm phosphat hỗn hợp pH 6,8 pha theo phương pháp mục 2.1.2 Mẫu chứng: Cân khoảng 0,083 g enzym Nattokinase hịa tan vào 50 ml mơi trường dịch ruột mơ pH 6,8 (hoạt độ enzym Nattokinase tương đương khoảng 33,33 FU/ml) c) Kết quả: Bảng 3.6: Đường kính vịng phân giải casein (mm) mẫu hạt cố định enzym Nattokinase MT SIF Đường kính vịng phân giải casein (mm) Lần Alg Alg – TB Alg – TB Alg – TB Alg – TB Alg – TB 2% 4% 6% 8% 10% Mẫu chứng 18,22 18,04 18,50 17,70 15,90 16,48 20,70 16,92 15,80 17,66 14,82 15,26 15,20 20,34 18,74 17,90 18,40 17,80 17,10 16,88 20,80 18,19±0,46 16,77±1,69 16,09±0,93 16,19±0,88 20,61 ± 0,24 Trung bình 17,96±0,94 17,25±1,25 Các mẫu trắng khơng xuất vịng phân giải casein 41 Hình 3.8 Biểu đồ so sánh đường kính trung bình vịng phân giải casein mẫu hạt cố định enzym Nattokinase MT SIF (C: mẫu chứng) Hình 3.9 Hình ảnh vịng phân giải casein hạt cố định enzym Nattokinase MT SIF nồng độ TB tương ứng: (C: mẫu chứng) 0: 0% 4: 4% 8: 8% 2: 2% 6: 6% 10: 10% 42 Hình 3.10 Biểu đồ so sánh đường kính trung bình vòng phân giải casein mẫu hạt cố định enzym Nattokinase MT SIF ủ không ủ MT SGF d) Nhận xét biện luận: Mẫu trắng khơng cho vịng phân giải chất loại trừ ảnh hưởng mẫu đến kết thí nghiệm Các mẫu hạt cố định enzym Nattokinase không ủ môi trường mô dịch dày pH 1,2 trước chuyển sang môi trường mô dịch dịch ruột pH 6,8 cho vòng phân giải casein Kết thí nghiệm lần cho thấy sau cố định chất mang alginat alginat – tinh bột, enzym Nattokinase giữ hoạt tính thể qua khả phân giải casein enzym protease đặc trưng Đường kính vòng phân giải casein hạt cố định enzym Nattokinase chất mang Alg 3% - TB: xấp xỉ nồng độ tinh bột 0%, 2%, 4%; giảm dần nồng độ tinh bột tăng lên 6%, 8%, 10% Như vậy, nồng độ tinh bột cao 6%, 8%, 10% làm giảm khả giải phóng enzyme Nattokinase khỏi hạt cố định Đường kính vịng phân giải casein hạt cố định enzym Nattokinase chất mang Alg 3% - TB 4% đạt giá trị lớn (trung bình 18,19 ± 0,46 mm) Khi 43 khơng có tinh bột, đường kính vịng phân giải casein đạt giá trị lớn thứ (17,96±0,94 mm), sau đông khơ, hạt cố định có hình dạng dúm dó, khơng đạt kích thước hàm ẩm cho q trình bào chế Tại nồng độ TB 2%, đường kính vịng phân giải casein xấp xỉ nồng độ TB 0% (17,25±1,25 mm) Tại nồng độ TB 6%, 8%, 10%, đường kính vịng phân giải casein giảm so với nồng độ TB thấp Từ đó, bước đầu xác định nồng độ tinh bột 4% nồng độ tối ưu cho khả giải phóng enzyme nattokinase khỏi hạt cố định khả phân giải casein Đường kính vịng phân giải casein mẫu hạt cố định enzym Nattokinase môi trường dịch ruột mô pH 6,8 mà không trải qua q trình ủ mơi trường dịch dạ mơ nhỏ đường kính vịng phân giải casein mẫu chứng enzym Nattokinase tự (20,61 ± 0,24 mm) cho thấy enzym Nattokinase cố định chất mang alginat alginat – tinh bột giảm hoạt tính so với enzym Nattokinase tự Từ kết thấy tác động q trình cố định enzym Nattokinase làm suy giảm hoạt tính enzym Đồng thời, dựa vào biểu đồ hình 3.10 cho thấy đường kính vịng phân giải casein mẫu hạt cố định enzym Nattokinase ủ dịch mô dày trước chuyển sang môi trường dịch ruột mơ nhỏ so với đường kính vịng phân giải casein mẫu hạt cố định enzym Nattokinase không ủ dịch dày mô Điều có nghĩa mẫu hạt cố định enzym Nattokinase ủ dịch mô dày trước chuyển sang môi trường dịch ruột mô bị giảm hoạt tính so với mẫu hạt cố định enzym Nattokinase không ủ dịch dày mô Kết bước đầu cho thấy môi trường dịch dày pH 1,2 làm suy giảm hoạt tính enzym Nattokinase mẫu hạt cố định Theo nghiên cứu Abida Anwar CS (2009) [12], enzym protease sau cố định chất mang calci alginat giữ hoạt tính chúng 44 cần nồng độ chất cho hoạt động tối đa enzym cố định thay đổi từ 0,45% đến 0,8% Thời gian phản ứng enzym khử cố định tăng thêm phút so với tham chiếu enzym hòa tan Một nghiên cứu khác Nakisa Rezakhani CS (2014) [37] cho kết enzym protease cố định chất mang alginat – chitosan giữ hoạt tính hoạt động ổn định Như vậy, sau cố định chất mang alginat alginat – tinh bột, enzym Nattokinase giữ hoạt tính thể qua khả phân giải casein Nồng độ tinh bột sử dụng trình cố định enzym Nattokinase có ảnh hưởng định đến khả phân giải casein hoạt tính enzym Nattokinase Ở pH 6,8 tương đương với pH ruột, hạt cố định enzym Nattokinase chất mang Alg – TB nồng độ tinh bột 2% 4% có khả phân giải casein cao mẫu lại Đề tài bước đầu xác định việc cố định enzym Nattokinase chất mang alginat alginat – tinh bột giúp bảo vệ enzym Nattokinase qua dày, nhiên hoạt tính enzym bị suy giảm phần Đồng thời, kết cho thấy cố định enzym Nattokinase chất mang alginat – tinh bột với nồng độ tinh bột 4% nồng độ tối ưu cho khả giải phóng enzyme Nattokinase khỏi hạt cố định khả phân giải casein 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau thời gian nghiên cứu, đề tài đạt mục tiêu đề thu số kết sau: Kết trình cố định enzym nattokinase chất mang alginat alginat – tinh bột - Cố định enzym Nattokinase hệ gel alginat alginat – tinh bột với nồng độ tinh bột: 2%, 4%, 6%, 8%, 10% - Trong trình cố định enzym Nattokinase hệ gel alginat alginat – tinh bột, khơng có thất enzym Nattokinase dung dịch gel hóa CaCl2 sử dụng q trình cố định enzym Kết khả phân giải casein enzym Nattokinase mẫu hạt cố định - Sau cố định chất mang alginat alginat – tinh bột, enzym Nattokinase giữ hoạt tính thể qua khả phân giải casein - Ở pH 6,8 tương đương với pH ruột, bước đầu xác định nồng độ tinh bột 4% nồng độ tối ưu để bảo vệ hoạt tính enzym Nattokinase hạt cố định enzym chất mang Alg – TB - Bước đầu xác định việc cố định enzym Nattokinase chất mang alginat alginat – tinh bột giúp bảo vệ enzym Nattokinase qua dày, nhiên hoạt tính enzym bị suy giảm phần KIẾN NGHỊ Bên cạnh kết đạt được, thời gian có hạn, đề tài xin đưa số đề xuất nhằm hoàn thiện nâng cao tính ứng dụng thực tế sau: Tiếp tục nghiên cứu sâu cấu trúc hạt cố định tỷ lệ phối hợp alginat tinh bột trình cố định enzym Nattokinase, phối hợp thêm chitosan nghiên cứu bao thêm lớp bao kháng acid để bảo 46 vệ enzym Nattokinase tốt qua dày, giữ hoạt tính tối ưu đến ruột Khảo sát khả phân giải casein mẫu hạt cố định enzym Nattokinase dịch ruột mô pH 6,8 sau ủ môi trường mô dịch dày pH 1,2 khoảng thời gian khác 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1.Trần Văn Ân (1982), Góp phần nghiên cứu chất lượng rong mơ chiết Alginat từ rong mơ hịn Chồng – Nha Trang, Luận án phó tiến sỹ khoa học Hà Nội, tr 120 – 123 Bộ Y Tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất Y học, Hà Nội Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2009), Công nghệ sinh học, tập 3, Enzym ứng dụng, Nxb Giáo Dục, Hà Nội, tr.14 Đàm Thanh Xuân CS (2013), “Nghiên cứu tách chiết enzym protease ngoại bào từ Bacillus subtilis natto”, Tạp chí Nghiên cứu Dược Thơng tin thuốc, 5, tr 174 – 178 Đàm Thanh Xuân, Nguyễn Ngọc Chiến CS (2016), “Nghiên cứu bào chế vi nang probiotics phương pháp đơng tụ”, Tạp chí dược học, 481, tr 61 – 65 Từ Minh Koóng (2004), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, Nhà xuất Y học Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ enzym, Nxb Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, tr 310 – 311 Ngơ Đăng Nghĩa (1999), Tối ưu hóa quy trình cơng nghệ sản xuất Alginat Natri từ rong mơ Việt Nam ứng dụng số lĩnh vực sản xuất, Luận án tiến sỹ kỹ thuật, Trường Đại học Thủy Sản, tr 13 – 27 Lê Thị Bích Phượng CS (2012), “Phân lập tuyển chọn số chủng Bacillus sinh tổng hợp Nattokinase”, Tạp chí sinh học, 34, tr 99 – 104 10 Nguyễn Văn Rư (2002), Nghiên cứu chế tạo chế phẩm protease nguồn gốc động vật, thực vật ứng dụng phòng chống suy dinh dưỡng, Luận án tiến sĩ, Trường đại học Dược Hà Nội, tr.3 - 11 Nguyễn Thị Thảo, Quyền Đình Thi (2004), “Ảnh hưởng yếu tố mơi trường lên q trình sinh trưởng sinh tổng hợp protease chủng Serratia sp DT3”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 2(2), tr 205 – 216 Tiếng Anh 12 Abida Anwar , Shah Ali , Ul Qader , Aliya Raiz , Samina Iqbal , Abid Azhar (2009), “Calcium Alginat: A Support Material for Immobilization of Proteases from Newly Isolated Strain of Bacillus subtilis KIBGE-HAS”, World Applied Sciences Journal, (10), pp 1281 – 1286 13 Atsuo Tanaka and Takuo Kawamoto, Cell immobilization, Kyoto University, Japan, pp 505 – 512 14 Allergy Research Group (2008), “Nattokinase: Clinical updates from doctors support its safety and efficacy”, Allery Research Group Focus Newsletter, pp – 15 Bickerstaff, Gordonn F (1997), “Immobilization of enzyms and cells”, Methods in Biotechnology, Vol 1, pp 367 16 Chan Eng – Seng al et (2011), “Effects of starch filter on the physical properties of lyophilized calcium – alginat beads and the viability of encapsulated cells”, Carbohydrate Polymers, 83, pp 225 – 232 17 Doumèche B., Kuppers M., et al (2004), “New approaches to the visualization, quantification and explanation of acid – induced water loss from Ca – alginat hydrogel beads”, Journal of Microencapsulation, 21(5), pp 565 – 573 18 Eng-Seng Chan, et al (2011), “Effects of starch filler on the physical properties of lyophilized calcium–alginate beads and the viability of encapsulated cells”, Carbohydrate Polymers, 83, pp 225-232 19 Fujita F., Hong K (1995), “Thrombolytic effect of nattokinase on a chemically inducedd thrombosis model in rat”, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 18(10), pp 1387 – 1391 20 M Fujita at al (1993), “Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzym (nattokinase) in the vegetable cheese natto, a popular soybean fermented food in Japan”, Biochemical and Biophysical research communication, pp 1340 – 1347 21 Fujita M et al (1995), “Transport of nattokinase across the rat intestinal tract”, Biol Pharm Bull, 18(9), pp 1194 – 1196 22 Guillermo Simó, et al (2017), “Research progress in coating techniques of alginate gel polymer for cell encapsulation”, Carbohydrate Polymers, Vol 170, pp – 14 23 Haritha M., Vangalapati M (2011), “ Nattokinase: A review on fibrinolytic enzyme”, International Journal of Chemical Environmental and Pharmaceutical Research, 2(1), pp 61 – 66 24 Himanshu K Solanki, Dipak D Pawar, et al (2013), “Development of Microencapsulation Delivery System for Long – Term Preservation of Probiotics as Biotherapeutics Agent”, Biomed Res Int 25 Holsworth (2002), “Nattokinase and Cardiovascular Health”, Special Report, pp 26 Jiyeon Ha (2005), “Bioremediation of the organophosphate pesticide, coumaphos, using microorganisms immobilized in calcium – alginat gel beads”, Submitted to the Office of Graduate Studies of Texas A & M University in partial fulfillment of the requirements for the degress of doctor of philosophy, pp 22 – 29 27 Ji Young Kim, Si Nae Gum (2008), “ Effects of nattokinase on blood pressure: A randomized, controlled trial”, Hypertension Research, 31, pp 1583 – 1588 28 Kim S., Choi N., (2000), “Purification and characterization of subtilisin DJ4 secreted by Bacillus sp strain DJ-4 screened from Doen-Jang”, Biosci Biotechnol Biochem, 64, pp 1722 – 1725 29 Kim W., Choi K., Kim Y., Park H., Choi J., Lee Y., Oh H., Kwon I., Lee S., (1996), “Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp strain CK 11-4 screened from Chungkook-Jang”, Appl Environ Microbiol, 62(7), pp 1488 – 2482 30 Kourkoutas Y., Bekatorou A., Banat J.M., Marchant R., Koutinas A A (2004), “Immobilization technologies and support materials suitable in alcohol berverages production: a review”, Food Microbiol, Vol 21, p 377 – 397 31 Maruyama M., Sumi H (1998), “ Effect of natto diet on blood pressure, in basic and clinical aspects of Japanese Traditional Food Natto II”, Japan Technology Transfer Association, pp – 32 Milner M (2002), “Natto and its active ingredient nattokinase: a potent and safe thrombolytic agent”, Alternative & complementary therapies, 8(3), pp 157 – 164 33 Mohammad Ali Khosravi Zanjani, Babak Ghiassi Tarzi, et al (2014), “Microencapsulation of Probiotics by Calcium Alginate – gelatinized Starch with Chitosan Coating and Evaluation of Survival in Simulated Human Gastro – intestinal Condition”, Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 13(3), pp 843 – 852 34 Mokarram, R R., Mortazavi, S A., Najafi, M B H., & Shahidi, F (2009) “The influence of multi stage alginate coating on survivability of potential probiotic bacteria in simulated gastric and intestinal juice”, Food Research International, 42(8), pp 1040–1045 35 Morgan C., Vesey G (2009), “Freeze – drying of microorganisms”, Encyclopedia of Microbiology, pp 162 – 173 36 Motaal A.A et al (2015), “ Comparative fibrinilytic activities of nattokinase from Bacillus subtilis var natto”, J Pharm, Sci & Res., Vol 7(2), pp 63-66 37 Nakisa Rezakhani, Ahmad Molaei rad, Kazem Parivar, Maryam Khayati, Sareh Etemadzade (2014), “Immobilization of protease in biopolymers (mixture of alginat – chitosan)”, Journal of Paramedical Sciences (JPS), Vol.5, No.4, p 108 – 113 38 Peng Y., Huang Q., Zhang R H., Zhang Y Z., (2003), “Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced by Bacillus amyloliquefaciens DC-4 screened from douchi, a traditional Chinese soybean food”, Comp Biochem Physiol Biochem MolBiol, 134, pp 45 – 52 39 Rowe Raymond C Sheskey Paul J, et al (2009), “Handbook of Pharmaceutical Excipient 6th ed.”, Pharmaceutical Pres, pp 82 – 83 40 San – Lang Wang, Ying – Ying Wu, Tzu – Wen Liang (2011), “Purification and biochemical charaterization of a nattokinase by conversion of shrimp shell with Bacillus subtilis TKU007”, New Biotechnology, pp 196 – 202 41 Shahina Naz (2002), Enzyms in food, Ameena Saiyid, Oxford University Press, pp 110 – 128 42 Sugimoto, S., Fujii T., Morimiya T (2007), Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 71, pp 2184 43 Sumi H., Hamada H., Tsushima H., Mihara H., Muraki H (1987), “ A novel fibrinolytic enzym (nattokinase) in the vegetable cheese Natto; a typical and popular soybean food in the Japanese diet”, Experientia, pp 1110 – 1111 44 Susanna Rokka Projo Rantamaki (2010), “Protecting probiotic bacteria by microencapsulation: challenges for industrial applications”, European Food Research and Technology, 231(1), pp – 12 45 Vignesh S., et al (2014), “ Production, optimization and characterization of nattokinase from Bacillus subtilis REVS12 isolated from Natto”, International Journal of Scientific & Engineering Research, Volume 5, Issue 4, pp 423-426 46 Wang C., Du M (2009), “Purification and characterization of nattokinase from Bacillus subtilis natto B – 12”, Journal of Agricultural and food chemistry article, 57, pp 9722 – 9729 Trang web 47 https://vi.wikipedia.org/wiki/Nattokinase ... 3.1 Khảo sát trình cố định enzym nattokinase chất mang alginat alginat – tinh bột 20 3.1.1 Cố định enzym Nattokinase chất mang alginat alginat – tinh bột, đánh giá số đặc tính hạt cố. .. Nattokinase phát huy tác dụng tăng hiệu sử dụng sản phẩm Đề tài ? ?Khảo sát trình cố định enzym Nattokinase chất mang alginat? ?? thực với mục tiêu: Khảo sát trình cố định enzym Nattokinase chất mang. .. đường kính cm Cốc có mỏ 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.2.1 Khảo sát trình cố định enzym Nattokinase chất mang alginat alginat – tinh bột  Cố định enzym Nattokinase chất mang alginat alginat – tinh