Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ như hàm lượng đường và hàm lượng tannin ban đầu đến động học quá trình lên men chính trong sản xuất rượu vang nho sử dụng nấm men cố định trong gel alginate. Nội dung nghiên cứu của chúng tôi được trình bày chi tiết như trong hình 3.2.
Hình 3.26: Sơ đồ nghiên cứu N ội d un g ng hi ên c ứu
Nghiên cứu động học quá trình sử dụng cơ chất trong quá trình lên men
Khảo sát sự thay đổi mật độ tế bào nấm men trong hạt gel Ca-alginate
Khảo sát sự thay đổi mật độ tế bào nấm men bên ngoài hạt gel
Khảo sát sự thay đổi của hàm lượng đường khử trong quá trình lên men
Khảo sát sự thay đổi của hàm lượng nitơ trong quá trình lên men
Nghiên cứu động học quá trình hình thành sản phẩm trong quá trình lên men
Khảo sát sự hình thành ethanol trong quá trình lên men
Ảnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến quá trình lên men
Ảnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến quá trình lên men
Nghiên cứu động học quá trình sinh trưởng của nấm men
Khảo sát sự chuyển hóa của các acid hữu cơ trong quá trình lên men
3.2.2Phương pháp cố định nấm men trong gel alginate
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành cố định nấm men trong gel alginate bằng phương pháp tạo gel từ bên ngoài. Quy trình cố định được mô tả như trong hình 3.3.
Nấm men Nhân giống Ly tâm Pha loãng Alginate Tạo dung dịch Hấp tiệt trùng Nước vô khuẩn
Trộn theo tỉ lệ 1:1 (v/v) Tạo hạt trong dd CaCl2
Rửa hạt
Hạt tế bào nấm men cố định
Làm nguội
Nước vô khuẩn
Phần lỏng
Hình 3.27: Quy trình cố định nấm men trong gel alginate bằng phương pháp tạo gel từ bên ngoài
• Nhân giống
−Nấm men trước khi sử dụng cần được nhân giống hai cấp:
• Cấp 1: lấy từ một đến hai vòng que cấy nấm men từ ống giống gốc để cấy vào 10mL môi trường nước nho (đã bổ sung thêm 150ppmN và đã được tiệt trùng), nuôi cấy trong 24h, ở nhiệt độ 30oC.
• Cấp 2: cho toàn bộ canh trường nhân giống cấp 1 vào 100mL môi trường nước nho (đã bổ sung thêm 150ppmN, hiệu chỉnh đến nồng độ chất khô là 15oBx và đã được tiệt trùng), nuôi cấy trong 24h, ở nhiệt độ 30oC.
• Ly tâm
−Sau khi nhân giống, nấm men được đem ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút, ở nhiệt độ 40C, thời gian 30 phút, để tách sinh khối.
• Pha loãng
−Dùng nước vô khuẩn pha loãng sinh khối nấm men đã ly tâm ở trên để đạt dung dịch huyền phù nấm men mật độ 50.106 tế bào/mL. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
• Tạo dung dịch alginate
• Hấp tiệt trùng
−Vô khuẩn dung dịch alginate ở 1210C, trong 20 phút.
• Làm nguội
−Làm nguội dung dịch alginate sau khi hấp tiệt trùng đến nhiệt độ thường.
• Trộn
−Trộn dịch huyền phù tế bào nấm men 50.106 tế bào/mL với dung dịch alginate 4% theo tỉ lệ 1:1 (v/v) để tạo hỗn hợp đồng nhất.
• Tạo hạt
−Nhỏ từng giọt hỗn hợp alginate natri-nấm men vào dung dịch CaCl2 2%. Đường kính ống nhỏ giọt 3mm, lỗ ra đặt cách mặt trên của dung dịch CaCl2 2cm, hạt được tạo thành có đường kính khoảng 4÷5mm. Dung dịch CaCl2 được khuấy đảo liên tục trên bàn khuấy từ với tốc độ 100÷200 vòng/phút. Mỗi giọt hỗn hợp alginate nấm men rơi xuống dung dịch sẽ tạo thành một hạt nấm men cố định.
• Ngâm hạt
−Hạt nấm men cố định tạo ra được ngâm trong dung dịch CaCl2 2% trong 2 giờ, tốc độ khuấy đảo hạt vẫn giữ từ 100÷200 vòng/phút. Ta phải thay mới dung dịch CaCl2 2% sau mỗi giờ ngâm để nồng độ ion Ca2+ trong dung dịch không bị giảm xuống quá thấp.
• Rửa hạt
−Chắt bỏ dung dịch CaCl2, rửa lại hạt gel bằng nước cất và dịch lên men để muối CaCl2
không còn bám trên bề mặt hạt gel. Chúng tôi tiến hành rửa hạt gel 2 lần bằng nước cất và một lần bằng dịch lên men cho tất cả các thí nghiệm.
−Hạt sau khi được tạo thành phải được tiến hành lên men ngay. Nếu muốn bảo quản hạt thì cho hạt gel chứa nấm men cố định vào dung dịch CaCl2 0,4%, bảo quản ở 5oC trong vòng tối đa là 24h.
3.2.3Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến động học quá trình lên men rượu vang nho sử dụng nấm men cố định trong gel alginate
Trong phần thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường đến động học quá trình lên men rượu vang nho, sử dụng nấm men cố định trong gel alginate. Quá trình lên men được thực hiện trong các erlen 500 chứa 450mL môi trường dịch nho, nhiệt độ lên men khoảng 22 ÷ 25oC. Môi trường dịch nho được hiệu chỉnh các thông số như trong bảng 3.2.
Bảng 3.14: Các chất bổ sung vào dịch nho khi khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến quá trình lên men
Thông số Chất bổ sung Giá trị đã hiệu chỉnh
Nitơ ammonium (NH4)2HPO4 195ppm N
SO2 Na2S2O5 112ppm SO2
pH NaOH 4
Hàm lượng đường glucose được hiệu chỉnh đến các giá trị sau: 200, 240, 280, 320 và 360g/L.
Chúng tôi cũng thực hiện các mẫu đối chứng được lên men bởi nấm men tự do. Mật độ nấm men sử dụng để lên men là 5.106 tế bào/mL. Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần để kiểm tra ý nghĩa sự khác biệt của các kết quả theo phương pháp ANOVA.
3.2.4Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến động học quá trình lên men rượu vang nho, sử dụng nấm men cố định trong gel alginate
Trong phần thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tannin đến động học quá trình lên men rượu vang nho sử dụng nấm men cố định trong gel alginate. Quá trình lên men được thực hiện trong các erlen 500 chứa 450mL môi trường dịch nho, nhiệt độ lên men khoảng 22 ÷ 25oC. Môi trường dịch nho được hiệu chỉnh các thông số như trong bảng 3.3.
Bảng 3.15: Các chất bổ sung vào dịch nho khi khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến quá trình lên men
Thông số Chất bổ sung Giá trị đã hiệu chỉnh
Đường Glucose 240g/L
Nitơ ammonium (NH4)2HPO4 195ppm N (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
SO2 Na2S2O5 112ppm SO2
pH NaOH 4
Sau khi bổ sung nồng độ chất khô đạt được là 22oBx.
Hàm lượng tannin được hiệu chỉnh đến các giá trị: 1,8; 2,8; 3,8; 9,8 và 17,8g/L bằng acid tannic. Chúng tôi cũng thực hiện các mẫu đối chứng được lên men bởi nấm men tự do. Mật độ nấm men sử dụng để lên men là 5.106 tế bào/mL. Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần để kiểm tra ý nghĩa sự khác biệt của các kết quả theo phương pháp ANOVA.
3.2.5Xử lý kết quả
3.2.5.1Xác định tốc độ sinh trưởng riêng
−Dựng đồ thị biểu diễn sự thay đổi mật độ nấm men theo thời gian: X = x(t)
−Xác định tốc độ sinh trưởng riêng của nấm men theo thời gian: ) t( f X 1 dt dX× = = µ
−Dựng đồ thị µ = f(t). Từ đó xác định được tốc độ sinh trưởng riêng cực đại µmax trên đồ thị.
−Kiểm tra ANOVA để so sánh giá trị µmax giữa các mẫu thí nghiệm với nhau.
3.2.5.2Xác định tốc độ sử dụng đường
− Dựng đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường theo thời gian: S = s(t)
−Xác định tốc độ sử dụng đường: gS t()= dSdt (g/L/h)
−Xác định tốc độ sử dụng đường riêng: γS t()= dSdt ×X1 (g/h/1012 tế bào)
−Xác định tốc độ sử dụng đường trung bình:
τ ∆ = S
KS (g/l/h)
• τ: thời gian lên men (h), được xác định dựa vào độ lên men α.
• ∆S: lượng đường được sử dụng trong thờigian lên men, g/L.
• Độ lên men:
o S S ∆ = α
• So: hàm lượng đường ban đầu, g/L.
−Kiểm tra ANOVA để so sánh các giá trị gS(max), γS(max) và KS giữa các mẫu với nhau.
3.2.5.3Xác định tốc độ sinh tổng hợp cồn
−Dựng đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng cồn theo thời gian: P = p(t)
−Xác định tốc độ sinh tổng hợp cồn: gP(t)= dPdt (g/L/h)
−Xác định tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng: γP(t)= dPdt ×X1 (g/h/1012 tế bào)
−Xác định tốc độ sinh tổng hợp cồn trung bình: KP = ∆τP (g/l/h) • τ: thời gian lên men (h), được xác định dựa vào độ lên men.
• ∆P: lượng cồn tạo thành trong thời gian lên men, g/L
−Xác định hiệu suất sinh tổng hợp cồn: η = SP//18046 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
∆
∆ (mol ethanol/ mol glucose)
• 46 và 180 lần lượt là phân tử lượng của ethanol và glucose.
3.3 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
3.3.1 pH
−Sử dụng máy đo pH.
3.3.2Nồng độ chất khô
−Sử dụng khúc xạ kế để bàn, đơn vị đo là oBx. 3.3.3Hàm lượng đường khử [4]
3.3.3.1Nguyên tắc
−Phương pháp này dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử với với thuốc thử 3,5 – dinitrosalicylic acid (thuốc thử DNS). DNS có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành acid 3–amino-5-nitrosalicylic có màu đỏ cam.
NO2 OH COOH NO2 3C6H12O6 + + 4NaOH NH2 OH COONa NO2 3C5H11COONa + 3H 2O
−Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định, được đo bằng máy quang phổ so màu. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử, ta sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu. Hợp chất tạo thành có độ hấp thu mạnh nhất trong khoảng bước sóng 540 – 600 nm.
3.3.3.2Hóa chất
• Thuốc thử 3,5-dinitrosalicylic acid
−Hòa tan 1g DNS (C7H4N2O7) và 1,6g NaOH trong khoảng 60 – 70mL nước cất. Sau đó cho 30g Kali Natri Tartrate (C4H4O6KNa.4H2O) vào hỗn hợp trên và khuấy cho tan hoàn toàn.
−Chuyển dung dịch trên vào bình định mức 100mL và định mức đến vạch.
−Dung dịch sau khi pha được bảo quản trong chai thủy tinh màu ở điều kiện lạnh (6-8oC), dùng tốt nhất trong 15 ngày.
• Dung dịch đường chuẩn
−Dung dịch đường chuẩn là dung dịch chứa hỗn hợp glucose và fructose với tỉ lệ 1:1 (w:w), có nồng độ là 2g/L.
3.3.3.3Cách tiến hành
−Vì trong dịch nho có chứa nhiều acid hữu cơ, các chất màu và nhiều tạp chất khác nên ta phải tiến hành xử lý mẫu hợp lý để không làm ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm.
• Acid hữu cơ: trung hòa acid trong mẫu bằng dung dịch NaOH 0,1N.
• Chất màu và các tạp chất khác: cho dung dịch Ba(OH)2 0,3N và ZnSO4 5% với tỷ lệ 1:1 vào mẫu → Ba(OH)2 và ZnSO4 phản ứng với nhau tạo kết tủa, tách các chất màu và các tạp chất khác và làm trong mẫu.
• Dựng đường chuẩn
−Lần lượt cho 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 và 1mL dung dịch chuẩn 2g/L vào 5 ống nghiệm khác nhau.
−Sau đó, lần lượt thêm vào các ống nghiệm 2,8; 2,6; 2,4; 2,2 và 2mL nước cất theo đúng thứ tự ống nghiệm như trên.
−Cho thêm vào mỗi ống nghiệm 1mL dung dịch DNS, lắc đều.
−Dùng một miếng nylon sạch bịt kín miệng ống nghiệm và tiến hành đun cách thủy ở nhiệt độ 100oC trong thời gian 5 phút.
−Làm nguội nhanh dung dịch, cho thêm 10mL nước cất và lắc đều cho đến khi dung dịch không còn phân lớp.
−Đo độ hấp thu A ở bước sóng λ = 540nm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
−Làm mẫu trắng với 1mL nước cất để hiệu chỉnh máy so màu về 0.
−Từ các kết quả đo được, ta tiến hành xây dựng đường chuẩn C = f(A).
• Xác định hàm lượng đường khử trong mẫu thí nghiệm
−Pha loãng mẫu sao cho nồng độ đường khử trong mẫu ≤ 2g/L.
−Lấy vào ống nghiệm 1mL mẫu, 2mL nước cất và 1mL dung dịch DNS, lắc đều. Sau đó tiến hành tương tự như trên.
−Từ đồ thị đường chuẩn ta xác định đường nồng độ đường khử có trong mẫu nghiên cứu. 3.3.4Hàm lượng nitơ amin tự do [4]
−Định lượng nitơ amin bằng phương pháp so màu với thuốc thử là ninhydrin.
3.3.4.1Nguyên tắc
−Cơ chế phản ứng: Khi pH lớn hơn 4, các gốc nitơ amin tự do sẽ phản ứng với ninhydrin, tạo phức có màu xanh tím.
O O O R CH NH2 COOH O O OH H NH3 CO2 RCHO + + + + ninhydrin khử ninhydrin
O O OH H NH3 O O O O O O O N + + + phức Ruheman (xanh tím) 2H2O 3.3.4.2Hoá chất
−Dung dịch chuẩn glycine: hòa tan 0,1072g glycine và định mức đến 100mL. Bảo quản ở 4oC. Trước khi sử dụng pha loãng dung dịch này 50 lần được dung dịch A.
−Hòa tan 10g Na2HPO4.12H2O, 6g KH2PO4, 0,5g ninhydrin và 0,3g fructose trong nước và định mức đến 100mL được dung dịch B. Chỉnh pH cuối 6,6 – 6,8. Dung dịch B được bảo quản trong tối ở 4oC, dùng trong 2 tuần.
−Hòa tan 1g KIO3 trong 300mL nước cất và 200mL cồn 96% v/v được dung dịch C. Dung dịch C được bảo quản ở 5oC.
3.3.4.3Cách tiến hành
−Pha loãng dịch nho và dịch lên men 50 lần.
−Cho 2mL dung dịch đã pha loãng và 1mL dung dịch B vào mỗi 3 ống nghiệm. Đun cách thủy (ở 100oC) trong 16 phút, làm nguội về nhiệt độ 20oC trong bể nước 20oC trong thời gian 20 phút.
−Cho tiếp vào ống nghiệm 5mL dung dịch C, lắc đều và đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 570nm trong vòng 30 phút.
−Làm 3 mẫu chuẩn song song với 2mL dung dịch A.
−Làm mẫu trắng với 2 mL dung dịch nước cất để hiệu chỉnh máy so màu về 0.
3.3.4.4Kết quả
N = AA x2x100 2
1
−Trong đó:
• N: số mg nitơ amin có trong 1L dịch nho cần đo, mg/L
• A1: độ hấp thu của mẫu thí nghiệm (giá trị trung bình).
3.3.5Hàm lượng nitơ ammonium [184] Xác định nitơ ammonium bằng phương pháp indophenol.
3.3.5.1Nguyên tắc
Indophenol là hợp chất có màu xanh, được tạo thành bằng phản ứng giữa ammonia, hypochlorite và phenol. Phản ứng này được xúc tác bởi sodium nitroprusside.
3.3.5.2Hoá chất (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
−Dung dịch phenol: trộn 11mL phenol lỏng (≥ 89%) và định mức thành 100mL bằng ethanol 95%. Dung dịch này chỉ dùng trong 1 tuần.
−Sodium nitroprusside 0,5%w/v: hoà tan 0,5g sodium nitroprusside vào trong 100mL nước. Dung dịch này dùng trong 1 tháng.
−Alkaline citrate: hòa tan 200g trisodium citrate và 10g NaOH trong nước cất → định mức thành 1L.
−Sodium hypochlorite 5%: đây là dung dịch có bán sẵn trên thị trường. Dung dịch này dùng trong 2 tháng.
−Dung dịch oxy hóa: trộn 100mL dung dịch alkaline citrate với 25mL sodium hypochlorite. Dung dịch này chỉ dùng trong 1 ngày.
−Dung dịch chuẩn N 1g/L: hòa tan 4,7143g (NH4)2HPO4 trong nước cất và định mức thành 1L.
−Dung dịch chuẩn N 10mg/L: hút 10mL dung dịch chuẩn N 1g/L và định mức thành 1L.
−Từ dung dịch chuẩn N 10mg/L pha loãng thành 5 dung dịch chuẩn: 0,1mg/L; 0,2mg/L; 0,3mg/L; 0,4mg/L và 0,5mg/L.
3.3.5.3Cách tiến hành
−Cho 25mL mẫu vào erlen 50mL, thêm vào đó:
• 1mL dung dịch phenol
• 1mL dung dịch sodium nitroprusside
• 2,5mL dung dịch oxy hóa
−Bao erlen bằng màng plastic, để ở nhiệt độ phòng (22 - 27oC) ở nơi có ánh sáng nhẹ trong vòng ít nhất là 1h. Dung dịch bền màu trong vòng 24h.
−Dựng đường chuẩn: tiến hành tương tự như trên với các dung dịch chuẩn 0,1mg/L; 0,2mg/L; 0,3mg/L; 0,4mg/L và 0,5mg/L.
−Cũng tiến hành tương tự với mẫu nước cất để hiệu chỉnh máy về 0.
3.3.6Hàm lượng tannin [4]
−Xác định hàm lượng tannin bằng phương pháp so màu sử dụng thuốc thử Folin – Denis.
3.3.6.1Nguyên tắc
−Tannin bị oxy hóa bởi acid phosphomolybdic tạo thành hợp chất có màu xanh.
3.3.6.2Hóa chất
−Thuốc thử Folin – Denis: cho 100g Na2WO4.2H2O, 20g acid phosphomolybdic và 50mL H3PO4 vào 750mL nước, cho chảy ngược dòng trong 2h, làm nguội, và pha loãng đến 1L.
−Dung dịch Natri carbonate bão hòa: cho 35g Na2CO3 khan vào 100mL nước, hòa tan ở