quá trình sinh trưởng của nấm men
Kết quả khảo sát động học quá trình sinh trưởng của nấm men được chúng tôi trình bày trong hình 4.1, hình 4.2 và bảng 4.1. Kết quả cho thấy khi hàm lượng đường ban đầu tăng từ 200 đến 240g/L thì mật độ tế bào nấm men trong dịch lên men tăng và tốc độ sinh trưởng riêng cũng tăng:
−Mật độ tế bào nấm men cố định cực đại ứng với hàm lượng đường 200g/L và 240g/L lần lượt là 155,13.106 tế bào/mL và 222,5.106 tế bào/mL. Tốc độ sinh trưởng riêng cực đại của nấm men cố định ứng với hàm lượng đường 200g/L và 240g/L lần lượt là 0,248 và 0,344 h-1.
−Mật độ tế bào nấm men tự do cực đại ứng với hàm lượng đường 200g/L và 240g/L lần lượt là 164,06.106 tế bào/mL và 240,63.106 tế bào/mL. Tốc độ sinh trưởng riêng cực đại của nấm men tự do ứng với hàm lượng đường 200g/L và 240g/L lần lượt là 0,458 và 0,764 h-1.
Nhưng nếu hàm lượng đường ban đầu tăng cao hơn nữa (240 – 360g/L) thì mật độ tế bào giảm và tốc độ sinh trưởng riêng cũng giảm. Như vậy, khi môi trường lên men chứa quá nhiều đường, khả năng sinh trưởng của nấm men sẽ bị ức chế. Nguyên nhân là do ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu:
−Khi nồng độ cơ chất đạt đến một giá trị tới hạn nào đó, hoạt độ nước giảm và xảy ra sự co tế bào chất làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men [12].
−Patterson và cộng sự (1995) cho rằng áp suất thẩm thấu cao làm bất hoạt các enzyme quan trọng đảm nhiệm nhiệm vụ sao mã DNA [123].
−Cheftel (1995) thì cho rằng khi tế bào chịu áp lực thẩm thấu cao, pH nội bào giảm đi 0,2 đơn vị. Do đó, hoạt động của nấm men sẽ bị ức chế vì pH nội bào thấp [123].
Hình 4.28: Sự thay đổi mật độ tế bào nấm men trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L)
Charoenchai và cộng sự (1998) cũng cho rằng tăng hàm lượng đường trong dịch nho từ 200 – 300g/L làm giảm tốc độ sinh trưởng và sinh khối tế bào. Kết quả này có khác biệt một ít về mặt số liệu so với chúng tôi: theo các tác giả này thì khi hàm lượng đường tăng từ 200g/L trở lên thì sẽ ức chế sự sinh trưởng của nấm men, trong khi đó, theo chúng tôi thì hàm lượng đường phải từ 240g/L trở lên mới có sự ức chế. Nguyên nhân có thể là do sự khác biệt về chủng nấm men và thành phần hóa học của dịch nho dùng để lên men [37]. Nhưng nhìn chung, kết quả này vẫn cho thấy quy luật tương tự như kết quả của chúng tôi là khi hàm lượng đường tăng cao đến một giá trị nhất định nào đó thì sẽ kìm hãm sự sinh trưởng của nấm men.
Chúng tôi thấy rằng: trong trường hợp lên men bằng nấm men cố định, khi hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 320g/L, mật độ tế bào và tốc độ sinh trưởng riêng luôn luôn thấp hơn so với nấm men tự do. Kết quả của chúng tôi tương tự như nghiên cứu của nhiều tác giả khác như Banyopadhyay và cộng sự (1982) [16] về nấm men cố định trên thủy tinh xốp, Doran và cộng sự (1985) [56] về nấm men cố định trên gelatin, Sogoyan và cộng sự [138]; Melzoch và cộng sự (1994) [142] về nấm men cố định trong gel alginate … Nguyên nhân của hiện tượng này được các tác giả giải thích là do sự nảy chồi của tế bào bị cản trở khi được cố định trong chất mang [56, 142].
Hình 4.29: Sự thay đổi tốc độ sinh trưởng riêng của nấm men trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L).
Tuy nhiên, kết quả này lại trái ngược với kết quả của Wada và cộng sự (1980) khi nghiên cứu về nấm men cố định trong carrageenan. Các tác giả này cho rằng nấm men cố định sinh trưởng tốt hơn nấm men tự do, mật độ tế bào nấm men trong gel cao gấp 10 lần so với mật độ tế bào nấm men tự do [201]. Nguyên nhân có sự khác biệt về kết quả của chúng tôi so với kết quả của các tác giả này có thể là do sự khác nhau về chủng nấm men, thành phần hóa học của môi trường lên men và cấu hình không gian của chất mang sử dụng.
Nhưng khi hàm lượng đường đạt 360g/L thì tuy nấm men tự do có mật độ tế bào cao hơn nhưng tốc độ sinh trưởng riêng cực đại lại nhỏ hơn so với nấm men cố định. Ngoài ra, khi hàm lượng đường nằm trong khoảng 320 – 360g/L, thời gian cần thiết để nấm men tự do đạt được tốc độ sinh trưởng riêng cực đại lâu hơn so với nấm men cố định (8h so với 4h).
Bên cạnh đó, kết quả phân tích ANOVA (bảng 4.1) còn cho thấy rằng khi hàm lượng đường tăng, giá trị tốc độ sinh trưởng riêng cực đại µmax của nấm men tự do bị ảnh hưởng nhiều hơn so với nấm men cố định. Khi hàm lượng đường tăng từ 240 – 360g/L, µmax của nấm men tự do giảm mạnh, từ 0,764 giảm xuống còn 0,240 h-1, trong khi đó giá trị µmax của nấm men cố định không có sự khác biệt (P < 0,05) (chỉ trừ trường hợp µmax tại 240g/L so với
µmax tại 320 và 360g/L là khác nhau có nghĩa). Điều đó cho thấy rằng hàm lượng đường cao ức chế sự sinh trưởng của nấm men tự do nhiều hơn so với nấm men cố định.
Bảng 4.16: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh trưởng riêng cực đại của nấm men trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate.
Hàm lượng đường ban đầu (g/L)
Tốc độ sinh trưởng riêng cực đại µmax (h-1) Nấm men cố định Nấm men tự do
200 0,248 ± 0,016a 0,458 ± 0,022d
240 0,344 ± 0,018c 0,764 ± 0,018g
280 0,320 ± 0,023bc 0,671 ± 0,020f
320 0,310 ± 0,011b 0,520 ± 0,016e
360 0,308 ± 0,013b 0,240 ± 0,016a
Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của 3 mẫu độc lập. Các giá trị có ký hiệu khác nhau biểu thị sự khác nhau có nghĩa (P < 0,05).
Có nhiều tác giả đã đưa ra những giả thuyết khác nhau để giải thích cho hiện tượng trên [12, 15, 43, 52, 60, 113,150, 198]. Tuy nhiên, theo chúng tôi, trong trường hợp này, hiện tượng trên có thể được giải thích bởi một số nguyên nhân chính sau:
−Sự có mặt của chất mang đã bảo vệ tế bào khỏi ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu do hàm lượng đường cao gây ra. Trong khi nấm men tự do phải tiếp xúc ngay với môi trường có hàm lượng đường cao thì nhờ có lớp chất mang, nấm men cố định tiếp xúc chậm hơn, do đường cần có thời gian để khuếch tán từ bên ngoài vào bên trong chất mang, nhờ đó nấm men cố định ít bị ức chế hơn [12].
−Theo Vieira và cộng sự (1989), khả năng chịu đựng đối với áp lực thẩm thấu của glucose càng tăng khi môi trường chứa càng nhiều ion Ca2+ và/hoặc Zn2+ [198]. Như vậy, do cố định trong gel Ca-alginate nên trong môi trường lên men của nấm men cố định chứa nhiều ion Ca2+ hơn so với nấm men tự do, do đó mà khả năng chịu đựng áp lực thẩm thấu cao hơn.
Ngoài ra, theo như kết quả được trình bày trong hình 4.1 thì sau khi đạt đến giá trị cực đại, mật độ tế bào nấm men tự do giảm nhanh, trong khi đó mật độ tế bào nấm men cố định giảm rất chậm và gần như ổn định cho đến khi kết thúc quá trình lên men chính. Điều đó có nghĩa là, trong giai đoạn cuối của quá trình lên men, đối với nấm men tự do, tốc độ chết lớn hơn nhiều so với tốc độ sinh sản, còn đối với nấm men cố định thì tốc độ chết gần như bằng với tốc độ sinh sản. Quan sát của chúng tôi trong quá trình thí nghiệm cũng cho thấy rằng tỷ lệ chết của tế bào cố định thấp hơn so với tế bào tự do (kết quả không trình bày ở đây). Kết quả này cũng tương tự như nghiên cứu của nhiều tác giả khác như Wada và cộng sự (1980) [201]; Gòdia và cộng sự (1987) [82] về nấm men cố định trong carrageenan, Melzoch và cộng sự (1994) về nấm men cố định trong alginate [142],…. Theo chúng tôi, nguyên nhân là do nấm men tự do bị ức chế bởi hàm lượng cồn tạo thành trong quá trình lên men, còn nấm men cố định thì ít bị ức chế hơn. Mặc dù hàm lượng cồn trong giai đoạn này còn thấp nhưng cũng đủ để ức chế hoạt động của nấm men, vì theo D'Amore and Stewart (1987), tốc độ phát triển và khả năng sống sót của nấm men bị ảnh hưởng khi nồng độ ethanol thấp hơn, trong khi đó tốc độ lên men thì bị ảnh hưởng khi nồng độ ethanol cao hơn [163].
Thêm vào đó, trong quá trình thí nghiệm chúng tôi cũng thấy rằng khi hàm lượng đường dao động trong khoảng 200 – 240g/L thì tỷ lệ thoát bào của nấm men cố định khoảng 3%.
Nhưng khi hàm lượng đường cao (280 – 360g/L) thì tỷ lệ thoát bào cao hơn, đạt khoảng 8,5%. Nguyên nhân có lẽ là do hàm lượng đường cao đã tạo ra áp suất thẩm thấu lớn lên mạng gel, làm giảm độ bền gel.
3.4.2Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường đến động học quá trình sử dụng cơ chất trong quá trình lên men
Kết quả khảo sát của chúng tôi về ảnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến quá trình sử dụng chất khô trong lên men vang được trình bày như trong hình 4.3. Và chúng tôi cũng khảo sát kỹ hơn về quá trình sử dụng các hợp chất chính là đường, nitơ amin tự do và nitơ ammonium trong quá trình lên men (hình 4.4, hình 4.8, hình 4.9).
Hình 4.30: Sự thay đổi nồng độ chất khô trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L).
Quan sát sự thay đổi hàm lượng chất khô trong suốt quá trình lên men chính (Hình 4.3), chúng tôi nhận thấy rằng mặc dù sự sinh trưởng của nấm men cố định kém hơn so với nấm men tự do nhưng khả năng sử dụng cơ chất của nấm men cố định tốt hơn nhiều so với nấm men tự do. Điều này cũng tương tự như nghiên cứu của nhiều tác giả khác: Galazzo và cộng sự, 1987; Galazzo và Bailey, 1989, 1990; Doran và cộng sự, 1985; Parascandola và cộng sự, 1992; Ciani và Ferraro, 1996; Balli và cộng sự, 2003; Mallouchos và cộng sự, 2003…. Sogoyan và cộng sự khi cố định nấm men trong chất mang alginate cũng đã kết luận rằng việc cố định nấm men làm tăng khả năng sử dụng cơ chất của nấm men 6 lần nhưng lại giảm khả năng sinh sản của nó 10 – 11 lần [138].
3.4.2.1Quá trình sử dụng đường
Hình 4.31: Sự thay đổi hàm lượng đường trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L).
Trong suốt quá trình lên men, hàm lượng đường còn lại trong môi trường lên men bởi nấm men cố định luôn thấp hơn so với môi trường lên men bởi nấm men tự do. Đồng thời, hàm lượng đường sót trong canh trường của nấm men cố định cũng thấp hơn so với nấm men tự do (trừ trường hợp hàm lượng đường ban đầu là 200g/L thì sự khác nhau là không có nghĩa) (bảng 4.2). Bên cạnh đó, tốc độ sử dụng đường (thể hiện rõ hơn qua giá trị tốc độ sử dụng đường cực đại được trình bày trong bảng 4.3) của nấm men cố định cũng cao hơn so với nấm men tự do (trừ trường hợp hàm lượng đường ban đầu là 200g/L). Điều đó dẫn tới tốc độ sử dụng đường riêng và tốc độ sử dụng đường riêng cực đại (Hình 4.6, bảng 4.4) của nấm men cố định cũng cao hơn nhiều so với nấm men tự do. Tốc độ sử dụng đường riêng cực đại của nấm men cố định cao hơn khoảng 2 – 3 lần so với nấm men tự do.
Bảng 4.17: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến hàm lượng đường sót trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate.
Hàm lượng đường ban đầu (g/L)
Hàm lượng đường sót (g/L) Nấm men cố định Nấm men tự do
200 2,01 ± 0,43a 2,40 ± 0,44a
240 3,10 ± 0,26a 7,80 ± 0,72b
280 10,00 ± 1,00b 15,32 ± 0,14c
320 22,73 ± 1,55d 85,80 ± 2,55f
360 76,95 ± 1,92e 124,98 ± 3,58g
Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của 3 mẫu độc lập. Các giá trị có ký hiệu khác nhau biểu thị sự khác nhau có nghĩa (P < 0,05).
Hình 4.32: Sự thay đổi tốc độ sử dụng đường trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L).
Dựa vào sự thay đổi tốc độ sử dụng đường trong suốt quá trình lên men (Hình 4.5), chúng tôi cũng thấy rằng tốc độ sử dụng đường của nấm men cố định đạt cực đại sau 12h lên men (trừ trường hợp hàm lượng ban đầu là 360g/L thì sau 36h lên men), trong khi đó tốc độ sử dụng đường của nấm men tự do đạt cực đại trễ hơn, sau 36h lên men. Tương tự như vậy, nấm men cố định cũng đạt được giá trị tốc độ sử dụng đường riêng cực đại nhanh hơn nhiều so với nấm men tự do (12h so với 36h) (Hình 4.6).
Hình 4.33: Sự thay đổi tốc độ sử dụng đường riêng trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L).
Điều đó cho thấy nấm men cố định có khả năng sử dụng đường nhanh hơn và triệt để hơn so với nấm men tự do, hay nói cách khác, khả năng trao đổi chất của nấm men cố định tốt hơn nhiều so với nấm men tự do. Ngoài nguyên nhân là nấm men cố định có khả năng chịu được áp suất thẩm thấu cao như trong phần 4.1.1 đã giải thích, nguyên nhân của hiện tượng này còn có thể được giải thích là do nấm men cố định đã có những thay đổi trong thành phần tế bào nên đã làm tăng khả năng vận chuyển các chất qua màng tế bào.
Ngoài ra, chúng tôi cũng thấy rằng khi hàm lượng đường ban đầu càng tăng thì hàm lượng đường sót cũng càng tăng. Đó là do khi nấm men đã lên men tới một mức độ nhất định, hàm lượng cồn tăng cao, nên đã ức chế hoạt động của nấm men, làm cho nấm men không còn khả năng tiếp tục sử dụng đường nữa.
Đối với nấm men cố định, khi hàm lượng đường tăng từ 200 – 240g/L thì tốc độ sử dụng đường cực đại tăng từ 3,32 – 3,91g/L/h. Nhưng khi hàm lượng đường tăng tiếp từ 240 – 320g/L thì tốc độ sử dụng đường thay đổi không đáng kể (P < 0,05). Còn khi hàm lượng đường ban đầu đạt đến 360g/L thì tốc độ sử dụng đường cực đại giảm xuống 3,59g/L/h. Tuy nhiên, đối với nấm men tự do thì khi hàm lượng càng tăng, tốc độ sử dụng đường cực đại càng giảm. Hiện tượng này cũng được giải thích là do nấm men cố định ít bị ức chế hơn so với nấm men tự do trong môi trường có nồng độ cơ chất cao. Chỉ khi nồng độ cơ chất rất cao (360g/L) thì mới làm giảm tốc độ sử dụng đường của nấm men cố định.
Bảng 4.18: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sử dụng đường cực đại của nấm men trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate.
Hàm lượng đường ban đầu (g/L)
Tốc độ sử dụng đường cực đại gSmax (g/L/h) Nấm men cố định Nấm men tự do
200 3,32 ± 0,07c 3,72 ± 0,07e