2.2.1.1Khái niệm
Kỹ thuật cố định tế bào được định nghĩa là: “Kỹ thuật bao bọc hoặc định vị các tế bào còn nguyên vẹn lên một “vùng không gian nhất định” nhằm bảo vệ các hoạt tính xúc tác mong muốn” (Karel và cộng sự, 1985) [113].
Cố định thường là sự bắt chước các hiện tượng xảy ra trong tự nhiên do các tế bào có thể phát triển trên bề mặt hoặc bên trong các cấu trúc của nguyên liệu có trong tự nhiên [113].
2.2.1.2Các kỹ thuật cố định tế bào
Các kỹ thuật cố định tế bào có thể được chia làm 4 nhóm chính như trong bảng 2.4 và Hình 2.5.
Bảng 2.4: So sánh các kỹ thuật cố định tế bào (còn nữa)
Cố định trên bề mặt chất mang rắn
Nhốt trong khung mạng xốp
Keo tụ tế bào (tạo hạt)
Nhốt bằng phương pháp cơ
học bên trong một màng chắn Nguyên
tắc
Dựa vào lực hấp phụ vật lý, liên kết tĩnh điện hoặc liên kết cộng hóa trị [113, 185].
Đưa tế bào vào bên trong một mạng cứng để ngăn cản tế bào khuếch tán vào môi trường xung quanh, trong khi vẫn cho phép sự vận chuyển các chất dinh dưỡng và sự trao đổi chất diễn ra [113].
Làm gia tăng kích thước của khối tế bào để dễ dàng sử dụng trong các bình phản ứng. Có thể là keo tụ tự nhiên hoặc là keo tụ nhân tạo bằng cách tạo thành các liên kết ngang [113].
Phương pháp này có thể được thực hiện theo 2 cách [113]: 2. Sử dụng màng membrane vi xốp 3. Sử dụng màng vi bao
Ưu điểm 4. Đơn giản, dễ thực hiện [113, 185, 189]. 5. Không ảnh hưởng đến quá trình truyền khối [185, 138]. 6. Diện tích tiếp xúc giữa tế bào cố định và chất mang lớn hơn so với các kỹ thuật khác [138].
7. Có thể đạt được mật độ tế bào trong một đơn vị thể tích chất mang cao hơn so với canh trường vi sinh vật tự do [138].
8. Chất mang có tác dụng bảo vệ tế bào chống lại thực khuẩn hoặc tế bào ngoại lại cũng như những điều kiện gây stress [138]. 9. Đơn giản, dễ thực hiện. 10. Không ảnh hưởng đến quá trình truyền khối.
Canh trường lên men không bị lẫn tế bào, do đó sản phẩm tạo thành có thể không cần lọc [113, 138].
Cố định trên bề mặt chất mang rắn
Nhốt trong khung mạng xốp
Keo tụ tế bào (tạo hạt)
Nhốt bằng phương pháp cơ
học bên trong một màng chắn Nhược
điểm
Do không có màng chắn giữa các tế bào và dung dịch cho nên các tế bào dễ bị tách ra, làm tăng hàm lượng tế bào tự do trong dung dịch [113, 40].
11. Khi tế bào tăng quá nhiều sinh khối sẽ làm giảm độ bền của mạng gel [39].
12. Tế bào trên bề mặt dễ thoát ra khỏi mạng gel và phát triển trong môi trường như là các tế bào tự do [113, 39]. 13. Do không có màng chắn giữa các tế bào và dung dịch cho nên các tế bào dễ bị tách ra, làm tăng hàm lượng tế bào tự do trong dung dịch.
−Khả năng truyền khối kém [113].
−Màng membrane có thể bị bám bẩn do sự hấp phụ cơ chất lên bề mặt màng [113].
Bảng 2.4: So sánh các kỹ thuật cố định tế bào (tiếp theo)
Cố định trên bề mặt chất mang rắn
Nhốt trong khung mạng xốp
Keo tụ tế bào (tạo hạt)
Nhốt bằng phương pháp cơ
học bên trong một màng chắn Chất
mang
14. Các vật liệu cellulose: DEAE- cellulose, gỗ, mùn cưa, mùn cưa đã tách lignine, … [113, 138]
15. Các vật liệu vô cơ: polygorskite, montmorilon ite, hydromica, sứ xốp, thủy tinh xốp, vòng Raschig, silicate, hợp chất titanium, … [113, 138] 16. Polymer tự nhiên [113]: 17. Polysaccharide : alginates, κ- carrageenan, agar, chitosan và polygalacturoni c acid. 18. Polymer khác: gelatin, collagen và polyvinyl alcohol. 19. Polymer tổng hợp: polyacrylamide , polyurethane và polyvinyl chloride [138]. Membrane làm bằng vật liệu cellulose acetate, polyamide [138].
2.2.2Các chất mang cố định nấm men trong sản xuất rượu vang
Kỹ thuật cố định nấm men trong sản xuất rượu vang đã được nghiên cứu rất rộng rãi, tuy nhiên việc ứng dụng kỹ thuật này trong công nghiệp vẫn còn hạn chế. Mục đích của việc sử dụng nấm men cố định là để cải thiện năng suất sinh ethanol cũng như hương vị và chất lượng sản phẩm. Để có thể ứng dụng thành công trong công nghiệp, chất mang được sử dụng để cố định phải đạt được độ an toàn thực phẩm, có nhiều trong tự nhiên, giá thành thấp và không làm ảnh hưởng đến tính chất cảm quan của rượu vang [111, 113, 130, 155, 197].
Nhiều loại chất mang sử dụng để cố định nấm men trong lên men rượu vang đã được nghiên cứu và trình bày trong bảng 2.5.
Bảng 2.5: Một số chất mang sử dụng để cố định nấm men trong sản xuất rượu vang (còn nữa)
Phân loại chất mang Một số chất mang chính Vi sinh vật Tác giả Tài liệu tham khảo
CHẤT MANG KHÔNG CÓ NGUỒN GỐC THỰC PHẨM
Chất mang vô cơ γ-alumina Saccharomyces cerevisiae Bakoyianis và cộng sự, 1997 Kourkoutas và cộng sự, 2003 Kourkoutas và cộng sự, 2006 Loukatos và cộng sự, 2000
14 108 105 125
Hydromica Saccharomyces cerevisiae Ageeva và cộng sự, 1985 5
Kissiris Saccharomyces cerevisiae Argiriou và cộng sự, 1996 Bakoyianis và cộng sự, 1992 Bakoyianis và cộng sự, 1997 Kourkoutas và cộng sự, 2003 Kourkoutas và cộng sự, 2006 Loukatos và cộng sự, 2003
11 13 14 108 105 124 Montmorilonite Saccharomyces cerevisiae Ageeva và cộng sự, 1985 5 Polygorskite Saccharomyces cerevisiae Ageeva và cộng sự, 1985 5
Thủy tinh Saccharomyces cerevisiae Hamdy, 1990 88
Chất mang hữu cơ κ-carrageenan Saccharomyces cerevisiae Gòdia và cộng sự, 1991 Nakanishi và Yokotsuka, 1987 Tataridis và cộng sự, 2005
83 147 193 Acid pectic Saccharomyces cerevisiae Nakanishi và Yokotsuka, 1987 147
Bảng 2.5: Một số chất mang sử dụng để cố định nấm men trong sản xuất rượu vang (tiếp theo và còn nữa)
Phân loại chất mang Một số chất mang chính Vi sinh vật Tác giả Tài liệu tham khảo Chất mang hữu cơ Agar Saccharomyces cerevisiae Nakanishi và Yokotsuka, 1987 147
Alginate Candida stellata Ciani và Ferraro, 1996
Ferraro và cộng sự, 2000 4366
Alginate Saccharomycesbayanus Busova và cộng sự, 1994 33
Alginate Saccharomyces cerevisiae Bakoyianis và cộng sự, 1997 Colagrande và cộng sự, 1994 Ferraro và cộng sự, 2000 Fumi và cộng sự, 1987 Fumi và cộng sự, 1988 Fumi và cộng sự, 1989 Gòdia và cộng sự, 1991 Mori, 1987
Suzzi và cộng sự, 1996 Silva và cộng sự, 2002
Shimobayashi và Tominaga, 1986 Tataridis và cộng sự, 2005
Yokotsuka và cộng sự, 1993 Yokotsuka và cộng sự, 1997 Yokotsuka và cộng sự, 2003
14 47 65 70 71 72 83 145 188 179 177 193 212 214 213 Alginate Schizosaccharomyces pombe Magyar và cộng sự, 1989
Rosini và Ciani, 1993 Silva và cộng sự, 2003 Yokotsuka và cộng sự, 1993
126 168 180 212
Bảng 2.5: Một số chất mang sử dụng để cố định nấm men trong sản xuất rượu vang (tiếp theo và còn nữa)
Phân loại chất mang Một số chất mang chính Vi sinh vật Tác giả Tài liệu tham khảo
Chất mang hữu cơ Cellulose được bao phủ bởi alginate Saccharomyces cerevisiae Otsuka, 1980 153 DCM (Delignified Cellulosic Material) Saccharomyces cerevisiae Bardi và Koutinas, 1994
Bardi và cộng sự, 1997 Balli và cộng sự, 2003 Loukatos và cộng sự, 2003 Mallouchos và cộng sự, 2003
17 20 15 124 135 DEAE-cellulose được bao phủ bởi lớp
nhựa trao đổi ion
Saccharomyces cerevisiae Lommi và Advenainen, 1990 121
Gelatin Saccharomyces cerevisiae Parascandola và cộng sự, 1992 154
Gluten Saccharomyces cerevisiae Balli và cộng sự, 2003
Bardi và cộng sự, 1996, 1997 Iconomopoulou và cộng sự, 2000 Loukatos và cộng sự, 2003 Mallouchos và cộng sự, 2003
15 18, 20 93 124 135 Đĩa thủy tinh được bao phủ bởi lớp
màng alginate
Saccharomyces cerevisiae
Schizosaccharomyces pombe Ogbonna và cộng sự, 1989 152
Polyvinyl alcohol Saccharomyces cerevisiae Martynenko và cộng sự, 2003 137
Chất mang dạng màng Màng membrane Saccharomyces cerevisiae Takaya và cộng sự, 2002 190 Màng vi bao sinh học (biocapsule) Saccharomyces cerevisiae Peinado và cộng sự, 2005
Peinado và cộng sự, 2006
155 156
Bảng 2.5: Một số chất mang sử dụng để cố định nấm men trong sản xuất rượu vang (tiếp theo)
Phân loại chất mang Một số chất mang chính Vi sinh vật Tác giả Tài liệu tham khảo
CHẤT MANG CÓ NGUỒN GỐC THỰC PHẨM
Miếng lê Saccharomyces cerevisiae Kourkoutas và cộng sự, 2005
Mallios và cộng sự, 2004 107130 Miếng mộc qua Saccharomyces cerevisiae Kourkoutas và cộng sự, 2002
Kourkoutas và cộng sự, 2003 Kourkoutas và cộng sự, 2005
106 111 107 Miếng táo Saccharomyces cerevisiae Kourkoutas và cộng sự, 2001
Kourkoutas và cộng sự, 2002 Kourkoutas và cộng sự, 2003 Kourkoutas và cộng sự, 2005 Kourkoutas và cộng sự, 2006 Kourkoutas và cộng sự, 2006
110 112 108 107 105 109 Nho khô Saccharomyces cerevisiae Tsakiris và cộng sự, 2004
Tsakiris và cộng sự, 2004
197 196
Vỏ nho Saccharomyces cerevisiae Mallouchos và cộng sự, 2002
Mallouchos và cộng sự, 2003 Mallouchos và cộng sự, 2003
132 131 134
2.2.3Cố định nấm men trong gel alginate
2.2.3.1Alginate
Alginate có khá nhiều trong tự nhiên và có thể xuất phát từ 2 nguồn gốc khác nhau [186]:
−Là thành phần cấu trúc của tảo nâu biển (Phaeophyceae), chiếm đến 40% khối lượng chất khô.
−Là polysaccharide màng bao trong các loại vi khuẩn đất.
Tuy nhiên tất cả các alginate thương mại hiện nay đều có nguồn gốc từ tảo.
Alginate là một copolymer không phân nhánh, bao gồm các monomer β-D-mannuronic acid (gọi tắt là M) và α-L-guluronic acid (G) liên kết với nhau thông qua liên kết 1,4 – glucoside. Các monomer này phân bố trong mạch alginate theo các block (Hình 2.6) [116, 181, 186]:
−Block M: gồm các gốc mannuronic acid nối tiếp nhau
−Block G: gồm các gốc guluronic acid nối tiếp nhau
−Block MG: gồm các gốc mannuronic acid và guluronic acid luân phiên nối với nhau.
Hình 2.6: Cấu trúc của alginate: (a) các monomer của alginate, (b) chuỗi alginate, (c) sự phân bố các block[186]
2.2.3.2Cơ chế tạo gel
Alginate có khả năng tạo gel khi kết hợp với các cation kim loại hóa trị cao hoặc khi phân tử alginate bị acid hóa. Tuy nhiên, phương pháp tạo gel bằng cách acid hóa phân tử alginate ít được dùng vì quy trình thực hiện rất phức tạp [186].
Alginate có khả năng kết hợp nhanh với các cation kim loại hóa trị cao để tạo thành gel đồng thể. Aùi lực của alginate đối với các ion hóa trị 2 khác nhau giảm theo trình tự: Pb2+ > Cu2+ > Cd2+ > Ba2+ > Sr2+ > Ca2+ > Co2+, Ni2+ > Zn2+ > Mn2+. Tùy thuộc vào loại ion liên kết và loại alginate mà gel tạo thành có tính chất khác nhau. Thông thường, người ta thường sử dụng calcium để làm ion tạo gel [144, 181].
Quá trình tạo gel của alginate theo phương pháp kết hợp với cation kim loại hóa trị cao có thể tiến hành theo 2 phương pháp là phương pháp tạo gel từ bên ngoài và phương pháp tạo gel từ bên trong [186].
• Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel từ bên ngoài
Đây là phương pháp tạo gel phổ biến nhất của alginate. Phương pháp này có ưu điểm là tạo gel nhanh và thao tác rất đơn giản (Hình 2.7).
Khi nhỏ dung dịch alginate vào dung dịch có chứa cation có khả năng tạo gel (thường gặp nhất là Ca2+), bề mặt ngoài của hạt alginate sẽ lập tức bị gel hóa. Tiếp theo đó, các cation tạo gel ở bên ngoài hạt alginate tiếp tục khuếch tán vào bên trong hạt làm cho các phân tử alginate bên trong tiếp tục bị gel hóa. Quá trình này xảy ra trên bề mặt hạt và phát triển vào bên trong. Phương pháp này tạo gel nhanh, tuy nhiên tính đồng thể của hạt gel lại không cao [100, 186, 193].
Hạt gel Cacium Alginate Na- Alginate Ca Ca Ca Ca Ca Ca CaCl2 Na-Alginate Lực đẩy
• Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel từ bên trong
Cho các muối có chứa các cation tạo gel ở dạng vô hoạt (Ví dụ: CaCO3, CaSO4, EDTA- Ca, calcium citrate…) vào dung dịch alginate. Thay đổi pH của dung dịch về pH acid bằng các tác nhân acid hóa (Ví dụ: D-glucono-δ-lactone (GDL)). Khi đó, do pH giảm, mà độ hòa tan của các muối chứa các cation tạo gel như ở trên lại phụ thuộc vào pH nên các ion Ca2+
sẽ được giải phóng dần và tham gia vào quá trình tạo gel với alginate (Hình 2.8). Phương pháp này cho hạt gel có tính đồng thể cao hơn hẳn phương pháp khuếch tán do các ion Ca2+
phân bố đồng đều hơn. Hơn thế nữa, phương pháp này còn có thể tạo gel với các hình dạng khác nhau như mong muốn bằng cách cho dung dịch alginate vào khuôn thích hợp trước khi quá trình tạo gel diễn ra. Trong khi đó, phương pháp tạo gel từ bên ngoài thường chỉ tạo thành các hạt có hình cầu [67, 100, 101, 186].
H2O GDL H+ CO2 HCO3 CaCO3 H+ Ca Ca Ca Na-Alginate
Hình 2.8: Cơ chế tạo gel của alginate theo phương pháp tạo gel từ bên trong[186]
Theo Anders Johansen và James M. Flink (1986), khi nấm men được cố định theo phương pháp gel từ bên trong, tốc độ lên men cao hơn và độ bền gel không giảm trong suốt quá trình lên men khi so sánh với nấm men được cố định theo phương pháp tạo gel từ bên ngoài [100, 101].
2.2.3.3Ưu nhược điểm của việc cố định nấm men trong gel alginate
• Ưu điểm
−Quá trình cố định dễ thực hiện [10, 35, 102, 103, 115, 176, 192, 194, 209].
−Điều kiện cố định ôn hòa, không phải xử lý nhiệt hay xử lý hóa chất. Do đó, các tế bào cố định không bị mất hoạt tính [10, 35, 102, 103, 115, 176, 209, 211].
−Alginate là chất mang trơ về mặt hóa học [176].
−Alginate không có độc tính, thích hợp cho các sản phẩm thực phẩm [10, 103, 169, 176, 192].
−Độ xốp của mạng gel thuận lợi cho việc khuếch tán cơ chất và sản phẩm [8, 27].
−Gel alginate vẫn giữ được độ bền khi nhiệt độ lên men cao [205].
• Nhược điểm và cách khắc phục
−Độ bền gel giảm theo thời gian lên men do [113, 114, 115, 176, 194, 209, 211]:
• Các tế bào nấm men trên và gần bề mặt có khả năng sinh sôi nảy nở chiếm ưu thế so với các tế bào nằm sau bên trong hạt, do đó có thể làm phá vỡ bề mặt hạt gel và dễ dàng thoát ra khỏi hạt gel, phát triển nhanh chóng trong môi trường dưới dạng các nấm men tự do. Điều này làm cản trở việc đánh giá động học phản ứng của nấm men cố định, đồng thời gây khó khăn cho việc tách nấm men ra khỏi môi trường lên men. Để khắc phục vấn đề này có nhiều cách khác nhau. Cách thứ nhất là sử dụng kỹ thuật tạo màng bao. Trong phương pháp này, các tế bào sẽ được nhốt bên trong một nhân lỏng được bao bọc bởi một lớp mỏng gel alginate. Do đó, các tế bào sẽ có khoảng không nhiều hơn để phát triển bên trong nhân lỏng. Vì thế, mật độ tế bào đạt được cao hơn mà không bị thoát bào ra ngoài. Hơn thế nữa, bằng cách này có thể sử dụng lượng alginate ít hơn. Cách thứ hai là áo nấm men cố định với mạng polymer, có thể thực hiện một bước (bằng cách sử dụng vòi đôi), hoặc hai bước (bằng cách tạo lớp áo polymer sau khi đã tạo hạt nấm men cố định). Đây là phương án rất khả thi vì nó không làm ảnh hưởng đến tốc độ sinh tổng hợp cồn cũng như tốc độ sử dụng cơ chất.
• Sự giải phóng CO2 bên trong gel làm phá vỡ cấu trúc của gel. Để khắc phục, có thể làm tăng độ xốp của gel alginate bằng cách giảm nồng độ alginate sử dụng, tuy nhiên điều này lại đồng nghĩa với việc làm yếu mạng gel. Vì thế, phải tăng độ bền gel bằng cách áo các hạt alginate xốp này với màng polymer (ví dụ, chitosan), khi đó độ bền của gel này sẽ tương tự với gel sử dụng nồng độ alginate cao.
−Gel Ca-alginate rất nhạy với các chất tạo chelate (hợp chất hữu cơ trong đó nguyên tử tạo thành nhiều hơn một liên kết phối trí với các kim loại trong dung dịch) như phosphate, citrate và lactate và các chất không tạo gel (non-gelling) như là các ion sodium và magnesium. Sự có mặt của các ion này trong dung dịch sẽ làm cho các hạt bị phồng ra, dẫn đến tăng kích thước các lỗ xốp, làm giảm tính ổn định và phá vỡ cấu trúc hạt gel. Thông thường người ta thường thêm vào môi trường lên men các chất ổn định gel như là CaCl2, celite và pectine với một hàm lượng thích hợp để ổn định độ bền gel. Hoặc cũng có thể làm