NGHIÊN cứu mối LIÊN QUAN GIỮA đa HÌNH KIỂU GEN MTHFR c677t với mật độ XƯƠNG và NGUY cơ gãy XƯƠNG đốt SỐNG ở PHỤ nữ mãn KINH VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THANH TÙNG NGHI£N CøU MốI LIÊN QUAN GIữA ĐA HìNH KIểU GEN MTHFR C677T VớI MậT Độ XƯƠNG Và NGUY CƠ GÃY XƯƠNG ĐốT SèNG ë PHơ N÷ M·N KINH VIƯT NAM ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THANH TÙNG NGHI£N CøU MốI LIÊN QUAN GIữA ĐA HìNH KIểU GEN MTHFR C677T VớI MậT Độ XƯƠNG Và NGUY CƠ GÃY XƯƠNG ĐốT SèNG ë PHơ N÷ M·N KINH VIƯT NAM Chun ngành: Sinh Lý Học Mã số: 62720405 ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Huy Bình TS Nguyễn Thị Thanh Hương HÀ NỘI – 2016 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BMD Bone Mineral Density (mật độ xương) BMI Body Mass Index (chỉ số khối thể) CXĐ Cổ xương đùi CSTL Cột sống thắt lưng DNA Deoxyribonucleic acid F Forward primer Hcy Homocystein MTHFR Methylene Tetrahydrofolat Reductase Rw Reverse wild type primer Rm Reverse mutation primer SNP Single nucleotide polymorphism MỤC LỤC PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Loãng xương bệnh lý xương, đặc trưng giảm mật độ xương giảm chất lượng xương, dẫn đến tăng nguy gãy xương Loãng xương hậu gãy xương, công nhận vấn đề y tế công cộng tồn cầu quan trọng Lỗng xương ngun phát bao gồm loãng xương sau mãn kinh loãng xương tuổi già Loãng xương sau mãn kinh thường gặp phụ nữ sau mãn kinh sau cắt bỏ buồng trứng khoảng 5-10 năm, liên quan đến thiếu hụt estrogen [1] Gãy xương lỗng xương có liên quan đến tăng tỷ lệ tử vong, tỷ lệ mắc bệnh kết hợp giảm chất lượng sống Toàn giới ước tính có 200 triệu người mắc bệnh lỗng xương [2] Tại Việt Nam, gần 1/3 số phụ nữ 50 tuổi có biểu bệnh lỗng xương 23% phụ nữ độ tuổi 50-65 bị loãng xương tỷ lệ cao Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc quần thể da trắng [3] Loãng xương khó phát giai đoạn đầu, thường phát có biến chứng Biến chứng trầm trọng loãng xương gãy xương Trên giới có 8,9 triệu trường hợp gãy xương lỗng xương, trung bình giây lại có trường hợp gãy xương [4] Khoảng nửa phụ nữ bị gãy xương tử vong vòng năm Đối với bệnh nhân may mắn sống sót họ mắc nhiều biến chứng chất lượng sống bị giảm đáng kể Lỗng xương xảy nhiều vị trí, nhiên với mức độ nghiêm trọng gãy xương cột sống, việc quan tâm mực đến bệnh nhân lỗng xương vơ quan trọng Phát điều trị y tế giai đoạn loãng xương chưa có biến chứng giúp giảm thiểu tỷ lệ gãy xương cột sống, giảm chi phí y tế, nâng cao đời sống tuổi thọ bệnh nhân Gần nhiều nghiên cứu chứng minh nồng độ homocystein máu cao có liên quan đến bệnh lý lỗng xương gãy xương Homocystein acid amin có chứa thiol hình thành q trình trao đổi chất methionin Tình trạng tăng homocystein bệnh di truyền lặn NST thường đặc trưng tăng lưu hành homocystein khởi đầu sớm loãng xương, gãy xương [5], [6] số liệu từ hai nghiên cứu tập cho thấy tổng mức homocystein huyết tương có liên quan đến gãy xương lỗng xương [7], [8] Người ta chứng minh số enzym, bao gồm 5,10 – methylene tetrahydrofolate reductase (MTHFR), đóng vai trị quan trọng chuyển hóa homocysteine Một đột biến điểm gen MTHFR (C677T), gây thay acid amin valine thành alanine, liên quan với giảm hoạt động enzym tăng homocysteine máu Một số nghiên cứu báo cáo đa hình kết hợp với hai kiện tăng nguy gãy xương loãng xương [9], [10] suy giảm BMD [11], [12], [13], [14] Để chẩn đốn sớm tiên lượng nguy lỗng xương gãy xương phụ nữ mãn kinh nhằm dự phịng điều trị kịp thời, chúng tơi tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu mối liên quan đa hình kiểu gen MTHFR C677T với mật độ xương nguy gãy xương đốt sống phụ nữ mãn kinh Việt Nam” với mục tiêu là: Xác định tỷ lệ đa hình kiểu gen MTHFR C677T phụ nữ mãn kinh Việt Nam Xác định mối liên quan đa hình kiểu gen MTHFR C677T với mật độ xương nguy gãy xương đốt sống phụ nữ mãn kinh Việt Nam Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bệnh loãng xương 1.1.1 Định nghĩa Loãng xương hệ cân đối hai trình tạo xương hủy xương, mức độ hủy xương cao mức độ tạo xương Sự cân đối dẫn đến tình trạng thể bắt đầu xương Mất xương dẫn đến tình trạng lực xương suy giảm, làm tăng nguy gãy xương Bởi tế bào hủy xương tế bào trình phân hủy xương, hầu hết thuốc phát triển để điều trị loãng xương đặt mục tiêu ức chế tế bào hủy xương Theo định nghĩa WHO (2001): Loãng xương đặc trưng thay đổi sức mạnh xương Sức mạnh đặc trưng mật độ xương chất lượng xương Chất lượng xương đánh giá cấu trúc xương, chu chuyển xương, độ khống hóa, tổn thương tích lũy, tính chất chất xương Trong đó, chu chuyển xương đóng vai trị quan trọng Hình 1.1 Mơ hình xương bình thường lỗng xương (Nguồn: www.tudu.com.vn) 1.1.2 Dịch tễ Theo ước tính, có khoảng 200 triệu người bị lỗng xương tồn giới Tỷ lệ lỗng xương nữ:nam 4:1 [15] Theo Tổ chức loãng xương quốc gia Mỹ (National Osteoporosis Foundation) 2015, 54 triệu người Mỹ bị loãng xương thiếu xương Ở châu Âu, gần 1/3 số phụ nữ mãn kinh phải đối mặt với loãng xương 40% bị gãy xương lần đời [16] Tỷ lệ tử vong tăng cao với biến chứng gãy xương, 50% phụ nữ gãy CXĐ, 28% với gãy cột sống 22% gãy xương khác [4] Ở châu Á, 70 triệu người 50 tuổi chung sống với loãng xương [17] Tại Ấn Độ năm 2003, số bệnh nhân loãng xương 26 triệu người, tăng lên 36 triệu vào năm 2013 [18] Tại Trung Quốc có 70 triệu bệnh nhân loãng xương 50 tuổi [19] Tại Việt Nam, khoảng 30% phụ nữ 50 tuổi có triệu chứng bệnh lỗng xương , 100000 ca gãy xương bệnh nhân nữ 60000 bệnh nhân nam [3] 1.1.3 Chẩn đoán Từ năm 2002, hội nghị quốc tế loãng xương thống quan điểm giá trị loại máy đo mật độ xương: máy đo mật độ xương dùng siêu âm có giá trị tầm sốt, có máy sử dụng tia X lượng kép, gọi Dual Energy X-ray absorptiometry (DXA) có giá trị chẩn đoán Nguyên tắc phương pháp sử dụng tia X lượng kép dùng tia X có mức lượng khác quét qua khối xương, máy đo độ 10 hấp thụ lượng tia X xương, tính mật độ xương (Bone mineral density) Sau đo BMD, người ta tính số T (T-score) số BMD cá thể so với BMD tối đa quần thể trẻ tuổi làm chuẩn BMD tối đa phải ước tính từ quần thể mang tính đại diện cao cho dân tộc (vì BMD khác biệt dân tộc) Chỉ số T tính theo cơng thức sau đây: - iBMD mật độ xương đối tượng i pBMD mật độ xương tối đa quần thể độ tuổi 20-30 (còn gọi - mật độ xương đỉnh – peak bone mineral density) SD độ lệch chuẩn BMD trung bình quần thể độ tuổi 20-30 Tiêu chuẩn chẩn đốn lỗng xương theo WHO sau [20] Bảng 1.1 Tiêu chuẩn chẩn đốn lỗng xương WHO T-score Chỉ số T cao -1 Chỉ số T khoảng -2,5 đến -1,0 Chỉ số T thấp -2,5 Loãng xương + tiền sử gãy xương gần Chẩn đốn Bình thường Thiếu xương Loãng xương Loãng xương nghiêm trọng Giá trị pBMD trung bình quần thể quốc gia khác Ví dụ pBMD phụ nữ người Việt Nam cổ xương đùi (0,94 ±0,11 g/cm2) [21] tương tự Hàn Quốc [22], Trung Quốc [23], cao so với phụ nữ Indonexia (0,91±0,12 g/cm2), Nhật Bản (0,90±0,12 g/cm2) [24] thấp so với phụ nữ da trắng Úc (1,02±0,13 g/cm 2) [25] Mỹ (0,98±0,12 g/cm2) [22] Do vậy, để chẩn đốn xác người Việt Nam bị loãng xương cần phải áp dụng giá trị tham chiếu người Việt Nam (Bảng 1.2) Bảng 1.2 Mật độ xương đỉnh trung bình (g/cm2) quần thể phụ nữ Việt Nam đo máy Hologic [9] [26] MẪU BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU I Thông tin Họ tên: Tuổi: Giới tính: Dân tộc: Khu vực sinh sống: 1.Nơng thơn 2.Thành thị Trình độ học vấn: 1.Cấp I 2.Cấp II 3.Cấp III 4.Đại học 5.Sau đại học 6.Không rõ II Các số nhân trắc Chiều cao (cm): Chiều cao tối đa (cm): Cân nặng (kg): Chiều dài chân (cm): Chiều dài đùi (cm): Chiều dài cẳng chân (cm): Sải tay (cm): Vòng ngực (cm): Vòng eo (cm): Vịng mơng (cm): III Chỉ số sinh tồn: Nhiệt độ (oC): Nhịp thở (lần/phút): Nhịp tim (lần/phút): Huyết áp tâm thu (mmHg): Huyết áp tâm trương (mmHg): IV Tiền sử: Tiền sử gãy xương: Số lần gãy xương: Số lần chẩn đoán X Quang: Năm bị gãy xương: Vị trí gãy: Mức độ gãy: Tiền sử gia đình có bị lỗng xương khơng: Tiền sử gia đình có bị gãy xương lỗng xương khơng: Tiền sử mắc bệnh mạn tính: Tiền sử dùng thuốc kéo dài (≥1 tháng): V Tiền sử kinh nguyệt – thai nghén – sản phụ khoa: Bắt đầu hành kinh năm tuổi: Thời gian hành kinh kéo dài ngày: Chu kì kinh kéo dài ngày: Chu kì kinh có đặn khơng: Trung bình năm bác có chu kì kinh: Bác có chưa: Bác có cho bú khơng: Bác có lần đầu năm tuổi: Bác có người con: Bác mang thai lần: Bác có lần sinh non khơng: Bác có lần xảy thai không: Bác mãn kinh năm tuổi (mãn kinh định nghĩa kinh hoàn tồn 12 tháng): Năm tuổi bác có biểu tiền mãn kinh (cơn bốc hỏa, choáng váng, nhức đầu, buồn nôn, đánh trông ngực, da khô, mỏng, nhăn nheo lớp mỡ da, khô âm đạo, teo âm hộ, giảm tiết chất nhờn, són tiểu, thay đổi tâm lý hay lo lắng cáu gắt): Năm tuổi bác bắt đầu thấy kinh nguyệt thay đổi (kinh nguyệt không đều, rong kinh, rong huyết liên quan đến mãn kinh): Bác dùng thuốc tránh thai chưa (loại thuốc, liều dùng, thời gian dùng): Bác dùng hormon thay sau mãn kinh chưa (loại hormon nào, liều dùng, thời gian dùng): VI Các số xét nghiệm cận lâm sàng: - Công thức máu: Hồng cầu(T/l): HGB(g/l): Hct(L/L): MCV(fl): MCH(pg): MCHC(g/l): % hồng cầu lưới: Bạch cầu(G/l): %NEUT: %LYMP: %MONO: %EUSI: %BASE: Tiểu cầu(G/l): - Yếu tố viêm: CRP: Máu lắng 1h: Máu lắng 2h: - Đông máu: PT(%): PT time(s): PT-INR: APTT(s): Fibrinogen: - Hóa sinh máu: Ure(mmol/l): Creatinin(umol/l): ALT(UI/l): AST(UI/l): Ca2+ máu (mmol/l): Ion Ca2+ (mmol/l): Phụ lục 1: Tiêu chuẩn xác định gãy xương x quang A, Tiêu chí cho hình ảnh X Quang rõ nét Kiểm tra gãy đốt sống loãng xương chủ yếu dựa vào hình ảnh X Quang, thường X Quang thẳng nghiêng cột sống lưng, thắt lưng Xác định mức độ gãy cần X Quang nghiêng đủ Khoảng cách từ tiêu điểm phát xạ đến phim (focus-to-film distance-FFD) thường 100 cm X Quang lưng tâm T7, thắt lưng L3 [72] X quang thẳng Để xác định số đốt sống hỗ trợ xác định gãy đốt sống Trong X Quang thẳng, thấy đốt sống rõ ràng, lưng từ C7-L1, thắt lưng từ T12-S1 Với đốt sống lưng, đỉnh cassette vai khoảng 5cm Với thắt lưng độ ưỡn tự nhiên, cột sống thẳng bàn chụp Phải gấp hơng gối, có miếng để chân bên gối Định vị xác cách đếm từ xuống Theo hướng dẫn này, xác định bất thường số lượng đốt X Quang thẳng a) Lưng: C7-L1; b) Thắt lưng: T11-xương (Part II: Radiological assessment of vertebral fracture) Sự chuẩn trực tia X quan trọng với quan nhạy xạ ngực, tuyến giáp không cần chiếu mức, liều xạ tối thiểu tham khảo: Bảng Liều xạ X Quang phù hợp tương ứng với vị trí chụp Loại Liều lượng (mSv) Cột sống lưng Thẳng 0,4 1,2 Nghiêng 0,3 1,2 Cột sống thắt lưng Thẳng 0,7 1,2 Nghiêng 0,3 1,2 X Quang phổi thẳng 0,02 1,2 Pencil beam DXA < 0,001 Fan beam DXA ~ 0,01 QTC 0,06 Chuẩn trực phù hợp làm giảm rơi tia, cải thiện độ tương phản Với X Quang thẳng, chuẩn trực không nên hẹp X Quang nghiêng X Quang nghiêng quan trọng đánh giá gãy xương loãng xương, cần phải ý thời gian tư chụp bệnh nhân Yếu tố quan trọng cột sống bệnh nhân phải song song với bàn chụp, tránh quay, vẹo, dễ gây nghiêng đốt sống Với X Quang nghiêng, đỉnh cassette vai bệnh nhân khoảng cm Với cột sống song song với phim/bàn chụp, đĩa đệm thẳng đứng so với phim song song với tia giúp hạn chế hiệu ứng song song tia X bị phân kỳ Có thể cần miếng thấu xạ (radiolucent pad) eo X Quang thắt lưng để kéo thẳng đốt sống lưng dưới, đảm bảo song song vói bàn chụp, tránh cong trước phim Nếu bệnh nhân bị vẹo cột sống, chỉnh hướng phát tia X phía đầu Với phần lưng trên, phải nâng cánh tay lên để tránh chồng lắp xương bả vai, nâng vừa phải không cao đầu Trong X Quang lưng, mép xương sườn làm mờ hình ảnh đĩa đệm Có thể khắc phục cách thở kéo dài khiến vết mờ di chuyển Bệnh nhân phải giữ tư chụp (2-4 giây) Điều khó với người già Liều xạ cao chút chụp với kỹ thuật thở kéo dài Chất lượng hình ảnh cải thiện nhiều cách đặt tờ giấy chì vào trục sau bàn chụp để làm giảm backscatter (Part II: Radiological assessment of vertebral fracture) X Quang nghiêng, thường vai, hông, gối mắt cá chồng lấp, nên đặt padding khuỷu tay, gối mắt cá để giữ tư Đốt sống thắt lưng phải song song với phim Nếu chụp tư nằm nghiêng, trục cột sống thường nghiêng theo hướng L1-L5, phải đặt miếng thấu xạ phần thắt lưng; xoay gốc tia X hướng chân, vng góc với cột sống GHI CHÚ: - Xương đai vai trở ngại cho X Quang lưng trên, đặc biệt X Quang nghiêng May gãy xương loãng xương xảy T1-3 Tương tự vậy, L5 đơi khó quan sát X Quang nghiêng xương chậu - Do khác biệt hình dáng phần ngực, diện tim chồng lắp lên hình ảnh X Quang cột sống nên khó thấy rõ toàn cột sống lưng X Quang thẳng Hiệu ứng thường gặp bệnh nhân to người hay bị gù - Với bệnh nhân vẹo cột sống nhẹ, nên chụp tư nằm ép phần lồi cột sống vẹo cho cột sống thẳng nhiều ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ GÃY XƯƠNG Trên X Quang nghiêng, đốt sống bình thường có dạng hình chữ nhật, đĩa (endplate) rõ, đậm nét (Part II: Radiological assessment of vertebral fracture) THANG BÁN ĐỊNH LƯỢNG GENANT Mức độ gãy đốt sống đánh giá lâm sàng chủ yếu phương pháp Genant Phương pháp bán định lượng đánh giá cách quan sát ước lượng giảm chiều cao thay đổi hình dáng đốt Có mức độ: + Độ 0: khơng giảm chiều cao thân sống (bình thường) + Độ 1: gãy nhẹ, giảm 20 - 25% chiều cao thân sống + Độ 2: gãy vừa, giảm 25 - 40% chiều cao thân sống + Độ 3: gãy nặng, giảm > 40% chiều cao thân sống (Genant HK et al (1993) JBMR 8(9): 1137-1148) Thay đổi hình dáng đốt (Part II: Radiological assessment of vertebral fracture) Thang Genant dễ dàng xác định gãy vừa nặng Với gãy nhẹ vào tiêu chí đĩa đốt xét khơng tiếp giáp, không song song với đĩa đốt kế cận Một ưu điểm Genant mức độ nặng nhẹ không tỷ lệ với loại gãy (nêm-wedge, lõm-biconcavity hay nén-crush) THANG ĐỊNH LƯỢNG Nhằm khắc phục tính ước lượng thang Genant Phương pháp tính cụ thể chiều cao đốt (Ha, Hm, Hp), suy tỷ lệ (Ha/ Hp, Hm/ Hp, Hp/ Hp-1, Hp/ Hp+1), so sánh với giá trị tham chiếu chuẩn người bình thường đưa kết luận Là gãy xương thay đổi tỷ lệ > lần độ lệch chuẩn Trên X Quang nghiêng, thân đốt chia thành trục: trước (anterior), (middle) sau (posterior) cách đặt điểm phim: điểm đĩa tương ứng điểm đĩa Nguyên tắc đặt điểm: điểm bên tận mép đĩa cùng, điểm (Part II: Radiological assessment of vertebral fracture) Phụ lục 2: Tách DNA từ máu toàn phần Sử dụng Kit OMEGA: Lấy 300ul máu, sau bổ sung thêm 900ul Cell Lysis Solution => Mix Ủ 10 phút nhiệt độ phòng Ly tâm 14500 rcf 30 giây Loại bỏ dịch Bổ sung 300ul Nucleic Lysis Solution => Mix Bổ sung 100ul Protein Precipitation Solution Vortex 20 giây Ly tâm 16000 rcf phút Chuyển sịch sang ống eppendorf có chứa 300ul Isopropanol => Mix Ly tâm 16000 rcf phút 10 Loại bỏ dịch Bổ sung 300ul ethanol 70% 11 Ly tâm 16000 rcf phút => Loại bỏ dịch 12 Làm khô mẫu 15 phút máy hút chân không 13 Bổ sung 100ul nước 3D/ DNA Rehydration Solution Ủ 65°C 4°C qua đêm Mơ hình nghiên cứu Bệnh nhân đến khám bệnh viện Đồng ý tham gia nghiên cứu làm câu hỏi Thăm khám lâm sàng Đo mật độ xương chụp X Quang Lấy máu làm xét nghiệm Tách DNA từ máu tồn phần Phân tích mẫu DNA thu xác định kiểu gen C677T MTHFR Xử lý số liệu hoàn thành nghiên cứu ... hành nghiên cứu: ? ?Nghiên cứu mối liên quan đa hình kiểu gen MTHFR C677T với mật độ xương nguy gãy xương đốt sống phụ nữ mãn kinh Việt Nam? ?? với mục tiêu là: Xác định tỷ lệ đa hình kiểu gen MTHFR C677T. .. C677T phụ nữ mãn kinh Việt Nam Xác định mối liên quan đa hình kiểu gen MTHFR C677T với mật độ xương nguy gãy xương đốt sống phụ nữ mãn kinh Việt Nam 8 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan. .. tượng nghiên cứu Với mục đích xác định tỷ lệ phân bố kiểu gen C677T MTHFR quần thể phụ nữ Việt Nam sau mãn kinh độ tuổi , nhằm đánh giá mối tương quan đa hình gen C677T MTHFR với mật độ xương