quá trình sinh trưởng của nấm men
Kết quả khảo sát động học quá trình sinh trưởng của nấm men được chúng tôi trình bày trong hình 4.18, hình 4.19, hình 4.20 và bảng 4.13. Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng khi hàm lượng tannin ban đầu càng tăng thì mật độ tế bào càng giảm và tốc độ sinh trưởng riêng, nhìn chung, cũng càng giảm.
−Đối với nấm men cố định, khi hàm lượng tannin tăng từ 1,8 – 17,8g/L thì mật độ tế bào nấm men cực đại giảm từ 223.106 tế bào xuống còn 190,78.106 tế bào. Tốc độ sinh trưởng riêng cực đại cũng giảm từ 0,340 xuống còn 0,371 h-1.
−Đối với nấm men tự do, khi hàm lượng tannin tăng từ 1,8 – 17,8g/L thì mật độ tế bào nấm men cực đại giảm từ 240,63.106 tế bào xuống còn 178,7.106 tế bào. Tốc độ sinh trưởng riêng cực đại cũng giảm từ 0,682 xuống còn 0,052 h-1.
Qua đó, chúng tôi thấy rằng tannin có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh trưởng của nấm men, làm kìm hãm sự sinh sản của nấm men. Một số tác giả đã đưa ra những giả thuyết khác nhau để giải thích cho hiện tượng này. Tuy nhiên, cơ chế cụ thể thì vẫn chưa được nghiên cứu rõ ràng:
−Yajima và Yokotsuka (2001) cho rằng tannin hấp phụ lên bề mặt nấm men, do đó làm ảnh hưởng đến khả năng vận chuyển các chất qua màng [208].
−Wauters và cộng sự (2001b) thì cho rằng acid tannic ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp chuỗi hô hấp (functional respiratory chain), dẫn đến hiện tượng thiếu hụt sắt, do đó làm giảm tốc độ sinh trưởng của nấm men [204].
−Một giả thuyết khác là acid tannic ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp các acid béo không no và/hoặc sterol, do đó làm giảm khả năng hấp thu O2 của nấm men, vì thế tốc độ sinh trưởng của nấm men giảm. Hoặc cũng có thể acid tannic liên kết mạnh với các thành phần này (đây là các lipid màng) nên đã làm giảm khả năng hấp thu O2 (Wauters và cộng sự, 2001a,2001b; Mazauric và Salmon, 2005) [95, 203, 204].
Hình 4.45: Sự thay đổi mật độ tế bào nấm men trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi trong khoảng 1,8 – 17,8g/L).
Soto và Huber (1968) khi nghiên cứu ảnh hưởng của tannin đến quá trình lên men phụ rượu champagne cũng đã kết luận rằng hàm lượng tannin cao ức chế sự sinh trưởng của nấm men. Mật độ tế bào cực đại giảm khoảng 3,6; 11,7; 22,5 và 29,7% khi thêm tannin với lượng 0,5; 1,7; 2,9 và 4,1g/L vào rượu vang có chứa 0,3g/L tannin [50].
Bên cạnh đó, chúng tôi còn nhận thấy rằng khi hàm lượng tannin ban đầu tăng từ 1,8 – 2,8g/L thì mật độ tế bào nấm men tự do cực đại cao hơn nấm men cố định và tốc độ sinh trưởng riêng cực đại của tế bào tự do cũng cao hơn. Nhưng khi hàm lượng tannin nằm trong khoảng 9,8 – 17,8g/L thì mật độ tế bào tự do cũng như tốc độ sinh trưởng riêng của tế bào tự do đều thấp hơn so với tế bào cố định. Còn khi hàm lượng tannin là 3,8g/L thì tuy nấm men tự do có tốc độ sinh trưởng riêng cực đại lớn nhưng mật độ tế bào cực đại lại thấp hơn. Điều đó chứng tỏ rằng hàm lượng tannin cao ức chế sự sinh trưởng của nấm men tự do nhiều hơn so với nấm men cố định. Theo chúng tôi, nguyên nhân có thể là do: tannin là một đại phân tử nên khả năng khuếch tán qua gel alginate rất hạn chế. Vì thế, tế bào nấm men cố định ít tiếp xúc với tannin hơn nên ít bị ảnh hưởng hơn.
Qua kết quả khảo sát ANOVA (bảng 4.13), chúng tôi còn thấy rằng khi hàm lượng tannin ban đầu tăng từ 1,8 – 2,8g/L thì tốc độ sinh trưởng riêng cực đại µmax của nấm men cố định và nấm men tự do đều không bị ảnh hưởng (P < 0,05). Còn khi hàm lượng tannin tăng từ 2,8 – 3,8g/L thì µmax của tế bào cố định giảm chậm, khoảng 2 lần; trong khi đó, µmax của tế bào tự do giảm nhanh, khoảng 6 lần. Sau đó, khi tannin tăng từ 3,8 - 9,8g/L thì µmax giảm chậm lại, còn khi tannin tăng từ 9,8 lên tới 17,8g/L thì µmax giảm đi khoảng một nửa. Qua đó, chúng tôi thấy rằng nấm men tự do thực sự bị ức chế mạnh khi hàm lượng tannin là 3,8g/ L. Nấm men cố định cũng bắt đầu bị ức chế khi hàm lượng tannin ban đầu đạt đến giá trị này nhưng sự ức chế ít hơn so với nấm men tự do.
Hình 4.46: Sự thay đổi tốc độ sinh trưởng riêng của nấm men trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi trong khoảng 1,8 – 9,8g/L).
Quan sát thời gian để tốc độ sinh trưởng riêng đạt đến giá trị cực đại của tế bào nấm men tự do và tế bào nấm men cố định, chúng tôi cũng nhận thấy rằng hàm lượng tannin có ảnh hưởng rõ ràng đến sự sinh trưởng của nấm men. Khi hàm lượng tannin nằm trong khoảng 1,8 – 2,8g/L thì thời gian này là khoảng 4h, còn khi hàm lượng tannin nằm trong khoảng 3,8 – 9,8g/L thì thời gian này khoảng 8h. Còn nếu như tăng lên đến 17,8g/L thì thời gian này là 12h. Như vậy, hàm lượng tannin càng cao thì sự khuếch tán cơ chất và sự hấp thu O2 diễn ra càng chậm, đồng thời ion sắt càng thiếu cho nên nấm men cần thời gian lâu hơn để đạt đến tốc độ sinh trưởng riêng cực đại.
Cũng tương tự như phần 4.1 đã khảo sát, sau khi đạt đến mật độ cực đại, mật độ tế bào nấm men cố định giảm chậm trong khi mật độ tế bào nấm men tự do giảm rất nhanh.
Nguyên nhân cũng có thể là do nấm men tự do bị ức chế bởi hàm lượng cồn có trong môi trường nhiều hơn so với nấm men cố định.
Hình 4.47: Sự thay đổi tốc độ sinh trưởng riêng của nấm men trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate khi hàm lượng tannin ban đầu là 17,8g/L.
Bảng 4.28: Aûnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sinh trưởng riêng cực đại trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate.
Hàm lượng tannin ban đầu (g/L)
Tốc độ sinh trưởng riêng cực đại µmax (h-1) Nấm men cố định Nấm men tự do
1,8 0,340 ± 0,008f 0,682 ± 0,013g
2,8 0,338 ± 0,009f 0,680 ± 0,014g
3,8 0,160 ± 0,012e 0,132 ± 0,006c
9,8 0,142 ± 0,013d 0,130 ± 0,011cd
17,8 0,071 ± 0,009b 0,052 ± 0,006a
Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của 3 mẫu độc lập. Các giá trị có ký hiệu khác nhau biểu thị sự khác nhau có nghĩa (P < 0,05).
3.5.2Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tannin đến động học quá trình sử dụng cơ chất trong quá trình lên men
Hình 4.48: Sự thay đổi nồng độ chất khô trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi trong khoảng 1,8 – 17,8g/L).
Kết quả khảo sát của chúng tôi về ảnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến quá trình sử dụng chất khô trong lên men vang được trình bày như trong hình 4.21. Và cũng tương tự như khi khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường, chúng tôi khảo sát khả năng sử dụng cơ chất của nấm men cố định thông qua quá trình sử dụng đường và quá trình sử dụng nitơ (nitơ amin tự do và nitơ ammonium).
Quan sát sự thay đổi nồng độ chất khô trong suốt quá trình lên men chính (hình 4.21), chúng tôi nhận thấy rằng khi hàm lượng tannin ban đầu càng tăng thì nồng độ chất khô còn lại trong dịch lên men càng nhiều. Đồng thời, nồng độ chất khô trong dịch lên men bởi nấm men cố định luôn nhỏ hơn nấm men tự do.
3.5.2.1Quá trình sử dụng đường
Qua kết quả của chúng tôi về sự thay đổi hàm lượng đường trong suốt quá trình lên men (hình 4.22), chúng tôi nhận thấy rằng mặc dù mối tương quan giữa tốc độ sinh trường riêng cũng như mật độ của tế bào nấm men cố định và tế bào nấm men tự do thay đổi khi hàm lượng tannin thay đổi, nhưng trong quá trình lên men, khả năng sử dụng đường của nấm men cố định luôn tốt hơn so với nấm men tự do. Hàm lượng đường sót còn lại trong môi trường của dịch lên men bằng nấm men cố định luôn thấp hơn so với nấm men tự do (bảng 4.14).
Hình 4.49: Sự thay đổi hàm lượng đường trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi trong khoảng 1,8 – 17,8g/L).
Tương tự như vậy, nhìn chung, khi hàm lượng tannin càng tăng thì tốc độ sử dụng đường cực đại càng giảm (hình 4.23, bảng 4.15) và tốc độ sử dụng đường cực đại của nấm men cố định cũng lớn hơn so với nấm men tự do. Khoảng cách này khá lớn khi hàm lượng tannin nằm trong khoảng 1,8 – 9,8g/L. Tuy nhiên, khi hàm lượng tannin ban đầu là 17,8g/L thì không có sự khác biệt giữa nấm men cố định và nấm men tự do (P < 0,05). Điều này cũng cho thấy rằng, khi hàm lượng tannin quá cao, tốc độ sử dụng đường của nấm men cố định cũng bị ức chế mạnh.
Và chúng tôi cũng thấy rằng thời gian cần thiết để tốc độ sử dụng đường của nấm men cố định đạt cực đại cũng luôn luôn ngắn hơn so với nấm men tự do. Điều đó cho thấy nấm men cố định có khả năng sử dụng đường rất nhanh. Khi hàm lượng tannin ban đầu nằm trong khoảng 1,8 – 9,8g/L, thời gian cần thiết để nấm men cố định đạt đến tốc độ sử dụng đường cực đại là khoảng 12h. Chỉ khi hàm lượng tannin tăng lên đến 17,8g/L thì thời gian mới dài hơn nhiều, lên tới 180h. Trong khi đó đối với nấm men tự do, khi hàm lượng tannin ban đầu là 9,8g/L thì thời gian này đã kéo dài đến 108h. Còn khi hàm lượng tannin ban đầu là17,8g/L thì thời gian này là204h.
Bảng 4.29: Aûnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến hàm lượng đường sót trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate.
Hàm lượng tannin ban đầu (g/L)
Hàm lượng đường sót (g/L) Nấm men cố định Nấm men tự do
1,8 4,02 ± 0,46a 5,75 ± 0,66bc
2,8 4,31 ± 0,60a 6,01 ± 0,48cd
3,8 4,51 ± 0,50ab 7,03 ± 0,96d
9,8 7,20 ± 0,72d 9,70 ± 0,61e
17,8 10,00 ± 1,32e 17,40 ± 0,53f
Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của 3 mẫu độc lập. Các giá trị có ký hiệu khác nhau biểu thị sự khác nhau có nghĩa (P < 0,5).
Hình 4.50: Sự thay đổi tốc độ sử dụng đường trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi trong khoảng 1,8 – 17,8g/L).
Bảng 4.30: Aûnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sử dụng đường cực đại trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate.
Hàm lượng tannin ban đầu (g/L)
Tốc độ sử dụng đường cực đại gSmax (g/L/h) Nấm men cố định Nấm men tự do
1,8 4,08 ± 0,11h 3,34 ± 0,09e
2,8 3,80 ± 0,07g 3,28 ± 0,07e
3,8 3,50 ± 0,10f 3,01 ± 0,07d
9,8 2,51 ± 0,10c 1,60 ± 0,04b
Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của 3 mẫu độc lập. Các giá trị có ký hiệu khác nhau biểu thị sự khác nhau có nghĩa (P < 0,05).
Mặc dù tốc độ sử dụng đường của nấm men cố định không cao hơn đáng kể so với nấm men tự do nhưng tốc độ sử dụng đường riêng của nấm men cố định lại chiếm ưu thế hẳn (hình 4.24, bảng 4.16). Qua kết quả khảo sát, chúng tôi thấy rằng tốc độ sử dụng đường riêng cưc đại của nấm men cố định cao gấp 2 – 4 lần so với nấm men tự do. Hàm lượng tannin trong khoảng 1,8 – 9,8g/L không ảnh hưởng đáng kể đến tốc độ sử dụng đường riêng cực đại của nấm men cố định.
Hình 4.51: Sự thay đổi tốc độ sử dụng đường riêng trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi trong khoảng 1,8 – 17,8g/L).
Bảng 4.31: Aûnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sử dụng đường riêng cực đại (chỉ xét cho giá trị cực đại đầu tiên) trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate.
Hàm lượng tannin ban đầu (g/L)
Tốc độ sử dụng đường riêng cực đại γPmax (g/h/1012 tế bào) Nấm men cố định Nấm men tự do
1,8 47,0 ± 1,8d 17,1 ± 1,7b
2,8 51,7 ± 2,3e 17,9 ± 2,0b
3,8 49,8 ± 2,4de 24,8 ± 2,6c
9,8 48,0 ± 1,8d 12,0 ± 0,9a
17,8 17,7 ± 1,5b 10,8 ± 1,6a
Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của 3 mẫu độc lập. Các giá trị có ký hiệu khác nhau biểu thị sự khác nhau có nghĩa (P < 0,5).
Tất cả những điều này cho thấy rằng khả năng sử dụng đường của nấm men cố định nhanh hơn và triệt để hơn so với nấm men tự do. Theo chúng tôi, nguyên nhân cũng là do khả năng trao đổi chất của tế bào nấm men tự do bị ảnh hưởng rất nhiều do sự hấp phụ của tannin lên bề mặt, làm cản trở sự vận chuyển glucose vào bên trong tế bào. Đồng thời, do tiếp xúc trực tiếp với tế bào nấm men nên tannin cũng ảnh hưởng mạnh đến quá trình tổng hợp các acid béo không no và/hoặc sterol của nấm men tự do nên cũng làm ảnh hưởng đến khả năng vận chuyển các chất qua màng. Hàm lượng tannin càng nhiều thì sự ức chế càng nhiều. Nấm men cố định ít bị ức chế hơn, cũng như ở phần 4.2.1 đã giải thích, đó là do nấm men cố định đã được bảo vệ bởi chất mang.
Bên cạnh đó, chúng tôi còn nhận thấy rằng, nhìn chung, khi hàm lượng tannin càng tăng thì hàm lượng đường sót càng tăng. Có nghĩa là nấm men không có khả năng sử dụng hết hàm lượng đường có trong môi trường. Nguyên nhân cũng được giải thích là do sự vận chuyển các chất qua màng bị cản trở.
Do khi hàm lượng tannin càng tăng thì hàm lượng đường sót càng tăng, nghĩa là ứng với mỗi giá trị tannin thì độ lên men là khác nhau. Tuy nhiên, sự khác biệt này là không nhiều, cho nên để thuận tiện cho việc so sánh giữa nấm men tự do và nấm men cố định cũng như so sánh sự ảnh hưởng của hàm lượng tannin đến tốc độ sử đường, chúng tôi chọn một độ lên
men thống nhất cho tất cả các giá trị này là 92,75%. Thời gian lên men ứng với độ lên men này được chúng tôi trình bày như trong bảng 4.17. Kết quả cho thấy rằng thời gian lên men của nấm men cố định luôn ngắn hơn so với nấm men tự do. Sự khác biệt càng lớn khi hàm lượng tannin ban đầu càng cao. Điều đó cho thấy rằng nấm men cố định càng chiếm ưu thế về thời gian lên men khi hàm lượng tannin ban đầu càng cao. Khi hàm lượng tannin tăng từ 1,8 – 2,8g/L thì không làm ảnh hưởng đến thời gian lên men của nấm men cố định cũng như của nấm men tự do (P < 0,05).
Dựa vào thời gian lên men xác định được, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sử dụng đường trung bình trong toàn bộ quá trình lên