Bệnh khô cành cây cà phê là một trong những bệnh hại quan trọng tại Đắk Nông. Nghiên cứu này cho thấy kết quả phân lập 55 mẫu cà phê ở tỉnh Đắk Nông có 3 nhóm nấm chính gây bệnh khô cành khô quả, trong đó nhóm Colletotrichum CC1.5 có khả năng gây bệnh nhanh và mạnh. Nghiên cứu này góp phần cung cấp thêm thông tin về sử dụng vi khuẩn đối kháng trong phòng chống nấm Colletotrichum gây bệnh khô cành khô quả cây cà phê.
Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Thực phẩm 20 (3) (2020) 94-102 PHÂN LẬP MỘT SỐ CHỦNG Bacillus sp ĐỐI KHÁNG VỚI NẤM Colletotrichum sp GÂY BỆNH KHÔ CÀNH KHÔ QUẢ TRÊN CÂY CÀ PHÊ Ở TỈNH ĐẮK NÔNG Nguyễn Bá Thọ*, Nguyễn Thị Liên, Võ Đình Quang Chi nhánh Viện Ứng dụng Công nghệ TP.HCM *Email: nguyenbatho0705@gmail.com Ngày nhận bài: 19/5/2020; Ngày chấp nhận đăng: 24/7/2020 TÓM TẮT Bệnh khô cành cà phê bệnh hại quan trọng Đắk Nông Nghiên cứu cho thấy kết phân lập 55 mẫu cà phê tỉnh Đắk Nơng có nhóm nấm gây bệnh khơ cành khơ quả, nhóm Colletotrichum CC1.5 có khả gây bệnh nhanh mạnh Trong 21 chủng Bacillus sp phân lập đất rừng nguyên sinh đất vườn cà phê khỏe mạnh Đắk-Nông, chủng Bacillus subtilis ĐR2B1 có khả đối kháng tốt với Colletotrichum CC1.5 phương pháp đối kháng trực tiếp 67,41% đối kháng khuếch tán qua lỗ thạch 24,67 mm sau ngày nuôi cấy môi trường PDA Nghiên cứu góp phần cung cấp thêm thơng tin sử dụng vi khuẩn đối kháng phòng chống nấm Colletotrichum gây bệnh khô cành khô cà phê Từ khóa: Bệnh khơ cành khơ quả, Bacillus sp., Colletotrichum sp., cà phê, Đắk Nông MỞ ĐẦU Cây cà phê (Coffea spp.) trồng xuất mang lại hiệu kinh tế cao nhiều nước Brazil, Việt Nam, Indonesia, Colombia Ấn Độ Có nhiều lồi cà phê trồng giới, cà phê vối (Coffea arabica) cà phê chè (Coffea robusta) mang lại hiệu kinh tế cao Mặc dù, cà phê có giá trị kinh tế cao, sản xuất cà phê bị ảnh hưởng nhiều dịch bệnh Đặc biệt bệnh khơ cành khơ cà phê lồi Colletotrichum gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến suất chất lượng cà phê Các nghiên cứu trước cho thấy có nhiều lồi Colletotrichum gây bệnh khơ cành khơ cà phê, cụ thể lồi Colletotrichum ảnh hưởng đến cà phê công bố số nước: loài Thái Lan (C asianum, C fructicola C siamense), loài Angola (C cuscutae C fragariae) loài quốc gia: Úc (C theobromicola), Colombia (C gigasporum), Costa Rica (C costarricense), Fiji (C queenslandicum) Kenya (C kahawae subsp kahawae) [1-6] Một số nghiên cứu xác định nấm Colletotrichum sp dựa hình thái vi thể, đại thể nấm sử dụng phương pháp sinh học phân tử [1, 2] Việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật để phịng trừ bệnh khơ cành khơ nấm Colletotrichum sp cà phê ngày tăng dẫn tới nguy kháng thuốc nên khó phịng trừ bệnh Hơn nữa, sử dụng nhiều thuốc hóa học để phịng trừ bệnh làm gây nhiễm mơi truờng, ảnh hưởng đến sức khỏe người nông dân giảm giá trị nông sản xuất Đặc biệt, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật tồn dư đất nhiễm vào nguồn nước sinh hoạt người nông dân, làm gia tăng bệnh hiểm nghèo người, như: bệnh ung thư, v.v Chính vậy, để phát triển cà phê theo hướng bền vững, thân thiện với mơi trường, biện pháp phịng trị bệnh khơ cành nấm Colletotrichum vi sinh biện pháp tối ưu 94 Phân lập số chủng Bacillus sp đối kháng với nấm Colletotrichum sp gây bệnh Theo số nghiên cứu nước cho thấy, việc sử dụng chủng Bacillus để kiểm soát loại nấm bệnh thực vật biện pháp an toàn hiệu thể qua nghiên cứu khả đối kháng Bacillus với nấm bệnh Colletotrichum sp cà phê [7], bệnh thán thư hành [8] Do đó, việc nghiên cứu chọn lựa chủng vi khuẩn có khả đối kháng vi nấm Colletotrichum gây bệnh khô cành khô cà phê phù hợp với hướng sản xuất cà phê an toàn VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Các mẫu nấm Colletotrichum gây bệnh khô cành khô cà phê phân lập từ cành, lá, trái vườn cà phê bị bệnh địa bàn tỉnh Đắk Nông Các mẫu vi khuẩn đối kháng Bacillus phân lập từ mẫu đất thu thập vườn cà phê khỏe mạnh, khơng có dấu hiệu bị bệnh đất khu vực rừng nguyên sinh thuộc tỉnh Đắk Nông 2.1.2 Môi trường sử dụng nghiên cứu Môi trường phân lập, nuôi cấy Colletotrichum thử nghiệm đối kháng: PDA (Potato Dextrose Agar): Khoai tây 200 g/L, Dextrose 20 g/L, Agar: 20 g/L, nước cất vừa đủ L Môi trường phân lập nuôi cấy Bacillus: LB (Luria-Bertani) Tryptone: 10 g, cao nấm men: g, NaCl: g, nước cất vừa đủ: L, môi trường thạch bổ sung agar: 20 g/L Sau cùng, môi trường hấp khử trùng 121 °C, 1,5 atm 15 phút 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phân lập Colletotrichum Tại địa điểm vườn cà phê, lấy 10 mẫu cho loại thân, non, chín có triệu chứng bị bệnh khơ cành khơ Phần mẫu có triệu chứng điển hình bệnh khô cành khô cô lập để phân lập Chọn mô thực vật bị bệnh để phân lập, rửa mẫu nước để loại bỏ bụi tạp chất khác Khử trùng bề mặt ethanol 75%, sau rửa lại lần với nước cất vô trùng, để khô giấy vô trùng Dùng dụng cụ khử trùng cắt miếng nhỏ 5×5 mm từ phần ranh giới mô khỏe mô bệnh, sau cấy lên mơi trường PDA, ủ nhiệt độ 25-28 °C tối Kiểm tra đĩa cấy ngày, tản nấm phát triển từ mẫu nhiễm bệnh, cấy truyền chúng sang môi trường PDA Quan sát vi thể đại thể vật kích 40X để xác định nấm Colletotrichum Mẫu nấm nghi ngờ Colletotrichum lưu trữ glycerol 25% -80 °C ống thạch nghiêng PDA 2.2.2 Phương pháp thử nghiệm khả gây bệnh chủng Colletotrichum sp phân lập Nuôi cấy nấm bệnh Colletotrichum môi trường PDA (ủ tối nhiệt độ 25-28 oC) khoảng 7-10 ngày, sau ly tâm 8000 vịng/phút thu sinh khối, hòa tan bào tử đưa mật độ 106 CFU/mL Chọn trái cà phê khoẻ mạnh rửa vịi nước chảy, sau để khơ Đặt miếng giấy lọc tiệt trùng miếng lam kính tiệt trùng vào đĩa petri khử trùng Sau đó, giấy lọc làm ẩm nước cất vô trùng Quả cà phê khoẻ tạo vết thương kim tiêm vơ trùng đặt lam kính đĩa petri Tiến hành phun dịch treo bào tử vi nấm Colletotrichum nồng độ 5×106 CFU/mL lên bề mặt trái cà phê, ủ tuần nhiệt độ phòng Nghiệm thức đối chứng tiến hành phun nước cất vô trùng [9] Ghi nhận kết quả: Quan sát ngày đánh giá biểu bệnh đoạn thân gây bệnh so sánh đặc điểm bệnh tự nhiên Chọn mẫu nấm có khả 95 Nguyễn Bá Thọ, Nguyễn Thị Liên, Võ Đình Quang gây bệnh tương tự mơ tả ngồi tự nhiên để tiếp tục nghiên cứu Tính tỷ lệ gây bệnh: TLB(%) = Số bệnh/tổng số × 100 2.2.3 Phương pháp phân lập Bacillus Trước phân lập, mẫu đun nhiệt độ cao (80 °C) 10 phút để loại bỏ tế bào sinh dưỡng giữ lại chủng có sinh bào tử để chọn lọc làm Bacillus Pha loãng mẫu đất đến nồng độ thích hợp nước muối sinh lý 0,85-0,9‰, cấy trải đĩa petri có chứa mơi trường LB - agar nuôi cấy 37 °C 24 Chọn khuẩn lạc đặc trưng cho Bacillus tiến hành làm cách cấy ria môi trường LB - agar Các chủng bảo quản nhiệt độ -80 °C 2.2.4 Phương pháp đối kháng Bacillus Colletotrichum Thử nghiệm đối kháng trực tiếp cách cấy kép [8, 10, 11] Nấm bệnh cấy vào đĩa petri chứa môi trường PDA ủ nhiệt độ phòng ngày Sau ngày tiến hành cấy vi khuẩn, xạ khuẩn lên bề mặt đĩa nấm ủ, chia đĩa làm phần, dùng que cấy chủng vi khuẩn xạ khuẩn lên điểm (1 điểm không cấy dùng làm đối chứng) đĩa cách bìa sợi nấm 1,5 cm Sau ngày quan sát hình thành vùng kháng nấm tính hiệu suất ức chế phát triển sợi nấm vi khuẩn xạ khuẩn theo công thức: H = (R – r)/ R × 100 Trong đó: H hiệu suất đối kháng vi khuẩn (%), R bán kính hệ sợi nấm đối chứng (cm), r bán kính hệ sợi nấm đĩa có chủng vi khuẩn Với phương pháp khuếch tán qua lỗ thạch, khả đối kháng sau ngày thử nghiệm đánh giá thơng qua kích thước vịng đối kháng (vịng trịn suốt bao quanh khuẩn lạc), tính mm theo cơng thức: Kích thước vịng đối kháng = D – d Trong đó: D (mm) đường kính vịng đối kháng; d (mm) đường kính khuẩn lạc Thí nghiệm lặp lại lần chủng vi khuẩn cần chọn lọc 2.2.5 Phương pháp định danh nấm Colletotrichum vi khuẩn Bacillus sinh học phân tử Đối với nấm Colletotrichum định danh phương pháp giải trình tự với cặp mồi ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3'), ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') Chu trình phản ứng PCR gồm: bước biến tính phút 95 °C, sau 35 chù kỳ (1) biến tính 95 °C, 30 giây; (2) bắt cặp, 55 °C, 30 giây; (3) kéo dài 72 °C, phút bước cuối 10 phút 72 °C Chủng vi khuẩn Bacillus định danh phương pháp định danh với cặp mồi 16S rDNA (16sF: 5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'; 16sR: 5'-AAGGAGGTGATCCAACC-3') Chu trình phản ứng PCR gồm: bước biến tính phút 94oC, sau 30 chù kỳ (1) biến tính 94 °C, phút; (2) bắt cặp, 58 °C, phút; (3) kéo dài 72 °C, phút 20 giây bước cuối 10 phút 72 °C KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Phân lập sàng lọc chủng vi nấm Colletotrichum 3.1.1 Phân lập làm Từ mẫu cà phê bị bệnh khô cành khô thu được, tiến hành phân lập nấm Colletotrichum mơi trường PDA tuyển chọn dịng có đặc điểm nấm Colletotrichum 96 Phân lập số chủng Bacillus sp đối kháng với nấm Colletotrichum sp gây bệnh theo mô tả Stephen & Rebecca năm 1991 [12] Sự khác biệt chủng nấm phân lập sau ngày ni cấy PDA, hình thái đại thể, màu sắc, hình dạng bào tử tốc độ phát triển chủng nấm phân lập cho phép chia chúng thành nhóm (Bảng 1) Hình thái nấm (Hình A-B) nhóm (đại diện chủng CC 1.2): đường kính tản nấm 68-72 mm, tơ nấm không dày, khuẩn lạc ban đầu có màu xám trung tâm, tơ nấm có màu trắng, sau ngày ni tồn khuẩn lạc có màu xám, bề mặt thạch mơi trường chứa khuẩn lạc có màu cam, có xuất khu vực màu đen nằm rải rác khu vực màu cam; Nhóm (đại điện chủng CC 1.5): đường kính tản nấm 45-50 mm, khuẩn lạc có màu từ trắng đến xám đen, có xuất vịng đồng tâm, vịng phát triển khơng trịn nhìn thấy rõ mặt đĩa, khuẩn ty chất tạo vòng tròn đồng tâm sắc tố màu đen, sau 10 ngày ni cấy có xuất hạt dầu bên tản nấm (Hình 2); Nhóm (đại diện chủng CV1.2): đường kính tản nấm 75-77 mm, tơ nấm khơng dày, khuẩn lạc có màu trắng đến xám đen, bề mặt thạch môi trường chứa khuẩn lạc có màu cam nhạt xen kẽ vịng trịn đồng tâm màu đen rõ ràng Quan sát bào tử nhóm nấm (Hình 1D) kính hiển vi quang học vật kính 40X cho thấy bào tử hình thoi đến elip, khơng có vách ngăn, đặc điểm phù hợp với miêu tả Damm cộng năm 2012 bào tử nấm Colletotrichum sp [13] Bảng Đặc điểm hình thái nhóm nấm Colletotrichum phân lập Tên chủng nấm Đặc điểm đại thể nấm Đường kính nấm sau ngày Tơ nấm có màu xám, bề mặt thạch mơi trường chứa khuẩn lạc có màu cam, có xuất khu vực màu đen nằm rải rác Khuẩn lạc có màu từ trắng đến xám đen, có xuất vịng đồng tâm, vịng phát triển khơng trịn đều, khuẩn ty chất tạo vòng tròn đồng tâm sắc tố màu đen Khuẩn lạc có màu trắng đến xám đen, bề mặt thạch mơi trường chứa khuẩn lạc có màu cam nhạt xen kẽ vòng tròn đồng tâm màu đen rõ ràng Colletotrichum nhóm (CC1.2) Colletotrichum nhóm (CC1.5) Colletotrichum nhóm (CV1.2) 68-72 mm 45-50 mm 75-77 mm CC1.2 CC1.5 CV1.2 A B C D Hình Đặc điểm hình thái chủng nấm Collectotrichum phân lập (A) Mặt đĩa petri; (B) Mặt đĩa petri chủng nấm môi trường PDA sau ngày nuôi cấy 28 °C; (C) Sợi nấm; (D) Bào tử phân sinh nấm quan sát vật kính 40X 97 Nguyễn Bá Thọ, Nguyễn Thị Liên, Võ Đình Quang Hình Hạt dầu hình thành tản nấm mẫu CC1.5 sau 10 ngày nuôi cấy nhiệt độ 28 °C môi trường PDA 3.1.2 Khả gây bệnh chủng Colletotrium phân lập quy mơ phịng thí nghiệm Với đặc điểm gây bệnh mạnh trái cà phê non nên thử nghiệm gây bệnh tiến hành trái Cả chủng nấm bệnh tiến hành thử nghiệm khả gây bệnh cà phê xanh phương pháp tiêm dịch nấm bệnh với nồng độ 5×106 CFU/mL vào cà phê thường xuyên cấp ẩm Kết thí nghiệm cho thấy, sau ngày gây bệnh vị trí tiêm có xuất vét lõm sâu, màu nâu Đến thời điểm 14 ngày sau tiêm gây bệnh vết bệnh lõm sâu, nâu sẫm đen gần ¾ quả, nhiều mẫu đen khơ Trong đó, thí nghiệm đối chứng khơng quan sát thấy tượng nhiễm bệnh sau 14 ngày tiêm (Hình 3) Tỷ lệ bệnh chủng nấm sau 14 ngày thể qua Bảng Kết Bảng cho thấy, tỷ lệ bệnh tăng theo thời gian Tại thời điểm sau ngày tiêm gây bệnh tỷ lệ bệnh từ 76,19-100%, chủng ký hiệu CC1.5 tỷ lệ gây bệnh đạt 100% Sau 14 ngày tiêm, chủng có tỷ lệ gây bệnh cà phê 100% Nghiệm thức đối chứng tiêm nước vơ trùng qua 14 ngày khơng có tượng bệnh Kết cho thấy, chủng nấm bệnh phân lập có khả gây bệnh với đặc điểm bệnh khô cành khô cà phê, chủng CC1.5 cho khả gây độc cao nhanh A B Hình Kết thử nghiệm khả gây bệnh nấm Colletotrichum phân lập lên cà phê sau 14 ngày A: Quả cà phê tiêm gây bệnh nấm; B: Quả cà phê tiêm nước vô trùng Bảng Tỷ lệ bệnh cà phê theo thời gian sau lây nhiễm chủng CC1.2; CC1.5; CV1.2 Nghiệm thức Tỷ lệ bệnh cà phê (%) Sau ngày Sau 14 ngày Đối chứng 0,00 a 0,00a CC1.5 100e 100d CC1.2 76.19cd 100d CV1.2 85.71d 100d (abcd: Các ký tự theo hàng dọc khác thể khác biệt có ý nghĩa p ≤ 0,05) 98 Phân lập số chủng Bacillus sp đối kháng với nấm Colletotrichum sp gây bệnh Định danh chủng nấm cặp mồi ITS1/ITS4 cho kết chủng nấm Collectotrichum sp Chủng Colletotrichum CC1.5 dùng cho thử nghiệm đối kháng sau 3.2 Phân lập chọn lọc vi khuẩn Bacillus có khả đối kháng tốt với chủng nấm Colletotrichum CC1.5 môi trường PDA Từ mẫu đất thu phân lập 21 chủng có đặc điểm hình thái khuẩn lạc giống với Bacillus như: khuẩn lạc trịn, có màu trắng trong, trắng đục, vàng đậm, vàng nhạt, rìa trịn đều, lượn sóng cưa (Hình 4) Hình Hình ảnh khuẩn lạc chủng Bacillus môi trường LB Đối kháng với chủng vi khuẩn Bacillus Khả đối kháng nấm Colletotrichum gây bệnh khô cành khô cà phê chủng Bacillus tuyển chọn xác định thông qua hiệu ức chế (phương pháp đối kháng trực tiếp) xác định kích thước vòng kháng khuẩn (phương pháp khuếch tán lỗ thạch) Kết thí nghiệm trình bày Bảng Bảng Khả đối kháng số chủng Bacillus tuyển chọn có tiềm kháng nấm C.coffeanum gây bệnh khô cành khô cà phê (hiệu ức chế nấm bệnh sau ngày > 23% kích thước vịng kháng khuẩn > 11mm) Phương pháp khuếch tán đĩa thạch Phương pháp đối kháng trực tiếp STT Tên chủng Hiệu ức chế sau ngày (%) Hiệu ức chế sau ngày (%) mm ĐR2B1 38,88a 67,41a 24,67a ĐV3B1 34,37bcd 62,33ab 21,90c ĐV4B1 35,33bc 65,56ab 23,20b ĐV4B2 35,08bcd 61,85b 21,03c ĐV4B3 35,05bcd 62,22b 21,67c ĐV5B1 35,08 bcd c 19,23d ĐV10B3 34,83bcd 48,15c 19,53d ĐR1B1 35,09bcd 37,78def 16,90e ĐR1B2 34,37bcd 40,37de 17,10e 10 ĐR1B3 35,02bcd 37,41efg 15,17f 11 ĐR1B4 34,34bcd 39,26de 17,03e 12 ĐR2B2 36,29b 42,60d 17,23e 13 ĐR2B3 33,57bcd 34,07fgh 15,30f 14 ĐR2B4 35,04bcd 31,11hi 14,60fg 15 ĐR3B1 33,83bcd 33,33fgh 15,50f 47,41 99 Nguyễn Bá Thọ, Nguyễn Thị Liên, Võ Đình Quang Phương pháp đối kháng trực tiếp STT Phương pháp khuếch tán đĩa thạch 16 ĐR3B2 Hiệu ức chế sau ngày (%) 32,32d 17 ĐR4B1 33,57bcd 32,96fghi 15,10f 18 ĐR4B4 33,78bcd 28,12ik 13,07hi 19 ĐR5B1 34,50bcd 31,11hi 13,53gh 20 ĐV9B4 33,10cd 33,33fgh 14,47fg 21 ĐV10B1 27,30e 23,70k 11,83i Tên chủng Hiệu ức chế sau ngày (%) 32,60ghi 15,27i mm (abc…: Các ký tự theo hàng dọc khác thể khác biệt có ý nghĩa p ≤ 0,05) Tất mẫu vi khuẩn Bacillus phân lập có khả đối kháng với nấm Colletotrichum CC1.5, nhiên, mức độ đối kháng khác Quan sát kết đối kháng trực tiếp sau ngày theo dõi cho thấy chưa có tiếp xúc Bacillus Colletotrichum CC1.5, đường kính vịng nấm bệnh đĩa đối chứng đĩa đối kháng không chênh lệch đáng kể (Hình 5) Sau ngày quan sát thấy xuất vòng kháng khuẩn xung quanh khuẩn lạc Bacillus, hiệu ức chế dao động từ 27,30% đến 38,88% Sau ngày theo dõi vòng kháng khuẩn xung quanh khuẩn lạc rõ (Hình 5), hiệu ức chế dao động 23,70-67,41% Trong 21 chủng Bacillus thử nghiệm khả đối kháng trực tiếp với nấm Colletotrichum CC1.5 có chủng ĐR2B1, ĐV4B1 ĐV3B1 có hiệu đối kháng cao 67,41%; 65,56% 62,33% Phương pháp đối kháng trực tiếp cho biết chủng khảo sát có đối kháng hay khơng mà rõ chủng thử nghiệm đối kháng có phải sinh hợp chất kháng khuẩn hay cạnh tranh dinh dưỡng Trong đó, phương pháp khuếch tán lỗ thạch cho biết chủng có khả sinh chất đối kháng với nấm bệnh Colletotrichum Vịng vơ khuẩn xung quanh lỗ thạch chứng tỏ chủng có tiết chất kháng khuẩn ức chế khả sinh trưởng ̅̅̅̅̅̅̅̅̅ Colletotrichum (Hình 6) Đường kính vịng vơ khuẩn (𝐷 − 𝑑) lớn khả sinh chất kháng nấm Colletotrichum cao Kết đối kháng qua lỗ thạch thể Bảng cho thấy có chủng ĐR2B1 ĐV4B1 cho vòng kháng khuẩn cao 24,67 mm 23,20 mm Mặt trước đĩa petri Mặt sau đĩa petri Sau ngày đối kháng Sau ngày đối kháng Hình Đối kháng chủng Bacillus subtilic ĐR2B1 với nấm Colletotrichum CC1.5 môi trường PDA 28 °C, theo thời gian 100 Phân lập số chủng Bacillus sp đối kháng với nấm Colletotrichum sp gây bệnh Hình Khả ức chế phát triển nấm Colletotrichum CC1.5 số chủng Bacillus phương pháp phương pháp khuếch tán lỗ thạch Trong số 21 chủng Bacillus sp đánh giá khả ức chế phát triển Collettrichum cho thấy, chủng ĐR2B1 có khả đối kháng cao với nấm Colletotrichum CC1.5 phương pháp đối kháng trực tiếp đối kháng khuếch tán qua lỗ thạch Kết phân tích trình tự rRNA 16S so sánh trình tự NCBI-Blast cho thấy chủng ĐR2B1 chủng Bacillus subtilic với mức độ tương đồng 99,0% KẾT LUẬN Nghiên cứu phân lập chủng nấm Colletotrichum gây bệnh khô cành khô cà phê tỉnh Đắk Nơng Triệu chứng bệnh biều ngày Trong số 21 chủng Bacillus phân lập đất rừng nguyên sinh đất vườn tỉnh Đắk Nơng, chủng Bacillus ĐR2B1 có khả đối kháng cao với nấm Colletotrichum CC1.5 sau ngày nuôi cấy phương pháp đối kháng trực tiếp đối kháng gián tiếp 67,41% 24,67 mm Phân tích trình tự 16S- rRNA so sánh trình tự NCBI-Blast cho thấy chủng ĐR2B1 chủng Bacillus subtilis Với khả đối kháng cao với nấm Colletotrichum gây bệnh khô cành khô cà phê, chủng vi khuẩn B subtilis phân lập nghiên cứu sử dụng để nghiên cứu thêm khả phòng chống bệnh thực địa TÀI LIỆU THAM KHẢO Damm U., Cannon P.F., Woundenberg J.H.C., Crous P.W - The Colletotrichum acutatum species complex, Studies in Mycology 73 (1) (2012) 37-113 Damm U., Cannon P.F., Woudenberg J.H.C., Johnston P.R., Weir B.S., Tan Y.P., Shivas R.G., Crous P.W - The Colletotrichum boninense species complex, Studies in Mycology 73 (1) (2012) 1-36 Prihastuti H., Cai L., Chen H., McKenzie E.H.C., Hyde K.D - Characterization of Colletotrichum species associated with coffee berries in northern Thailand, Fungal Divers 39 (2009) 89-109 Rakotoniriana E.F., Scauflaire J., Rabemanantsoa C., UrvegRatsimamanga S., Corbisier A.M., Quetin-Leclercq J., Declerck S., Munaut F - Colletotrichum gigasporum sp nov., a new species of Collettrichum producing long straight conidia, Mycol Prog 12 (2013) 403-412 Silva D.N., Várzea V., Cai L., Salgueiro P.O., Batista D - Application of the Apn2/MAT locus to improve the systematics of the Colletotrichum gloeosporioides 101 Nguyễn Bá Thọ, Nguyễn Thị Liên, Võ Đình Quang complex: an example from coffee (Coffea spp.) hosts, Mycologia 104 (2) (2012) 396-409 Weir B.S., Johnston P.R., Damm U - The Colletotrichum gloeosporioides species complex, Stud Mycol 73 (3) (2012) 115-180 Kejela V.R., Thakkar P., Thakor T - Bacillus species (BT42) isolated from Coffea arabica L rhizosphere antagonizes Colletotrichum gloeosporioides and Fusarium oxysporum and also exhibits multiple plant growth promoting activity, BMC Microbiol 16 (1) (2012) 1-13 Nguyễn Thị Liên, Hà Trọng Nhân, Trần Thị Xuân Mai, Nguyễn Thị Pha, Nguyễn Lan Minh - Phân lập tuyển chọn vi khuẩn đối kháng với nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư hành lá, Tạp chí Khoa học Đại học Đồng Tháp 26 (2017) 104-110 Song Jiaojiao, Pongnak Wattanachai, Soytong Kasem - Biological activity of endophytic fungi from palm trees against chili anthracnose caused by Colletotrichum capsici, Journal of Agricultural Technology 11 (8) (2015) 1927–1940 10 Nguyễn Thị Liên, Nguyễn Thị Yến Như, Trần Thị Xuân Mai, Nguyễn Thị Pha - Phân lập tuyển chọn vi khuẩn từ đất vùng rễ ớt có khả đối kháng với nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư ớt, Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ 47 (2016) 16-23 11 Nguyễn Thị Pha, Nguyễn Thị Phương Oanh, Nguyễn Hữu Hiệp - Khả đối kháng nấm Pyricularia oryzae vi khuẩn sinh chitinase phân lập từ đất vùng rễ lúa, Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ 31 (2014) 7-11 12 Stephen A Ferreira, Rebecca A Boley - Colletotrichum coffeanum, University of Hawaii at Manoa, Journal of Crop Knowl Master (1991) 13 Damm U., Cannon P.F., Crous P.W - Colletotrichum: complex species or species complexes, Studies in Mycology 73 (2012) 1-215 ABSTRACT ISOLATION OF SEVERAL ANTAGONISTIC Bacillus sp SPECIES AGAINST COFFE BERRY DISEASE BY Colletotrichum sp IN DAK NONG PROVINCE Nguyen Ba Tho*, Nguyen Thi Lien, Vo Dinh Quang Branch of National Center for Technological Progress in HCM City *Email: nguyenbatho0705@gmail.com The diseases of dried branches and dried fruits are dangerous for coffee plants Results of isolating 55 coffee samples in Dak Nong province with main groups of fungi causing dried branches and dried fruits showed that Colletotrichum CC1.5 group has the ability to cause fast and strong disease Among these 21 strains of Bacillus sp isolated in primary forest land and healthy coffee garden land in Dak Nong, Bacillus subtilis strain ĐR2B1 has good resistance to Colletotrichum CC1.5 in the direct antagonistic method of 67.41% and diffuse through the 24.67 mm agar after days of culture on PDA This study provides more further information on antagonistic bacteria for controlling Colletotrichum causing dried branches and dried fruits of coffee plants Keywords: Bacillus sp., coffee berry disease, coffee plant, Colletotrichum sp., Dak Nong province 102 ... khả đối kháng Bacillus với nấm bệnh Colletotrichum sp cà phê [7], bệnh thán thư hành [8] Do đó, việc nghiên cứu chọn lựa chủng vi khuẩn có khả đối kháng vi nấm Colletotrichum gây bệnh khô cành khô. .. gây bệnh với đặc điểm bệnh khơ cành khơ cà phê, chủng CC1.5 cho khả gây độc cao nhanh A B Hình Kết thử nghiệm khả gây bệnh nấm Colletotrichum phân lập lên cà phê sau 14 ngày A: Quả cà phê tiêm gây. .. cho thấy chủng ĐR2B1 chủng Bacillus subtilic với mức độ tương đồng 99,0% KẾT LUẬN Nghiên cứu phân lập chủng nấm Colletotrichum gây bệnh khô cành khô cà phê tỉnh Đắk Nông Triệu chứng bệnh biều