Nghiên cứu quy trình cố định nấm men trên chất màng BC và ứng dụng vào quá trình lên men chính RV

Nghiên cứu quy trình cố định nấm men trên chất màng BC và ứng dụng vào quá trình lên men chính RV.

Trang 1

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin cảm ơn các thầy cô trường Đại học Bách KhoaTp.HCM đã tận tình dạy bảo, xây dựng những kiến thức cơ bản cần thiếtcho em trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường.

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cô Tôn Nữ Minh Nguyệt vàthầy Lê Văn Việt Mẫn vì sự giúp đỡ và hướng dẫn tận tình mà thầy cô đãdành cho em trong suốt quá trình làm luận văn.

Mặc dù gặp nhiều khó khăn trong thời gian vừa qua, nhưng sự độngviên, giúp đỡ của các thầy cô, bạn bè và gia đình đã giúp em hoàn thànhtốt nhiệm vụ được giao Em xin chân thành cảm ơn tất cả những người đãgiúp đỡ em hoàn thành tốt luận văn này.

Tp Hồ Chí Minh, tháng 1/2008Nguyễn Đức Ninh

Trang 2

MỤC LỤC

Chương 1: GIỚI THIỆU 1

Chương 2: TỔNG QUAN 3

2.1 TỔNG QUAN VỀ RƯỢU VANG, NHO VÀ NẤM MEN DÙNG TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG 3

2.1.1 Rượu vang 3

2.1.2 Nho 4

2.1.3 Nấm men 8

2.2 CỐ ĐỊNH NẤM MEN 11

2.2.1 Sơ lược một số vấn đề về kỹ thuật cố định tế bào 11

2.2.2 Các chất mang cố định nấm men trong sản xuất rượu vang 13

2.2.3 Cố định nấm men trong gel alginate 18

2.2.4 Một số tính chất của nấm men cố định 24

2.3 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ CÔNG NGHỆ ĐẾN ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU VANG 30

2.3.1 Ảnh hưởng của hàm lượng đường 30

2.3.2 Ảnh hưởng của pH 34

2.3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng SO2 36

2.3.4 Ảnh hưởng của tannin 38

2.3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ 39

2.4 ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG.422.4.1 Dùng kỹ thuật cố định để khắc phục một số vấn đề trong sản xuất rượu vang422.4.2 Dùng kỹ thuật cố định trong một số phương pháp lên men 45

2.4.3 Dùng kỹ thuật cố định trong sản xuất một số loại rượu vang 48

Chương 3: NGUYÊN LIỆU và PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 51

3.1 NGUYÊN LIỆU 51

3.1.1 Nho 51

3.1.2 Nấm men 52

3.1.3 Alginate 52

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 52

3.2.1 Mục đích và nội dung nghiên cứu 52

3.2.2 Phương pháp cố định nấm men trong gel alginate 54

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến động học quá trình lên men rượu vang nho sử dụng nấm men cố định trong gel alginate 55

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến động học quá trình lên men rượu vang nho, sử dụng nấm men cố định trong gel alginate 56

3.2.5 Xử lý kết quả 56

3.3 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 58

3.3.1 pH 58

3.3.2 Nồng độ chất khô 58

3.3.3 Hàm lượng đường khử 58

3.3.4 Hàm lượng nitơ amin tự do 59

Trang 3

3.3.5 Hàm lượng nitơ ammonium 61

3.3.6 Hàm lượng tannin 62

3.3.7 Hàm lượng sulfur dioxide 62

3.3.8 Hàm lượng ethanol 63

3.3.9 Hàm lượng acid tổng 65

3.3.10 Hàm lượng acid dễ bay hơi 65

3.3.11 Mật độ tế bào 65

Chương 4: KẾT QUẢ và BÀN LUẬN 66

4.1 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG ĐẾN ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU VANG SỬ DỤNG NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE 66

4.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường đến động học quá trình sinh trưởng của nấm men 66

4.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường đến động học quá trình sử dụng cơ chất trong quá trình lên men 70

4.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường đến động học quá trình tạo sản phẩm 80

4.1.4 Kết luận chung 89

4.2 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA HÀM LƯỢNG TANNIN ĐẾN ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU VANG SỬ DỤNG NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE 90

4.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tannin đến động học quá trình sinh trưởng của nấm men 90

4.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tannin đến động học quá trình sử dụng cơ chất trong quá trình lên men 94

4.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tannin đến động học quá trình tạo sản phẩm 102

4.2.4 Kết luận chung 109

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 110

5.1 KẾT LUẬN 110

5.2 KIẾN NGHỊ 110

TÀI LIỆU THAM KHẢO 111

Trang 4

Danh mục các bảng

Chương 2: TỔNG QUAN 3

Bảng 2.1: Thành phần của dịch nho và rượu vang thông thường 3Bảng 2.2: Thành phần các một số acid hữu cơ chính trong dịch nho đỏ và rượu vang đỏ 6Bảng 2.3: Các đặc tính mong muốn của nấm men vang 10Bảng 2.4: So sánh các kỹ thuật cố định tế bào 12Bảng 2.5: Một số chất mang sử dụng để cố định nấm men trong sản xuất rượu vang 14Bảng 2.6: Tốc độ sử dụng cơ chất và hình thành sản phẩm của nấm men cố định trong gel

alginate và nấm men tự do 26

Bảng 2.7: Các hợp chất hương chính của rượu vang tạo bởi nấm men cố định và nấm men

tự do trong khoảng nhiệt độ 15 – 20oC 29

Bảng 2.8: Thành phần của rượu vang trắng lên men bằng 4 loại nấm men cố định trong

gel alginate và nấm men tự do 30

Bảng 2.9: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến động học quá trình lên men trong

quá trình lên men tĩnh rượu vang ở 30oC bởi tế bào cố định sấy thăng hoa (freeze-driedgluten supported biocatalyst – FGB), tế bào tự do sấy thăng hoa (freef reeze-dried cells –ffdc) và tế bào cố định chưa qua sấy (wet gluten supported biocatalyst – WGB) 33

Bảng 2.10: Các nguyên nhân cơ bản gây ra hiện tượng kéo dài thời gian lên men hoặc quá

trình lên men kết thúc khi hàm lượng đường sót còn rất cao 44

Bảng 2.11: Năng suất sinh cồn trong quá trình lên men dịch nho bởi nấm men cố định trên

kissiris, -alumina và alginate tại 7, 13 và 27oC 47

Bảng 2.12: Các hợp chất dễ bay hơi tạo thành trong suốt quá trình lên men liên tục rượu

vang sử dụng nấm men cố định trên miếng táo và quá trình lên men tĩnh sử dụng nấmmen tự do Quá trình lên men được thực hiện ở 30oC 48

Chương 3: NGUYÊN LIỆU và PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 51Bảng 3.1: Thành phần của dịch nho sau khi ép 52Bảng 3.2: Các chất bổ sung vào dịch nho khi khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường

ban đầu đến quá trình lên men 56

Bảng 3.3: Các chất bổ sung vào dịch nho khi khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tannin

ban đầu đến quá trình lên men 56

Chương 4: KẾT QUẢ và BÀN LUẬN 66Bảng 4.1: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh trưởng riêng cực đại

của nấm men trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cốđịnh trong gel alginate 69

Trang 5

Bảng 4.2: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến hàm lượng đường sót trong quá

trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 72

Bảng 4.3: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sử dụng đường cực đại

của nấm men trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cốđịnh trong gel alginate 74

Bảng 4.4: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sử dụng đường riêng cực

đại trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định tronggel alginate 74

Bảng 4.5: Độ lên men ứng với hàm lượng đường ban đầu khác nhau 75Bảng 4.6: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến thời gian lên men rượu vang sử

dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 75

Bảng 4.7: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sử dụng đường trung bình

trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gelalginate 76

Bảng 4.8: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến hàm lượng cồn đạt được trong

quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gelalginate 81

Bảng 4.9: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn cực đại

Bảng 4.10: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng

cực đại trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố địnhtrong gel alginate 83

Bảng 4.11: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn trung

bình của nấm men trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm mencố định trong gel alginate 84

Bảng 4.12: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến hiệu suất sinh tổng hợp cồn

Bảng 4.13: Aûnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sinh trưởng riêng cực đại

Bảng 4.14: Aûnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến hàm lượng đường sót trong quá

trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 96

Bảng 4.15: Aûnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sử dụng đường cực đại

Trang 6

Bảng 4.16: Aûnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sử dụng đường riêng cực

đại (chỉ xét cho giá trị cực đại đầu tiên) trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấmmen tự do và nấm men cố định trong gel alginate 97

Bảng 4.17: Aûnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến thời gian lên men rượu vang sử

dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 99

Bảng 4.18: Aûnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sử dụng đường trung bình

Bảng 4.19: Aûnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn cực

đại trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định tronggel alginate 103

Bảng 4.20: Aûnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng

cực đạitrong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố địnhtrong gel alginate 104

Bảng 4.21: Aûnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn trung

bình trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định tronggel alginate 105

Bảng 4.22: Aûnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến hiệu suất sinh tổng hợp cồn

Trang 7

Danh mục các hình vẽ

Chương 2: TỔNG QUAN 3

Hình 2.1: Nho xanh và nho đỏ 4

Hình 2.2: Cơ chế của quá trình biến đổi các hợp chất nitơ bởi nấm men 6

Hình 2.3: Các acid không bay hơi trong rượu vang 6

Hình 2.4: Cấu trúc phân tử của acid tannic 8

Hình 2.5: Các kỹ thuật cơ bản để cố định tế bào 11

Hình 2.6: Cấu trúc của alginate 18

Hình 2.7: Cơ chế tạo gel của alginate theo phương pháp tạo gel từ bên ngoài 19

Hình 2.8: Cơ chế tạo gel của alginate theo phương pháp tạo gel từ bên trong 20

Hình 2.9: Con đường hình thành các chất tạo hương vị cho rượu vang 28

Hình 2.10: Hàm lượng ethanol (P) thay đổi theo thời gian ứng với các nồng độ cơ chấtkhác nhau 31

Hình 2.11: Tốc độ sử dụng glucose cực đại và tốc độ tạo thành ethanol cực đại khi hàmlượng đường thay đổi 31

Hình 2.12: Sự thay đổi hàm lượng đường theo thời gian 32

Hình 2.13: Sự sử dụng glucose trong suốt quá trình lên men 33

Hình 2.14: Khả năng tạo cồn của nấm men trong suốt quá trình lên men 33

Hình 2.15: Aûnh hưởng của pH đến tốc độ lên men của nấm men cố định và nấm men tựdo 35

Hình 2.16: Aûnh hưởng của pH đến khả năng sống sót của nấm men cố định 35

Hình 2.17: Aûnh hưởng của pH đến hàm lượng cồn tạo thành trong suốt quá trình lên men 36

Hình 2.18: Aûnh hưởng của hàm lượng SO2 đến quá trình lên men rượu vang trắng 37

Hình 2.19: Aûnh hưởng của SO2 đến hàm lượng cồn tạo thành trong suốt quá trình lên men 38

Hình 2.20: Aûnh hưởng của tannin đến hàm lượng cồn tạo thành trong suốt quá trình lênmen 39

Hình 2.21: Aûnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hàm lượng cồn tạo thành trong suốt quátrình lên men 40

Hình 2.22: Aûnh hưởng của nhiệt độ đến động học quá trình lên men rượu vang sử dụngnấm men cố định trên DCM và nấm men tự do 41

Trang 8

Hình 2.23: Sự chuyển hóa acid malic bởi nấm men tự do và nấm men

Schizosaccharomyces pombe cố định khi sử dụng các hàm lượng đường ban đầu khác nhau.

Hình 2.24: Động học của quá trình lên men rượu vang ở những nhiệt độ khác nhau sửdụng nấm men cố định trên gluten 46

Chương 3: NGUYÊN LIỆU và PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 51

Hình 3.1: Quy trình ép nho 51

Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cứu 53

Hình 3.3: Quy trình cố định nấm men trong gel alginate bằng phương pháp tạo gel từ bênngoài 54

Chương 4: KẾT QUẢ và BÀN LUẬN 66

Hình 4.1: Sự thay đổi mật độ tế bào nấm men trong quá trình lên men rượu vang, sử dụngnấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổitrong khoảng 200 – 360g/L) 67

Hình 4.2: Sự thay đổi tốc độ sinh trưởng riêng của nấm men trong quá trình lên men rượuvang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đườngban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L) 68

Hình 4.3: Sự thay đổi nồng độ chất khô trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấmmen tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổitrong khoảng 200 – 360g/L) 70

Hình 4.4: Sự thay đổi hàm lượng đường trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấmmen tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổitrong khoảng 200 – 360g/L) 71

Hình 4.5: Sự thay đổi tốc độ sử dụng đường trong quá trình lên men rượu vang, sử dụngnấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổitrong khoảng 200 – 360g/L) 72

Hình 4.6: Sự thay đổi tốc độ sử dụng đường riêng trong quá trình lên men rượu vang, sửdụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầuthay đổi trong khoảng 200 – 360g/L) 73

Hình 4.7: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sử dụng đường trung bìnhtrong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gelalginate 76

Hình 4.8: Sự thay đổi hàm lượng nitơ amin tự do trong quá trình lên men rượu vang, sửdụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầuthay đổi trong khoảng 200 – 360g/L) 78

Trang 9

Hình 4.9: Sự thay đổi hàm lượng nitơ ammonium trong quá trình lên men rượu vang sử

dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầuthay đổi trong khoảng 200 – 360g/L) 79

Hình 4.10: Sự thay đổi hàm lượng cồn trong trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng

nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổitrong khoảng 200 – 360g/L) 80

Hình 4.11: Sự thay đổi tốc độ sinh tổng hợp cồn trong trong quá trình lên men rượu vang,

sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầuthay đổi trong khoảng 200 – 360g/L) 82

Hình 4.12: Sự thay đổi tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng trong trong quá trình lên men rượu

vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đườngban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L) 83

Hình 4.13: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn trung

Hình 4.14: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến hiệu suất sinh tổng hợp cồn

Hình 4.15: Sự thay đổi pH trong trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự

do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trongkhoảng 200 – 360g/L) 86

Hình 4.16: Sự thay đổi hàm lượng acid tổng trong trong quá trình lên men rượu vang sử

Hình 4.17: Sự thay đổi hàm lượng acid dễ bay hơi trong quá trình lên men rượu vang sử

Hình 4.18: Sự thay đổi mật độ tế bào nấm men trong quá trình lên men rượu vang, sử

dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầuthay đổi trong khoảng 1,8 – 17,8g/L) 91

Hình 4.19: Sự thay đổi tốc độ sinh trưởng riêng của nấm men trong quá trình lên men rượu

vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng tanninban đầu thay đổi trong khoảng 1,8 – 9,8g/L) 92

Hình 4.20: Sự thay đổi tốc độ sinh trưởng riêng của nấm men trong quá trình lên men rượu

vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate khi hàm lượng tanninban đầu là 17,8g/L 93

Trang 10

Hình 4.21: Sự thay đổi nồng độ chất khô trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm

men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổitrong khoảng 1,8 – 17,8g/L) 94

Hình 4.22: Sự thay đổi hàm lượng đường trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm

Hình 4.23: Sự thay đổi tốc độ sử dụng đường trong quá trình lên men rượu vang sử dụng

nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổitrong khoảng 1,8 – 17,8g/L) 96

Hình 4.24: Sự thay đổi tốc độ sử dụng đường riêng trong quá trình lên men rượu vang sử

Hình 4.25: Ảnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sử dụng đường trung bình

Hình 4.26: Sự thay đổi hàm lượng nitơ amin tự do trong quá trình lên men rượu vang, sử

Hình 4.27: Sự thay đổi hàm lượng nitơ ammonium trong quá trình lên men rượu vang sử

Hình 4.28: Sự thay đổi hàm lượng cồn trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm

Hình 4.29: Sự thay đổi tốc độ sinh tổng hợp cồn trong quá trình lên men rượu vang sử

dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate khi hàm lượng tannin ban đầuthay đổi trong khoảng 1,8 – 17,8g/L 103

Hình 4.30: Sự thay đổi tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng trong quá trình lên men rượu vang

sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầuthay đổi trong khoảng 1,8 – 17,8g/L) 104

Hình 4.31: Aûnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn trung

Hình 4.32: Aûnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến hiệu suất sinh tổng hợp cồn

Trang 11

Hình 4.33: Sự thay đổi pH trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và

nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi trong khoảng 1,8

– 17,8g/L) 107

Hình 4.34: Sự thay đổi hàm lượng acid tổng trong quá trình lên men rượu vang sử dụng

nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổitrong khoảng 1,8 – 17,8g/L) 108

Hình 4.35: Sự thay đổi hàm lượng acid dễ bay hơi trong quá trình lên men rượu vang, sử

Trang 12

Danh mục một số thuật ngữ và chữ viết tắt

 ADH : enzyme alcohol dehydrogenase CD : Nấm men cố định

 DCM : Delignified Cellulosic Material DEAE-cellulose : diethylaminoethyl-cellulose  EEFA : ethyl ester fatty acid

 FGB : freeze-dried gluten supported biocatalyst, là tế bào cố định sấythăng hoa.

 Ffdc : free freeze-dried cells, là tế bào tự do sấy thăng hoa.

 NS: non-Saccharomyces, là những loài nấm men không thuộc giống Saccharomyces.

 TD: Nấm men tự do

 WGB : wet gluten supported biocatalyst, là tế bào cố định chưa qua sấy  : Tốc độ sinh trưởng riêng tức thời của tế bào, là tốc độ sinh trưởng tính trên một

đơn vị tế bào tại một thời điểm nhất định Đơn vị: h-1

 max : Tốc độ sinh trưởng riêng cực đại của tế bào, là tốc độ sinh trưởngriêng lớn nhất trong toàn bộ quá trình lên men Đơn vị: h-1

 gS : Tốc độ sử dụng đường tức thời của nấm men, là hàm lượng đường mà nấm mensử dụng trong một đơn vị thời gian Đơn vị: g/L/h

 gSmax : Tốc độ sử dụng đường cực đại của nấm men, là tốc độ sử dụngđường lớn nhất trong toàn bộ quá trình lên men Đơn vị: g/L/h

 S : Tốc độ sử dụng đường riêng tức thời của nấm men, là tốc độ sử dụng đường tínhtrên một đơn vị tế bào tại một thời điểm nhất định Đơn vị: g/h/1012

tế bào

 Smax : Tốc độ sử dụng đường riêng cực đại của nấm men, là tốc độ sử dụngđường riêng lớn nhất trong toàn bộ quá trình lên men Đơn vị:g/h/1012 tế bào

  : Tổng thời gian lên men, được xác định từ độ lên men Đơn vị: h

 KS : Tốc độ sử dụng đường trung bình, là hàm lượng đường trung bình được nấm mensử dụng trong một đơn vị thời gian lên men Đơn vị: g/L/h

 gP : Tốc độ sinh tổng hợp cồn tức thời của nấm men, là hàm lượng cồn mà nấm mensinh tổng hợp được trong một đơn vị thời gian Đơn vị: g/L/h

 gpmax : Tốc độ sinh tổng hợp cồn cực đại của nấm men, là tốc độ sinh tổnghợp cồn lớn nhất trong toàn bộ quá trình lên men Đơn vị: g/L/h

Trang 13

 P : Tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng tức thời của nấm men, là tốc độ sinh tổng hợp cồntính trên một đơn vị tế bào tại một thời điểm nhất định Đơn vị: g/h/1012 tế bào

 Pmax : Tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng cực đại của nấm men, là tốc độ sinhtổng hợp cồn riêng lớn nhất trong toàn bộ quá trình lên men Đơn vị:g/h/1012 tế bào

 KP : Tốc độ sinh tổng hợp cồn trung bình, là hàm lượng cồn trung bình được nấm mensinh tổng hợp trong một đơn vị thời gian lên men Đơn vị: g/L/h  : Hiệu suất sinh tổng hợp cồn, là số mol ethanol được tạo thành từ một mol glucose

được nấm men sử dụng Đơn vị: mol ethanol/ mol glucose.

Trang 14

Chương 1: GIỚI THIỆU

Như chúng ta đã biết, rượu vang là một trong những sản phẩm lên men có lịch sử lâuđời nhất Theo các tài liệu cổ, rượu vang có xuất xứ từ các nước Ả Rập vào khoảng thế kỷ18 hay 19 trước Công nguyên và cho đến nay, rượu vang đã trở nên phổ biến khắp nơi trênthế giới Rượu vang được ưa thích trước hết là do hương vị hết sức đặc trưng mà khôngloại sản phẩm nào có thể thay thế, sau đó là do nó đem lại cảm giác sảng khoái và sứckhỏe cho người uống.

Đầu tiên, rượu vang được tạo ra bằng quá trình lên men tự phát Sau đó, người ta đã

tiến hành phân lập các chủng nấm men và cấy vào dịch lên men loài Saccharomyces

cerevisiae thuần thiết để thúc đẩy quá trình lên men và tăng chất lượng của rượu vang.

Tuy nhiên, việc sử dụng nấm men tự do để lên men có khá nhiều nhược điểm: Thời gian lên men dài, năng suất lên men thấp.

 Tiêu tốn nhiều năng lượng để tách nấm men ra khỏi rượu vang sau quá trình lênmen.

 Khả năng tái sử dụng nấm men rất thấp. Khó tự động hóa quá trình lên men.

Để khắc phục các nhược điểm này, nhiều nghiên cứu về việc sử dụng nấm men cốđịnh trong sản xuất rượu vang đã được thực hiện Các nghiên cứu này đều cho thấy nấmmen cố định có nhiều ưu điểm hơn hẳn so với nấm men tự do:

 Tăng tốc độ sử dụng cơ chất, rút ngắn thời gian lên men.

 Ổn định hoạt tính của nấm men Các chất mang cố định có tác dụng như là một tácnhân bảo vệ tế bào chống lại những ảnh hưởng bất lợi của pH, nhiệt độ, dung môi và ngaycả các kim loại nặng.

 Dễ dàng tách nấm men ra khỏi sản phẩm sau quá trình lên men, do đó làm giảmchi phí về thiết bị và năng lượng.

 Có thể tái sử dụng nấm men nhiều lần.

 Tạo điều kiện thuận lợi cho việc tối ưu hóa và tự động hóa quá trình lên men.Các nghiên cứu trước đây về ứng dụng nấm men cố định trong sản xuất rượu vang chủyếu khảo sát quá trình sử dụng đường, quá trình sinh tổng hợp cồn và sự hình thành cáchợp chất hương mà ít đề cập đến động học quá trình sinh trưởng của nấm men, quá trìnhsử dụng các hợp chất nitơ cũng như sự chuyển hóa của các acid hữu cơ trong suốt quá trìnhlên men chính Chúng tôi cũng tìm thấy rất ít các nghiên cứu về ảnh hưởng của một sốyếu tố công nghệ trong quá trình sản xuất đến động học quá trình lên men rượu vang sửdụng nấm men cố định như ảnh hưởng của hàm lượng tannin, hàm lượng SO2 trong dịchnho ban đầu Tuy nhiên, các nghiên cứu này cũng chỉ khảo sát quá trình sinh tổng hợp cồn

Trang 15

mà chưa khảo sát một cách toàn diện ảnh hưởng của các yếu tố này đến tất cả các mặttrong quá trình lên men chính.

Trên cơ sở đó, chúng tôi đề xuất đề tài nghiên cứu “Khảo sát ảnh hưởng của các yếutố công nghệ đến động học quá trình lên men rượu vang nho sử dụng nấm men cố định”.Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của 4 yếu tố công nghệ, bao gồm: pH, hàm lượngđường, hàm lượng SO2 và hàm lượng tannin ban đầu Tuy nhiên, trong phạm vi bài luậnvăn này, tôi chỉ xin trình bày sư ảnh hưởng của 2 yếu tố là hàm lượng đường và hàm lượngtannin ban đầu Kết quả về sự ảnh hưởng của pH và hàm lượng SO2 trong dịch nho đếnquá trình lên men sẽ do một bạn khác trình bày.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chất mang là alginate - một polysaccharidethu được từ rong mơ phân bố dọc theo bờ biển miền Trung của Việt Nam Chúng tôi lầnlượt khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường và hàm lượng tannin ban đầu đến các vấnđề sau:

 Động học quá trình sinh trưởng của nấm men.

 Động học quá trình sử dụng cơ chất: đường khử, nitơ amin và nitơ vô vơ

 Động học quá trình hình thành sản phẩm: do thời gian hạn hẹp và chưa có điều kiệnvề kinh phí nên trong phạm vi bài luận văn này, chúng tôi chỉ trình bày sản phẩmquan trọng nhất của quá trình lên men là cồn mà chưa trình bày các hợp chất hương.Và chúng tôi cũng khảo sát thêm sự chuyển hóa của các acid hữu cơ trong suốt quátrình lên men chính.

Trang 16

Chương 2: TỔNG QUAN

2.1 TỔNG QUAN VỀ RƯỢU VANG, NHO VÀ NẤM MEN DÙNGTRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG

Rượu vang nho là sản phẩm thu được bằng con đường lên men cồn từ dịch nho Rượuvang nho có thể được sản xuất từ một giống nho riêng biệt, hoặc từ hỗn hợp hai hay bagiống nho khác nhau Vì vậy sản phẩm vang nho có số lượng và chủng loại rất phong phú,đa dạng Về mặt công nghệ, sản phẩm vang nho được chia ra thành hai nhóm lớn [1]:

 Nhóm rượu vang không có gas Nhóm rượu vang có gas

Do quá trình lên men, thành phần của rượu vang khác với thành phần của dịch nhoban đầu (bảng 2.1) [199].

Bảng 2.1: Thành phần của dịch nho và rượu vang thông thường [199]

Hợp chất% trong dịch nho % trong rượu vang

Acid hữu cơ

(tartaric, malic và một ít lactic, succinic, oxalic,…) 0,9 0,6Khoáng

(potassium, calcium và một ít sodium, magnesium,iron,…)

Các hợp chất chứa nitơ

Các hợp chất hương

(các ester như là ethyl caproate, ethyl butyrate,…) Vết Vết

Trang 17

2.1.2.1Phân loại

Phân loại khoa học của nho [217]: Giới (regnum) : Plantae

 Ngành (divisio) : Magnoliophyta

 Lớp (class) : Magnoliopsida

 Bộ (ordo) : Vitales

 Họ (familia) : Vitaceae

 Chi (genus): Vitis

Trong đó, loài Vitis vinifera là thích hợp nhất để sản xuất rượu vang vì loài này

chứa [216]:

 Hàm lượng các chất dinh dưỡng cao, cần thiết cho sự phát triển của nấm men vang. Hàm lượng acid khá cao, đủ để ức chế sự phát triển của các vi sinh vật không mong

muốn trong và sau quá trình lên men.

 Hàm lượng đường đủ để tạo ra hàm lượng cồn cao, nhờ đó ức chế được các vi sinhvật gây hư hỏng trong rượu vang.

 Các hợp chất hương với thành phần và lượng thích hợp, vì thế rượu vang tạo thànhcó tính chất cảm quan tốt.

Dựa vào nguồn gốc giống nho, có thể chia thành 2 nhóm cơ bản là [1] :

 Nho trắng: trái nho khi chín vỏ không có màu hoặc màu vàng lục nhạt.

 Nho đỏ: trái nho khi chín vỏ có màu đỏ – tím ở những mức độ khác nhau (Hình 2 1).

Hình 2.1: Nho xanh (a) và nho đỏ (b, c)

Trang 18

2.1.2.2Thành phần hóa học

Thành phần hóa học của nho thay đổi theo giống, độ chín, thời vụ thu hoạch, điều kiệnđất đai, khí hậu, kỹ thuật canh tác … Thành phần cơ bản của nho được nêu ra như trongbảng 2.1.

Một số các hợp chất quan trọng trong nho và rượu vang:

Thông thường dịch nho để sản xuất rượu vang chứa 16 – 26% (w/v) đường Trong nhokhô và trong nho thu hoạch trễ, hàm lượng đường có thể lên tới trên 30% (w/v) Dịch nhocô đặc với hàm lượng đường 35oBx được sử dụng để sản xuất rượu vang có hàm lượng cồncao (Buescher và cộng sự, 2001) Khi đó độ lên men đạt khoảng 86 – 87% Hàm lượngđường cao có thể ảnh hưởng đến khả năng lên men của nấm men [129].

Dịch nho trước khi lên men thường chứa tỷ lệ cân bằng của glucose và fructose Trong

suốt quá trình lên men, tất cả các chủng Saccharomyces cerevisiae đều ưu tiên sử dụng

glucose hơn là fructose Hàm lượng ethanol cao có tác động ức chế mạnh sự sử dụngfructose hơn là glucose Trong khi đó, bổ sung nitơ vào dịch nho sẽ kích thích sự sử dụngfructose hơn là glucose [26, 49]

Các hợp chất nitơ rất cần cho sự phát triển và trao đổi chất của nấm men Trong sốcác chất dinh dưỡng mà nấm men có thể sử dụng được trong suốt quá trình lên men dịchnho, về số lượng, nitơ là thành phần quan trọng thứ hai sau các hợp chất carbon Có nhiềuhợp chất chứa nitơ có mặt trong dịch nho, với hàm lượng thay đổi từ 60 – 2400mg/L [85].

Saccharomyces cerevisiae có khả năng sử dụng các nguồn nitơ khác nhau để phát

triển, nhưng không phải tất cả các nguồn nitơ đều hỗ trợ phát triển tốt như nhau Cácnguồn nitơ tốt là ammonium, glutamine và asparagine, trong khi đó proline và urea đượcxem như là những nguồn nitơ kém chất lượng [24, 85]

Tất cả các hợp chất chứa nitơ tích lũy trong dịch nho bị biến đổi thành một trong haisản phẩm cuối là ammonium hoặc glutamate (Hình 2 2) Glutamate cùng với glutamineđóng một vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi nitơ của nấm men Từ 2 amino acidnày tất cả các hợp chất chứa nitơ trong tế bào được tạo ra [85].

Acid hữu cơ

Trong nho và rượu vang, 6 acid chiếm thành phần chính là acid tartaric, acid malic,acid citric, acid lactic, acid succinic và acid acetic (Hình 2 3, bảng 2.2) Trong đó, acidacetic là hợp chất dễ bay hơi còn các acid khác là acid không bay hơi.

Độ phân ly của các acid này giảm theo thứ tự sau: acid citric, acid tartaric, acid malic,acid succinic, acid lactic, và acid acetic.

Trang 19

Hình 2.2: Cơ chế của quá trình biến đổi các hợp chất nitơ bởi nấm men [85]

Hình 2.3: Các acid không bay hơi trong rượu vang: a) acid citric, b) acid tartaric, c) acid malic, d)

acid succinic, e) acid lactic

Bảng 2.2: Thành phần các một số acid hữu cơ chính trong dịch nho đỏ và rượu vang đỏ [167]

Acid hữu cơDịch nho đỏ Rượu vang đỏAcid citric

Acid tartaricAcid malicAcid succinicAcid lacticAcid acetic

0,25 – 0,35g/L4,07 – 7,65g/L1,99 – 2,91g/LRất ít

Rất ítRất ít

0,17 – 0,40g/L2,60 – 5,7g/L0,06 – 3,13g/L0,48 – 1,22g/L0,07 – 4,89g/L0,30 – 1,44g/L

Trang 20

Sulfur dioxide được sử dụng rộng rãi trong rượu vang như là một chất chống oxy hóa,tác nhân kháng khuẩn và đồng thời cũng là tác nhân cho việc chọn lọc các loài hoặcchủng có thể phát triển và đóng góp vào quá trình lên men Trong rượu vang, SO2 tồn tại ở2 dạng: tự do và liên kết Nhưng chỉ SO2 tự do mới có tính khử và diệt khuẩn Mặc dù vậy,một vài dạng SO2 liên kết có thể chuyển hóa thành SO2 tự do và có thể bù lại cho lượngSO2 bị giảm trong quá trình lên men Vì thế, SO2 là một thông số quan trọng ảnh hưởngđến động học quá trình lên men và chất lượng rượu vang [22, 30, 48, 58, 63, 79, 90, 143].

Bên cạnh đó, SO2 còn có ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men rượu vang: dẫn tới kéodài thời gian lên men hoặc quá trình lên men kết thúc khi hàm lượng đường sót còn cao,và ảnh hưởng đến tính chất cảm quan của rượu vang [48, 81].

Trong các thập kỷ qua, thành phần polyphenolic được quan tâm do nó ảnh hưởng đếngiá trị cảm quan của rượu vang (màu sắc và mùi vị) và các giá trị dinh dưỡng khác (theoquan điểm về y học, tannin được xem là chất chống oxi hóa, chống khối u và bệnh mạchvành) [64, 31, 51, 165, 80, 174, 29, 99, 157]

Tannin xuất phát từ chữ “tanning” có nghĩa là thuộc da vì tannin có khả năng phảnứng và kết tủa với các protein có trong da động vật [87] Tannin có ở 2 dạng là tanninngưng tụ và tannin thủy phân [216]:

 Tannin thủy phân: có nguồn gốc từ các acid phenolic như là acid gallic và acidellagic.

 Tannin ngưng tụ: là polymer của flavan-3-ol (epicatechin, catechin vàgallocatechin) và flavan-3,4-diol.

Tannin có ở trong nho và rượu vang chủ yếu là các tannin ngưng tụ [216].

Tannin có thể được thêm vào rượu vang dưới dạng acid tannic (Hình 2 4) để phảnứng và kết tủa với protein và để cải thiện độ trong của rượu vang Trong suốt quá trình ủ,sự thay đổi hàm lượng tannin ngưng tụ sẽ ảnh hưởng đến màu sắc và tính chất cảm quancủa rượu vang, và khi đó, khối lượng phân tử của tannin có thể tăng lên [216].

2.1.2.3Tình hình trồng nho trên thế giới và ở Việt Nam

Theo số liệu của FAO, 75.866km² đất trên thế giới được dùng để trồng nho Khoảng71% sản lượng nho được dùng sản xuất rượu vang, 27% được dùng để ăn dưới dạng quảtươi và 2% được sử dụng làm nho khô [217].

Khác với các loại trái cây khác của Việt Nam, nho là loại trái cây được du nhập từ cácnước trên thế giới vào Việt Nam từ những năm 1960 Nho trồng tập trung chủ yếu ở NinhThuận và Bắc Bình Thuận với diện tích khoảng 2.500 – 7.000 ha Đặc biệt tại vùng NinhThuận, cây nho rất có tiềm năng, năng suất khá cao, trên một hecta có thể thu được 30 -40 tấn mỗi năm Giống nho đầu tiên được trồng là giống nho đỏ ăn tươi Red Cardinal Chotới bây giờ, đây vẫn là giống nho chủ lực do sản lượng tương đối cao Giống này tồn tại

Trang 21

trên 30 năm Trước năm 2000, giống này chiếm 100% diện tích trồng nho tại Việt Nam,nhưng hiện nay chỉ chiếm khoảng 80% Giống nho xanh NH01 – 48 được nhập từ TháiLan từ năm 1997 chiếm gần 20% diện tích trồng nho hiện nay Ngoài ra, chúng ta cũng cómột số giống mới nhập khác nhưng chỉ chiếm một diện tích trồng rất nhỏ [215].

Hình 2.4: Cấu trúc phân tử của acid tannic

Nấm men là vi sinh vật quan trọng, kiểm soát quá trình lên men cồn trong sản xuấtrượu vang Nấm men trong quá trình lên men rượu vang có thể có từ 3 nguồn gốc khácnhau: bề mặt trái nho, bề mặt thiết bị và từ canh trường được cấy vào Thành phần và chấtlượng của rượu vang có liên quan chặt chẽ đến nấm men Trong quá trình lên men, bêncạnh các sản phẩm chính là ethanol và CO2, nấm men tạo thành nhiều sản phẩm phụ, vídụ như glycerol, acid acetic, acid succinic và đặc biệt là các hợp chất hương, góp phầnđáng kể vào chất lượng của rượu vang [9, 89, 92, 151, 163].

2.1.3.1Phân loại

Nấm men có thể được phân thành 2 nhóm:

 Thứ nhất gọi là non-Saccharomyces (NS – là những loài nấm men không thuộcgiống Saccharomyces), thường xuất hiện trên bề mặt của trái nho cùng với nhiều

loại vi sinh vật khác Hầu hết các loài NS không có khả năng tồn tại khi nồng độ

cồn cao hơn 6%v/v (ngoại trừ Brettanomyces bruxellensis có thể phát triển trong

môi trường có nồng độ cồn lên đến 12%) Trước đây, nấm men NS được xem là cácvi sinh vật gây hư hỏng Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng, một

Trang 22

số loài nấm men NS có lợi cho chất lượng rượu vang, giúp tăng cường hương vị củarượu vang [23, 41, 42, 45, 149, 166, 207].

 Nhóm khác góp phần vào hương vị rượu vang, cũng là nhân tố chính của quá trình

lên men cồn là các loài thuộc giống Saccharomyces Saccharomyces có khả năng

chịu đựng sự thay đổi của điều kiện môi trường với nồng độ ethanol và acid hữu cơtăng và sự cạn kiệt chất dinh dưỡng (Pretorius, 2000) Như vậy, mặc dù có nhiều

giống và loài nấm men trong dịch nho, nhưng giống Saccharomyces, mà chủ yếu làloài Saccharomyces cerevisiae mới là loài đảm nhiệm việc thực hiện các quá trìnhchuyển hóa sinh học quan trọng trong lên men vang Chính vì thế, Saccharomyces

cerevisiae còn được gọi là “nấm men vang” [58, 85, 92, 149, 166, 199]

2.1.3.2Trình tự lên men của các giống nấm men trong quá trìnhlên men vang

Quá trình lên men rượu vang có thể được tiến hành một cách tự nhiên mà không cầncấy giống hoặc bằng cách cấy vào dịch nho các nấm men vang chọn lọc Việc lên mendịch nho được thực hiện bởi một hệ vi sinh vật phức tạp, trong đó các chủng nấm men pháttriển và chết tùy theo sự thích nghi của chúng đối với môi trường Tương tác nấm men-nấm men xảy ra trong suốt quá trình sản xuất rượu vang ngay từ khi bắt đầu quá trình lênmen cồn Trong quá trình lên men tự nhiên, các nấm men có mặt trong nho nguyên liệu

như là Kloeckera apiculata, Hansenula, Hanseniaspora uvarum, Pichia và Candida spp.

khởi đầu quá trình lên men cồn từ dịch nho Các nấm men này chết dần khi hàm lượng

cồn tăng, chỉ còn lại Saccharomyces cerevisiae có khả năng chịu được hàm lượng cồn cao

tiếp tục quá trình lên men cho đến khi kết thúc Sự chuyển biến này rất quan trọng vì các

chủng non-Saccharomyces thường tạo ra các hợp chất không mong muốn như rượu bậc

cao, acid acetic và acetaldehyde Sự biến mất hoặc giảm mật độ của giống

non-Saccharomyces có thể là do khả năng chịu đựng cồn thấp, hoặc bị ức chế bởi các chất diệt

men (acid béo mạch ngắn và trung bình, glycoprotein,…) hoặc do hàm lượng oxy vànitrogen còn lại thấp Các quá trình lên men có kiểm soát thường được thực hiện bằng

cách cấy canh trường Saccharomyces cerevisiae thuần khiết, nhờ đó quá trình lên men

diễn ra nhanh hơn và có thể tạo ra rượu vang với hương vị đặc trưng [25, 42, 44, 46, 48, 61,84, 85, 89, 90, 92, 122, 139, 149, 151, 161, 163, 166]

Tuy nhiên, theo nhiều tác giả thì khi có các loài nấm men non-Saccharomyces phát

triển trong rượu vang với một mức độ vừa phải, hương vị của rượu vang sẽ phong phú hơn

và được ưa thích nhiều hơn so với rượu vang chỉ được lên men từ giống Saccharomyces

2.1.3.3Chỉ tiêu chọn lựa nấm men vang

Ngoài vai trò quan trọng của nấm men vang là xúc tác việc chuyển hóa hoàn toàn vàcó hiệu quả đường thành cồn mà không tạo ra các hương vị không mong muốn thì ngày

nay, do yêu cầu ngày càng cao, canh trường Saccharomyces cerevisiae cần phải có nhiều

đặc tính khác, như liệt kê trong bảng 2.3 [85] Tuy nhiên, để có thể kiểm tra hết tất cả cácchỉ tiêu này thì tốn rất nhiều thời gian Regodon và cộng sự (1997) đã đưa ra một phương

Trang 23

pháp đơn giản và hiệu quả để chọn lựa nấm men vang dùng trong sản xuất công nghiệpdựa trên các tính chất công nghệ của nấm men vang Phương pháp này chỉ bao gồm 2bước [164]:

 Bước thứ nhất là bước chọn lọc sơ bộ dựa trên khả năng chịu đựng đối với SO2, cácloài có hại, khả năng phát triển tại nhiệt độ cao và sự tạo bọt thấp.

 Bước thứ hai là bước chọn lọc chính thức dựa trên hàm lượng acid dễ bay hơi vàethanol tạo thành cũng như hàm lượng đường sót còn lại trong rượu vang.

Bảng 2.3: Các đặc tính mong muốn của nấm men vang [85]Đặc tính lên men

Thích nghi với quá trình lên men nhanhTốc độ sử dụng cơ chất và tốc độ hình thành sản phẩm cao

Khả năng chịu cồn cao

Khả năng chịu áp suất thẩm thấu caoSinh khối tạo thành vừa phải

Các tính chất về hương vị

Tạo thành ít sulphite/DMS/thiolTạo thành ít acid dễ bay hơiTạo thành ít rượu bậc cao

Giải phóng ra các tiền chất hương glycosylateHoạt tính esterase thấp

Đặc tính công nghệ

Tính ổn định cao về mặt di truyềnKhả năng chịu sulphite caoÍt liên kết với sulphiteÍt tạo bọt

Có khả năng kết bôngKết lắng cặn nhanhNhu cầu nitơ thấp

Các đặc tính trao đổi chất có liên quan đến sức khỏe con người

Tạo thành ít sulphite

Tạo thành ít biogenic amine

Tạo thành ít ethyl carbamate (urea)

2.1.3.4Kết hợp các giống nấm men và sử dụng kỹ thuật ditruyền trong sản xuất rượu vang

Theo nghiên cứu của Renouf và cộng sự (2006), việc sử dụng kết hợp Saccharomycescerevisiae và Brettanomyces bruxellensis sẽ rút ngắn thời gian lên men do Brettanomycesbruxellensis có khả năng chuyển hóa glucose và fructose thành ethanol và chịu được hàm

lượng cồn cao Còn kết hợp giữa Saccharomyces cerevisiae và Candida stellata sẽ làm

tăng hàm lượng glycerol, tăng tốc độ lên men và chất lượng rượu vang [41, 42, 44, 166,194].

Trong những năm gần đây, kỹ thuật di truyền đã được ứng dụng để cải thiện các đặctính của nấm men vang:

 Shinohara và cộng sự (1994) đã nghiên cứu việc chọn lọc và lai giống các chủngnấm men vang để cải thiện tốc độ lên men, tăng khả năng chịu đựng đối với SO2 vàlàm tăng chất lượng rượu vang [178]

 Serra và cộng sự (2005) đã nghiên cứu việc lai tạo giữa Saccharomyces cerevisiaevà Saccharomyces bayanus var uvarum để kết hợp ưu điểm của 2 loài này, làm tăng

chất lượng sản phẩm trong sản xuất rượu vang có hàm lượng acid thấp (pH cao)[175].

Trang 24

2.2 CỐ ĐỊNH NẤM MEN

2.2.1.1Khái niệm

Kỹ thuật cố định tế bào được định nghĩa là: “Kỹ thuật bao bọc hoặc định vị các tế bàocòn nguyên vẹn lên một “vùng không gian nhất định” nhằm bảo vệ các hoạt tính xúc tácmong muốn” (Karel và cộng sự, 1985) [113].

Cố định thường là sự bắt chước các hiện tượng xảy ra trong tự nhiên do các tế bào cóthể phát triển trên bề mặt hoặc bên trong các cấu trúc của nguyên liệu có trong tự nhiên[113].

2.2.1.2Các kỹ thuật cố định tế bào

Các kỹ thuật cố định tế bào có thể được chia làm 4 nhóm chính như trong bảng 2.4 vàHình 2 5.

Trang 25

Hình 2.5: Các kỹ thuật cơ bản để cố định tế bào [113]

Trang 26

Bảng 2.4: So sánh các kỹ thuật cố định tế bào (còn nữa)

Cố định trên bềmặt chất mang rắn

Nhốt trong khungmạng xốp

Keo tụ tế bào(tạo hạt)

Nhốt bằngphương pháp cơ

học bên trongmột màng chắnNguyên

Dựa vào lực hấpphụ vật lý, liên kếttĩnh điện hoặc liênkết cộng hóa trị[113, 185].

Đưa tế bào vào bêntrong một mạng cứngđể ngăn cản tế bàokhuếch tán vào môitrường xung quanh,trong khi vẫn cho phépsự vận chuyển cácchất dinh dưỡng và sựtrao đổi chất diễn ra[113].

Làm gia tăngkích thước củakhối tế bào để dễdàng sử dụngtrong các bìnhphản ứng Có thểlà keo tụ tự nhiênhoặc là keo tụnhân tạo bằngcách tạo thànhcác liên kếtngang [113].

Phương pháp nàycó thể được thựchiện theo 2 cách[113]:

5 Không ảnhhưởng đến quá trìnhtruyền khối [185,138].

6 Diện tích tiếp

xúc giữa tế bào cốđịnh và chất manglớn hơn so với cáckỹ thuật khác [138].

7 Có thể đạt được

mật độ tế bào trongmột đơn vị thể tíchchất mang cao hơn sovới canh trường vi sinhvật tự do [138].

8 Chất mang có tác

dụng bảo vệ tế bàochống lại thực khuẩnhoặc tế bào ngoại lạicũng như những điềukiện gây stress [138].

9 Đơn giản, dễ

thực hiện.

10. Khôngảnh hưởng đếnquá trình truyềnkhối.

Canh trường lênmen không bị lẫntế bào, do đó sảnphẩm tạo thành cóthể không cần lọc[113, 138].

Do không có màngchắn giữa các tếbào và dung dịchcho nên các tế bàodễ bị tách ra, làmtăng hàm lượng tếbào tự do trongdung dịch [113, 40].

11. Khi tế bàotăng quá nhiều sinhkhối sẽ làm giảm độbền của mạng gel [39].

12. Tế bào trên bềmặt dễ thoát ra khỏimạng gel và phát triểntrong môi trường nhưlà các tế bào tự do[113, 39].

13. Do khôngcó màng chắngiữa các tế bàovà dung dịch chonên các tế bàodễ bị tách ra, làmtăng hàm lượngtế bào tự do trongdung dịch.

Khảnăngtruyền khối kém[113].

membrane có thểbị bám bẩn do sựhấp phụ cơ chấtlên bề mặt màng[113].

Trang 27

Bảng 2.4: So sánh các kỹ thuật cố định tế bào (tiếp theo)Cố định trên bề

mặt chất mang rắn

Nhốt trong khungmạng xốp

Keo tụ tế bào(tạo hạt)

Nhốt bằngphương pháp cơ

học bên trongmột màng chắnChất

14. Các vật liệucellulose: DEAE-cellulose, gỗ, mùncưa, mùn cưa đãtách lignine, … [113,138]

15. Các vật liệuvô cơ: polygorskite,montmorilonite,hydromica, sứ xốp,thủy tinh xốp, vòngRaschig, silicate,hợp chất titanium, …[113, 138]

16. Polymer tựnhiên [113]:

17. Polysaccharide: alginates, -carrageenan, agar,

polygalacturonic acid.

18. Polymer khác:gelatin, collagen vàpolyvinyl alcohol.

19. Polymer tổnghợp: polyacrylamide,polyurethanevàpolyvinyl chloride[138].

Membrane làmbằng vật liệucellulose acetate,polyamide [138].

2.2.2 Các chất mang cố định nấm men trong sản xuất rượuvang

Kỹ thuật cố định nấm men trong sản xuất rượu vang đã được nghiên cứu rất rộng rãi,tuy nhiên việc ứng dụng kỹ thuật này trong công nghiệp vẫn còn hạn chế Mục đích củaviệc sử dụng nấm men cố định là để cải thiện năng suất sinh ethanol cũng như hương vị vàchất lượng sản phẩm Để có thể ứng dụng thành công trong công nghiệp, chất mang đượcsử dụng để cố định phải đạt được độ an toàn thực phẩm, có nhiều trong tự nhiên, giá thànhthấp và không làm ảnh hưởng đến tính chất cảm quan của rượu vang [111, 113, 130, 155,197].

Nhiều loại chất mang sử dụng để cố định nấm men trong lên men rượu vang đã đượcnghiên cứu và trình bày trong bảng 2.5

Trang 28

Bảng 2.5: Một số chất mang sử dụng để cố định nấm men trong sản xuất rượu vang (còn nữa)

Phân loại chất mangMột số chất mang chínhVi sinh vậtTác giảTài liệu tham khảo

CHẤT MANG KHÔNG CÓ NGUỒN GỐC THỰC PHẨM

Chất mang vô cơ -alumina Saccharomyces cerevisiae Bakoyianis và cộng sự, 1997Kourkoutas và cộng sự, 2003Kourkoutas và cộng sự, 2006Loukatos và cộng sự, 2000

14108105125Hydromica Saccharomyces cerevisiae Ageeva và cộng sự, 19855Kissiris Saccharomyces cerevisiae Argiriou và cộng sự, 1996

Bakoyianis và cộng sự, 1992Bakoyianis và cộng sự, 1997Kourkoutas và cộng sự, 2003Kourkoutas và cộng sự, 2006Loukatos và cộng sự, 2003

111314108105124Montmorilonite Saccharomyces cerevisiae Ageeva và cộng sự, 19855Polygorskite Saccharomyces cerevisiae Ageeva và cộng sự, 19855

Chất mang hữu cơ -carrageenan Saccharomyces cerevisiae Gòdia và cộng sự, 1991Nakanishi và Yokotsuka, 1987Tataridis và cộng sự, 2005

83147193Acid pectic Saccharomyces cerevisiae Nakanishi và Yokotsuka, 1987147

Trang 29

Bảng 2.5: Một số chất mang sử dụng để cố định nấm men trong sản xuất rượu vang (tiếp theo và còn nữa)

Phân loại chất mangMột số chất mang chínhVi sinh vậtTác giảTài liệu tham khảoChất mang hữu cơ Agar Saccharomyces cerevisiae Nakanishi và Yokotsuka, 1987147

Ferraro và cộng sự, 2000 4366

Alginate Saccharomyces cerevisiae Bakoyianis và cộng sự, 1997Colagrande và cộng sự, 1994Ferraro và cộng sự, 2000Fumi và cộng sự, 1987Fumi và cộng sự, 1988Fumi và cộng sự, 1989Gòdia và cộng sự, 1991Mori, 1987

Suzzi và cộng sự, 1996Silva và cộng sự, 2002

Shimobayashi và Tominaga, 1986Tataridis và cộng sự, 2005

Yokotsuka và cộng sự, 1993Yokotsuka và cộng sự, 1997Yokotsuka và cộng sự, 2003

14476570717283145188179177193212214213Alginate Schizosaccharomyces pombe Magyar và cộng sự, 1989

Rosini và Ciani, 1993Silva và cộng sự, 2003Yokotsuka và cộng sự, 1993

126168180212

Trang 31

Bảng 2.5: Một số chất mang sử dụng để cố định nấm men trong sản xuất rượu vang (tiếp theo và còn nữa)

Chất mang hữu cơ Cellulose được bao phủ bởi alginate Saccharomyces cerevisiae Otsuka, 1980153DCM (Delignified Cellulosic Material) Saccharomyces cerevisiae Bardi và Koutinas, 1994

Bardi và cộng sự, 1997Balli và cộng sự, 2003Loukatos và cộng sự, 2003Mallouchos và cộng sự, 2003

172015124135DEAE-cellulose được bao phủ bởi lớp

nhựa trao đổi ion Saccharomyces cerevisiae Lommi và Advenainen, 1990 121Gelatin Saccharomyces cerevisiae Parascandola và cộng sự, 1992154Gluten Saccharomyces cerevisiae Balli và cộng sự, 2003

Bardi và cộng sự, 1996, 1997Iconomopoulou và cộng sự, 2000Loukatos và cộng sự, 2003Mallouchos và cộng sự, 2003

1518, 2093124135Đĩa thủy tinh được bao phủ bởi lớp

màng alginate

Saccharomyces cerevisiae

Schizosaccharomyces pombe Ogbonna và cộng sự, 1989 152

Polyvinyl alcohol Saccharomyces cerevisiae Martynenko và cộng sự, 2003137

Chất mang dạng màng Màng membrane Saccharomyces cerevisiae Takaya và cộng sự, 2002190Màng vi bao sinh học (biocapsule) Saccharomyces cerevisiae Peinado và cộng sự, 2005

Peinado và cộng sự, 2006 155156

Trang 32

Bảng 2.5: Một số chất mang sử dụng để cố định nấm men trong sản xuất rượu vang (tiếp theo)

CHẤT MANG CÓ NGUỒN GỐC THỰC PHẨM

Miếng lê Saccharomyces cerevisiae Kourkoutas và cộng sự, 2005

Mallios và cộng sự, 2004 107130Miếng mộc qua Saccharomyces cerevisiae Kourkoutas và cộng sự, 2002

Kourkoutas và cộng sự, 2003Kourkoutas và cộng sự, 2005

106111107Miếng táo Saccharomyces cerevisiae Kourkoutas và cộng sự, 2001

Kourkoutas và cộng sự, 2002Kourkoutas và cộng sự, 2003Kourkoutas và cộng sự, 2005Kourkoutas và cộng sự, 2006Kourkoutas và cộng sự, 2006

110112108107105109Nho khô Saccharomyces cerevisiae Tsakiris và cộng sự, 2004

Tsakiris và cộng sự, 2004 197196Vỏ nho Saccharomyces cerevisiae Mallouchos và cộng sự, 2002

Mallouchos và cộng sự, 2003Mallouchos và cộng sự, 2003

132131134

Trang 33

2.2.3 Cố định nấm men trong gel alginate

Alginate có khá nhiều trong tự nhiên và có thể xuất phát từ 2 nguồn gốc khác nhau[186]:

 Là thành phần cấu trúc của tảo nâu biển (Phaeophyceae), chiếm đến 40% khối

lượng chất khô.

 Là polysaccharide màng bao trong các loại vi khuẩn đất.

Tuy nhiên tất cả các alginate thương mại hiện nay đều có nguồn gốc từ tảo

Alginate là một copolymer không phân nhánh, bao gồm các monomer mannuronic acid (gọi tắt là M) và -L-guluronic acid (G) liên kết với nhau thông qua liênkết 1,4 – glucoside Các monomer này phân bố trong mạch alginate theo các block (Hình 2 6) [116, 181, 186]:

-D- Block M: gồm các gốc mannuronic acid nối tiếp nhau Block G: gồm các gốc guluronic acid nối tiếp nhau

 Block MG: gồm các gốc mannuronic acid và guluronic acid luân phiên nối với nhau.

Hình 2.6: Cấu trúc của alginate: (a) các monomer của alginate, (b) chuỗi alginate, (c) sự phân bố

các block [186]

Trang 34

2.2.3.2Cơ chế tạo gel

Alginate có khả năng tạo gel khi kết hợp với các cation kim loại hóa trị cao hoặc khiphân tử alginate bị acid hóa Tuy nhiên, phương pháp tạo gel bằng cách acid hóa phân tửalginate ít được dùng vì quy trình thực hiện rất phức tạp [186].

Alginate có khả năng kết hợp nhanh với các cation kim loại hóa trị cao để tạo thànhgel đồng thể Aùi lực của alginate đối với các ion hóa trị 2 khác nhau giảm theo trình tự:Pb2+ > Cu2+ > Cd2+ > Ba2+ > Sr2+ > Ca2+ > Co2+, Ni2+ > Zn2+ > Mn2+ Tùy thuộc vào loại ionliên kết và loại alginate mà gel tạo thành có tính chất khác nhau Thông thường, người tathường sử dụng calcium để làm ion tạo gel [144, 181].

Quá trình tạo gel của alginate theo phương pháp kết hợp với cation kim loại hóa trịcao có thể tiến hành theo 2 phương pháp là phương pháp tạo gel từ bên ngoài và phươngpháp tạo gel từ bên trong [186].

Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel từ bên ngoài

Đây là phương pháp tạo gel phổ biến nhất của alginate Phương pháp này có ưu điểmlà tạo gel nhanh và thao tác rất đơn giản (Hình 2 7).

Khi nhỏ dung dịch alginate vào dung dịch có chứa cation có khả năng tạo gel (thườnggặp nhất là Ca2+), bề mặt ngoài của hạt alginate sẽ lập tức bị gel hóa Tiếp theo đó, cáccation tạo gel ở bên ngoài hạt alginate tiếp tục khuếch tán vào bên trong hạt làm cho cácphân tử alginate bên trong tiếp tục bị gel hóa Quá trình này xảy ra trên bề mặt hạt vàphát triển vào bên trong Phương pháp này tạo gel nhanh, tuy nhiên tính đồng thể của hạtgel lại không cao [100, 186, 193]

Hạt gel Cacium Alginate Na-Alginate

Na-AlginateLực đẩy

Hình 2.7: Cơ chế tạo gel của alginate theo phương pháp tạo gel từ bên ngoài [186]

Trang 35

Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel từ bên trong

Cho các muối có chứa các cation tạo gel ở dạng vô hoạt (Ví dụ: CaCO3, CaSO4,EDTA-Ca, calcium citrate…) vào dung dịch alginate Thay đổi pH của dung dịch về pHacid bằng các tác nhân acid hóa (Ví dụ: D-glucono--lactone (GDL)) Khi đó, do pH giảm,mà độ hòa tan của các muối chứa các cation tạo gel như ở trên lại phụ thuộc vào pH nêncác ion Ca2+ sẽ được giải phóng dần và tham gia vào quá trình tạo gel với alginate (Hình 2 8) Phương pháp này cho hạt gel có tính đồng thể cao hơn hẳn phương pháp khuếch tándo các ion Ca2+ phân bố đồng đều hơn Hơn thế nữa, phương pháp này còn có thể tạo gelvới các hình dạng khác nhau như mong muốn bằng cách cho dung dịch alginate vào khuônthích hợp trước khi quá trình tạo gel diễn ra Trong khi đó, phương pháp tạo gel từ bênngoài thường chỉ tạo thành các hạt có hình cầu [67, 100, 101, 186].

Hình 2.8: Cơ chế tạo gel của alginate theo phương pháp tạo gel từ bên trong [186]

Theo Anders Johansen và James M Flink (1986), khi nấm men được cố định theophương pháp gel từ bên trong, tốc độ lên men cao hơn và độ bền gel không giảm trongsuốt quá trình lên men khi so sánh với nấm men được cố định theo phương pháp tạo gel từbên ngoài [100, 101]

2.2.3.3Ưu nhược điểm của việc cố định nấm men trong gelalginate

Ưu điểm

 Quá trình cố định dễ thực hiện [10, 35, 102, 103, 115, 176, 192, 194, 209].

 Điều kiện cố định ôn hòa, không phải xử lý nhiệt hay xử lý hóa chất Do đó, các tếbào cố định không bị mất hoạt tính [10, 35, 102, 103, 115, 176, 209, 211].

 Alginate là chất mang trơ về mặt hóa học [176].

 Alginate không có độc tính, thích hợp cho các sản phẩm thực phẩm [10, 103, 169,176, 192].

Trang 36

 Độ xốp của mạng gel thuận lợi cho việc khuếch tán cơ chất và sản phẩm [8, 27]. Gel alginate vẫn giữ được độ bền khi nhiệt độ lên men cao [205].

Nhược điểm và cách khắc phục

 Độ bền gel giảm theo thời gian lên men do [113, 114, 115, 176, 194, 209, 211]: Các tế bào nấm men trên và gần bề mặt có khả năng sinh sôi nảy nở chiếm ưu

thế so với các tế bào nằm sau bên trong hạt, do đó có thể làm phá vỡ bề mặthạt gel và dễ dàng thoát ra khỏi hạt gel, phát triển nhanh chóng trong môitrường dưới dạng các nấm men tự do Điều này làm cản trở việc đánh giá độnghọc phản ứng của nấm men cố định, đồng thời gây khó khăn cho việc táchnấm men ra khỏi môi trường lên men Để khắc phục vấn đề này có nhiều cáchkhác nhau Cách thứ nhất là sử dụng kỹ thuật tạo màng bao Trong phươngpháp này, các tế bào sẽ được nhốt bên trong một nhân lỏng được bao bọc bởimột lớp mỏng gel alginate Do đó, các tế bào sẽ có khoảng không nhiều hơnđể phát triển bên trong nhân lỏng Vì thế, mật độ tế bào đạt được cao hơn màkhông bị thoát bào ra ngoài Hơn thế nữa, bằng cách này có thể sử dụng lượngalginate ít hơn Cách thứ hai là áo nấm men cố định với mạng polymer, có thểthực hiện một bước (bằng cách sử dụng vòi đôi), hoặc hai bước (bằng cách tạolớp áo polymer sau khi đã tạo hạt nấm men cố định) Đây là phương án rất khảthi vì nó không làm ảnh hưởng đến tốc độ sinh tổng hợp cồn cũng như tốc độsử dụng cơ chất

 Sự giải phóng CO2 bên trong gel làm phá vỡ cấu trúc của gel Để khắc phục,có thể làm tăng độ xốp của gel alginate bằng cách giảm nồng độ alginate sửdụng, tuy nhiên điều này lại đồng nghĩa với việc làm yếu mạng gel Vì thế,phải tăng độ bền gel bằng cách áo các hạt alginate xốp này với màng polymer(ví dụ, chitosan), khi đó độ bền của gel này sẽ tương tự với gel sử dụng nồngđộ alginate cao.

 Gel Ca-alginate rất nhạy với các chất tạo chelate (hợp chất hữu cơ trong đó nguyêntử tạo thành nhiều hơn một liên kết phối trí với các kim loại trong dung dịch) nhưphosphate, citrate và lactate và các chất không tạo gel (non-gelling) như là các ionsodium và magnesium Sự có mặt của các ion này trong dung dịch sẽ làm cho cáchạt bị phồng ra, dẫn đến tăng kích thước các lỗ xốp, làm giảm tính ổn định và phávỡ cấu trúc hạt gel Thông thường người ta thường thêm vào môi trường lên mencác chất ổn định gel như là CaCl2, celite và pectine với một hàm lượng thích hợp đểổn định độ bền gel Hoặc cũng có thể làm cứng gel bằng cách sử dụng propyleneglycol ester, polyethelenine (PEI) và các loại vật liệu composite (colloidal silica)[10, 102, 103, 144, 193, 194].

 Không bền hóa học trong dung dịch điện phân và dung dịch có pH cao Để khắcphục điều này, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện và có nhiều phương pháp đượcđưa ra: tạo liên kết của hạt gel với glutaraldehyde (Takata và cộng sự, 1977), vớipolycations (Birnbaum và cộng sự, 1981) và sấy khô hạt gel (Klein và Wagner,

Trang 37

1978; Burns và cộng sự, 1985) Những phương pháp này đều có thể cải thiện độ bềntrong dung dịch điện phân, nhưng rõ ràng là chúng rất phức tạp và tốn nhiều thờigian Một số tác giả đã đưa ra phương pháp khác là dùng các ion Ba2+ và Sr2+ thaycho ion Ca2+ truyền thống Các ion này có ái lực mạnh hơn đối với alginate, vì thếhạt gel barium và strontium alginate bền hơn trong dung dịch điện phân so với hạtgel calcium alginate Tuy nhiên, các ion này vẫn không được ứng dụng rộng rãi vìđộc tính của nó đối với nấm men và với môi trường [144, 183, 192, 193, 194]

2.2.3.4Ảnh hưởng của thành phần alginate và các điều kiện tạogel đến độ bền gel và quá trình lên men

Aûnh hưởng của khối lượng phân tử

Anders Johansen và James M Flink (1986) đã nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượngphân tử alginate thông qua các thí nghiệm với các loại alginate có độ nhớt khác nhau Kếtquả cho thấy rằng khối lượng phân tử ít có ảnh hưởng đến tốc độ lên men và sự tạo thànhethanol, mặc dù tốc độ lên men nhìn chung giảm khi tăng khối lượng phân tử Trong khiđó, độ bền gel (được đo bằng khả năng chống chịu đối với lực nén ép) tăng đáng kể khităng độ nhớt từ 5 đến 70cP (độ nhớt là đại lượng đặc trưng cho khối lượng phân tử củaalginate), nhưng khi độ nhớt tăng cao hơn nữa (250 đến 600cP) thì độ bền gel tăng rất ít[101].

Kazuaki và cộng sự (1995) cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của độ nhớt đến khả năngkhuếch tán của glucose và kết quả cho thấy rằng khả năng khuếch tán của glucose khôngphụ thuộc vào độ nhớt Trong quá trình xử lý nhiệt, độ nhớt của alginate giảm do giảmmức độ polymer hóa của các phân tử alginate Như vậy, việc tiệt trùng alginate không ảnhhưởng bất lợi đến khả năng khuếch tán của glucose [210].

Aûnh hưởng của tỷ lệ G/M

Tỷ lệ G/M là phần mol của L-guluronic acid trên D-mannuronic acid, biểu thị thànhphần của alginate

Khi tỷ lệ G/M giảm thì:

 Tốc độ lên men có xu hướng tăng, nhưng không đáng kể [101].

 Độ bền gel giảm, vì các ion hóa trị 2 như là calcium, barium, strontium được ưu tiênliên kết vào block G hơn là block M và block MG Do đó alginate có hàm lượng Glớn sẽ tạo thành gel xốp, chắc hơn và vẫn giữ được độ cứng vững trong một thờigian dài Trong suốt quá trình tạo liên kết với Ca2+, các loại alginate này sẽ khôngbị phồng nở hay co rút, vì thế vẫn giữ được hình dạng tốt hơn Thêm vào đó,alginate có hàm lượng G cao sẽ cản trở sự sinh trưởng của tế bào nấm men sau khicố định Trái lại, alginate có hàm lượng M cao tạo thành gel mềm và ít xốp hơn vàdễ bị rã ra hơn so với các gel giàu G [101, 116, 144, 173, 181, 192, 193] Kazuaki vàcộng sự (1995) cũng đã nghiên cứu và kết luận rằng gel alginate giàu G thích hợpđể cố định nấm men hơn vì gel này ít gây cản trở đến khả năng khuếch tán củaglucose và có độ bền cơ học cao hơn [210].

Trang 38

Aûnh hưởng của nồng độ alginate

Tăng nồng độ alginate trong khoảng 1 – 10% làm giảm đáng kể tốc độ lên men vàtốc độ sinh tổng hợp cồn do làm giảm sự khuếch tán nhưng lại làm tăng độ bền gel [101,146, 205, 210]

Theo nhiều nhà nghiên cứu, nồng độ alginate thích hợp để cố định nấm men là 2%[101, 146, 210].

Aûnh hưởng của pH tạo gel

Theo Kazuaki và cộng sự (1995), pH của dung dịch alginate thích hợp cho quá trìnhtạo gel là từ 6,0 đến 8,0 Nằm ngoài khoảng này, khả năng khuếch tán của glucose và độbền gel đều giảm Đó là do pH đã làm thay đổi hình dạng của các phân tử alginate [210].

Aûnh hưởng của nhiệt độ tạo gel

Theo Kazuaki và cộng sự (1995), khi nhiệt độ tạo gel dưới 298K, khả năng khuếch táncủa glucose gần như không đổi, nhưng khi tăng nhiệt độ trên 300K thì khả năng khuếchtán của glucose giảm nhanh Độ bền gel cũng gần như không đổi khi nhiệt độ tạo gel dưới298K, nhưng giảm nhanh khi tăng nhiệt độ trên 300K Nhiệt độ tạo gel ảnh hưởng đến khảnăng khuếch tán của glucose và độ bền gel là do nhiệt độ đã làm thay đổi hình dạng củaphân tử alginate Như vậy, nhiệt độ thích hợp cho quá trình tạo gel là nhiệt độ dưới 298K[210].

Aûnh hưởng của mật độ tế bào trong hạt

Để đánh giá ảnh hưởng của mật độ tế bào, Anders Johansen và James M Flink (1986)đã tiến hành thí nghiệm với 2 mật độ tế bào là 0,5% và 10% (tương ứng với 2.108 và 4.109

tế bào/ g gel) Kết quả cho thấy rằng khi mật độ tế bào ban đầu cao, tốc độ lên men/ g hạtthì cao hơn nhưng năng suất/ tế bào thì thấp hơn so với mật độ tế bào ban đầu thấp Đó làdo sự có mặt của lớp bề mặt tế bào hoạt hóa ngay sát bề mặt hạt gel, tương tự như vớinghiên cứu của Wada và cộng sự (1979) đối với các hạt -carrageenan Lớp tế bào nàylàm ngăn cản sự khuếch tán của cơ chất và/ hoặc sản phẩm xuyên qua mạng gel, và do đócác tế bào bên trong gần như bị bất hoạt Trong trường hợp này, năng suất/ tế bào thấp khimật độ tế bào cao đó là do các tế bào nằm ở bên dưới lớp bề mặt cũng được tính vào mậtđộ tế bào nhưng không tham gia vào quá trình tạo thành sản phẩm [101].

Aûnh hưởng của tỷ lệ S/V

Diện tích bề mặt riêng (diện tích bề mặt/ thể tích) là một yếu tố quan trọng đối vớinăng suất lên men/g hạt, khi tỷ lệ S/V càng cao thì năng suất càng cao Đối với một tỷ lệS/V nhất định, hình dạng gel không ảnh hưởng đến tốc độ lên men [101].

Trang 39

2.2.4 Một số tính chất của nấm men cố định

2.2.4.1Những sự thay đổi về sinh trưởng, hình thái của tế bàonấm men khi cố định trên chất mang

Như chúng ta đã biết, quá trình sinh trưởng của vi sinh vật nói chung và nấm men nóiriêng phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường quanh nó Khi cố định tế bào, do sựtương tác giữa tế bào – chất mang và giữa các tế bào với nhau mà khả năng sinh trưởngvà hình thái của tế bào cũng có một vài biến đổi [73].

Theo một số tác giả, khả năng sinh trưởng của nấm men cố định kém hơn so với nấmmen tự do:

 Banyopadhyay và cộng sự (1982) đã tiến hành nghiên cứu khảo sát quá trình sinhtrưởng của nấm men cố định trên thủy tinh xốp (Controled pore glass) bằng phươngpháp hấp phụ Khả năng sinh trưởng của nấm men tự do và cố định được đánh giágián tiếp thông qua tốc độ hấp thu O2 và tốc độ sinh CO2 Kết quả nghiên cứu chothấy nấm men cố định có hiện tượng giảm khả năng hấp thu O2 và sinh CO2 so vớinấm men tự do [16].

 Doran và cộng sự (1985) cũng tiến hành khảo sát quá trình sinh trưởng của nấm

men Saccharomyces cerevisiae cố định trên gelatin Kết quả thực nghiệm thu được

tương tự như kết quả của Bandyopadhyay và cộng sự (1982) Ngoài ra tác giả cònnhận thấy rằng tốc độ sinh trưởng và tỷ lệ nảy chồi của nấm men cố định trêngelatin đều thấp hơn so với nấm men tự do [56].

Nguyên nhân của hiện tượng này là do:

 Hệ lên men sử dụng nấm men cố định là một hệ phản ứng dị thể, trong đó, các chấtdinh dưỡng có xu hướng tập trung trên bề mặt chất mang, vì vậy nấm men hấp phụtrên bề mặt chất mang có điều kiện tiếp xúc với nồng độ chất dinh dưỡng cao hơnso với trong môi trường đồng thể Chính sự thay đổi áp lực thẩm thấu một cách độtngột gây mất cân bằng trao đổi chất qua màng tế bào, làm ảnh hưởng đến quá trìnhhô hấp của tế bào [16].

 Chồi có thể được hình thành ở bất kỳ vị trí nào trên bề mặt tế bào nấm men

Saccharomyces cerevisiae, tuy nhiên phổ biến nhất là chồi sẽ mọc ở các cực

ellipsoide của tế bào nấm men lưỡng bội Vì vậy khi 1 cực của tế bào nấm men gắnvào chất mang sẽ vô tình làm mất đi sự hình thành của một chồi mới [56].

Nhiều nghiên cứu cũng cho thấy rằng nấm men cố định luôn sinh trưởng đạt đến mộtsố lượng tế bào không đổi và giữ nguyên như vậy cho đến khi kết thúc quá trình lên men:

 Wada và cộng sự (1980) nhận thấy rằng nấm men cố định sinh trưởng và giữ ổnđịnh ở khoảng 5,4.109 tế bào/mL gel [201].

 Melzoch và cộng sự (1994) đã nghiên cứu sự phát triển và hình thái của nấm mencố định trong gel Ca-alginate Các tế bào nấm men cố định sau khi được hoạt hóa,nếu được nuôi cấy trong môi trường giàu chất dinh dưỡng, số lượng tế bào sẽ tăng

Trang 40

lên rất nhanh (khoảng 1010 tế bào/mL gel) và sau đó hầu như giữ nguyên không đổi[142].

Bên cạnh đó, Melzoch và cộng sự cũng thấy rằng 80% tế bào cố định trong gelalginate đều duy trì hoạt tính trao đổi chất và khả năng phát triển khi nuôi cấy trong thời

gian dài Saccharomyces cerevisiae cố định trong gel alginate có thể duy trì khả năng sử

dụng đường của chúng ở mức độ tương đối cao và ổn định, chỉ giảm khoảng 20% sau 1122giờ nuôi cấy [142].

Hình thái của nấm men cố định cũng thay đổi nhiều so với nấm men tự do:

 Banyopadhyay và cộng sự (1982) giả thuyết rằng chính sự mất cân bằng về trao đổichất làm cho các chồi của nấm men sau khi mọc thành nhanh chóng bị tách ra khỏitế bào mẹ, làm cho hình thái tế bào nấm men bị thay đổi [16].

 Melzoch và cộng sự (1994) khảo sát sự thay đổi hình thái của tế bào nấm men cốđịnh trong gel được tiến hành bằng cách quan sát dưới kính hiển vi điện tử Kết quảkhảo sát cho thấy tế bào nấm men cố định có hình dạng và kích thước không đồngđều Điều đó cho thấy sự phát triển của các tế bào bị nhốt trong hạt gel phụ thuộcvào độ xốp và cấu trúc của mạng gel cũng như khả năng chiếm chỗ trống trong hạtgel của tế bào nấm men Trong chất mang, các tế bào nấm men có xu hướng kết tụlại với nhau [142].

2.2.4.2Những thay đổi về hoạt động trao đổi chất của tế bàonấm men khi cố định trên chất mang

Nhiều nghiên cứu của các tác giả cho thấy rằng nấm men cố định có tốc độ sử dụngglucose, tốc độ sinh tổng hợp ethanol và glycerol cao hơn nhiều so với nấm men tự do mặcdù diện tích bề mặt tế bào của nấm men cố định dùng để vận chuyển chất dinh dưỡng nhỏhơn so với của nấm men tự do (bảng 2.6) [15, 43, 52, 56, 73, 74, 75, 131, 138, 154, 193]

Glazzo và Bailey (1990) giải thích là do quá trình cố định làm thay đổi sự vận chuyểnproton qua màng tế bào nấm men (Thể hiện qua giá trị pH nội bào của nấm men cố địnhhơi thấp hơn một chút so với giá trị pH nội bào của nấm men tự do: giá trị pH nội bào củanấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate lần lượt là 6,9 và 6,8) Để duy trì ổnđịnh pH nội bào, nấm men phải tăng tốc độ sử dụng ATP Như chúng ta đã biết, quá trìnhsinh tổng hợp ethanol bị hạn chế khi có sự có mặt của ATP Chính vì vậy, ở nấm men cốđịnh, quá trình sử dụng ATP tăng làm giảm sự có mặt của ATP trong tế bào, kết quả dẫnđến tốc độ sinh tổng hợp ethanol ở tế bào nấm men cố định tăng vọt [74].

Thêm vào đó, Galazzo và cộng sự (1987) cho rằng pH nội bào của tế bào cố định thấphơn so với tế bào tự do, do đó làm tăng tốc độ của các phản ứng xúc tác bởiphosphofructokinase và hexokinase Vì thế làm tăng tốc độ lên men [75].

Ngoài ra, nguyên nhân còn có thể là do nấm men cố định đã có những thay đổi trongthành phần tế bào:

 Thay đổi thành phần lipid của màng membrane [96, 138].