2.4. Kỹ thuật phân tích mẫu nghiên cứu
2.4.1. Tách DNA bằng qui trình Estonia, kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA bằng phương pháp đo mật độ quang bằng máy NanoDrop 2000C
Ngày 1:
- Cho 2,5ml máu vào ống 25ml, cho dung dịch Lysis buffer A vào đến 8,75ml dung dịch (6,25ml dung dịch Lysis), lắc, để lạnh trong 30 phút.
- Ly tâm 2000 vòng trong 10 phút ở 4°C.
- Bỏ dung dịch nổi, cho tiếp 7,5ml dung dịch Lysis buffer A vào ống.
- Ly tâm 2000 vòng trong 10 phút
- Bỏ dung dịch nổi, cho 1,6ml dung dịch TKM1 vào lắc 1 lần, cho tiếp 100µl dung dịch ở 25% NP-40 (250µl dung dịch 10% NP- 40) vào ống lắc đều.
- Để ống ở tủ -20°C.
Ngày 2:
- Làm tan chậm, ly tâm 2000 vòng trong 10 phút.
- Bỏ dung dịch nổi, cho 0,8ml dung dịch TKM2 vào. Trộn chậm bằng pipet cho đến khi tan tủa. Cho tiếp 30µl dung dịch 10% SDS vào và cho tiếp 0,8ml TKM2. Trộn bằng pipet đến khi tan tủa.
- Để lưu ống ở tủ ủ 56°C trong 20 phút.
- Cho nhanh 0,8ml dung dịch 5M NaCl vào trộn bằng pipet đến khi tan tủa.
- Ly tâm 2000 vòng trong 10 phút.
- Để dịch nổi vào ống 25ml chứa 6,25ml cồn ethanol 96% để lạnh ở -20°C.
- Trộn đều ống đến khi nhìn thấy tủa DNA thì dùng pipet pasteur lấy tủa DNA cho vào ống chứa cồn 70% lạnh để rửa.
- Sau rửa để khô cồn bằng cách dựng ngược pipet pasteur.
- Cho DNA vào ống 1,5ml chứa 0,25ml dung dịch 1X TE buffer, lắc cho đến khi DNA tan hết.
- Lưu ở tủ -20°C.
2.4.2. Xác định kiểu gen bằng phương pháp RFLP-PCR
Bước 1: Dùng phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gen cần phân tích
2.4.3. Phương pháp giải trình tự gen trực tiếp (Sequencing)