Nghiên cứu đặc tính đối kháng với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh trên chuối của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. VNUA27

Bài viết Nghiên cứu đặc tính đối kháng với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh trên chuối của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. VNUA27 trình bày ảnh hưởng của dịch nuôi từ chủng VNUA27 đối với sự phát triển của sợi nấm Foc TR4; Ảnh hưởng của dịch nuôi từ chủng VNUA27 đến sự nây mầm của bào tử nấm Foc TR4; Phân lập và phân loại chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. VNUA27.

Vietnam J Agri Sci 2022, Vol 20, No 8: 1042-1053 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2022, 20(8): 1042-1053 www.vnua.edu.vn NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH ĐỐI KHÁNG VỚI NẤM Fusarium oxysporum GÂY BỆNH TRÊN CHUỐI CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces sp VNUA27 Đinh Trường Sơn1, Nguyễn Thị Thanh Mai2, Nguyễn Thị Thu1, Nguyễn Thanh Hải1, Trần Thị Đào1, Ngô Thị Vân Anh1, Nguyễn Xuân Cảnh1* Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Trung tâm Sinh học thực nghiệm, Viện Ứng dụng Công nghệ * Tác giả liên hệ: nxcanh@vnua.edu.vn Ngày nhận bài: 04.05.2022 Ngày chấp nhận đăng: 19.08.2022 TÓM TẮT Bệnh héo vàng chuối nấm Fusarium oxyspoum f sp cubense (Foc) gây thiệt hại nặng nề chuối Đặc biệt, chủng Foc TR4 lây nhiễm hầu hết giống chuối So với biện pháp truyền thống, biện pháp sinh học sử dụng vi sinh vật phòng trừ bệnh coi biện pháp chiến lược Trong nghiên cứu này, chủng xạ khuẩn VNUA27 phân lập, đánh giá khả đối kháng với nấm Foc TR4 Đánh giá ảnh hưởng dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn VNUA27 đến phát triển hệ sợi nảy mầm bào tử nấm Foc TR4 Trên sở nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa phân tích vùng trình tự 16S rARN chủng xạ khuẩn VNUA27 xác định Streptomyces diastatochromogenes VNUA27 Kết nghiên cứu cho thấy, chủng xạ khuẩn VNUA27 đối kháng mạnh với nấm Foc TR4 (54,78% Sợi nấm Foc TR4 sau xử lý dịch nuôi chủng VNUA27 bị co lại biến dạng Các mẫu bào tử nấm Foc TR4 xử lý dịch nuôi chủng xạ khuẩn VNUA27 cho thấy tỉ lệ lớn bào tử không nảy mầm (ức chế 82,42%) Đặc biệt, nghiên cứu phát gen chức KS tham gia vào q trình sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp chủng VNUA27 Kết nghiên cứu cho thấy, chủng xạ khuẩn VNUA27 chủng tiềm giúp phòng trừ nấm Foc TR4 đạt hiệu cao biện pháp sinh học Từ khóa: Xạ khuẩn, Streptomyces, Fusarium oxyspoum f sp cubense Antagonistic Properties of Streptomyces sp VNUA27 Strain Against Fusarium oxysporum Causing Panama Disease on Banana ABSTRACT Panama disease or banana Fusarium wilt caused by Fusarium oxyspoum f sp cubense (Foc) is one of the most destructive plant diseases In particular, the strain Foc TR4 can infect most banana varieties Compared with traditional methods, biological measures using microorganisms in disease control are considered strategic measures In this study, actinomycete strain VNUA27 was isolated and evaluated for its ability to antagonize Foc TR4 The effect of culture filtrates of the VNUA27 strain on the growth of hyphae and germination of Foc TR4 fungal spores was evaluated Based on the morphological, physiological, and biochemical characteristics and sequence analysis of 16S rRNA region, actinomycete strain VNUA27 was assigned as Streptomyces diastatochromogenes VNUA27 The actinomycete strain VNUA27 exhibited high antifungal activity against Foc TR4 (54.78%) After treatment with the strain VNUA27 culture filtrates, the Foc TR4 hyphae became shrunk and deformed Spore samples of Foc TR4 treated with culture filtrates of the strain VNUA27 showed a high percentage of non-germinated spores (82.42% inhibition) In particular, the results revealed the function of KS α gene clusters that contributed to the biosynthesis of active secondary metabolites of the strain VNUA27 This study showed that the actinomycete strain VNUA27 is a potential agent for biological control of Foc TR4 of Fusarium wilt with high efficiency Keywords: Actinomycetes, Streptomyces, Fusarium oxyspoum f sp cubense 1042 Đinh Trường Sơn, Nguyễn Thị Thanh Mai, Nguyễn Thị Thu, Nguyễn Thanh Hải, Trần Thị Đào, Ngô Thị Vân Anh, Nguyễn Xuân Cảnh ĐẶT VẤN ĐỀ Chuối (Musa ssp.), cú ngun gc t ụng Nam , ỵc trng rng rãi ć khíp vùng nhiệt đĆi cên nhiệt i Bi vỡ chui giu dinh dỵng v tinh bt nờn ỵc coi l cồy lỵng thc quan trng th tỵ sau gọo, lỳa mỡ v ngụ giõm nọn cỷa ngỵi chõu Phi bi T chc Nụng lỵng Liờn hp quc (Song & cs., 2018) Nởm 2019, sõn lỵng chui trờn ton th gii l hn 113 triu tỗn; hai nỵc trng chui ln nhỗt l Ấn Độ (36,7%) Trung Quốc (13,8%) (Tzean & cs., 2019) Tuy nhiờn, bnh hộo vng nỗm Fusarium oxysporum f sp cubense (Foc) nhĂng loäi bệnh gõy họi nng n nhỗt i vi chui, gõy thit häi lĆn kinh tế thąi gian dài Đặc biệt, chûng Foc nhiệt đĆi (Foc TR4) lây nhiễm vào hĄn 80% giống chuối (Ghag & cs., 2015; Zhang & cs., 2019) Bệnh häi ỵc tỡm thỗy cỏc vựng sõn xuỗt chui ln cûa vùng nhiệt đĆi cên nhiệt đĆi (Ghag & cs., 2015) Ở Việt Nam, chûng Foc TR4 gây họi trờn chui tiờu, chui tõy xuỗt hin nhiu vựng trng chui cỏc tợnh Vùnh Phỳc, Phỳ Th, Hỵng Yên, Lào Cai, Hà Nội (Træn Ngọc Hùng & cs., 2020) Việc quân lý hiệu quâ låu dài đối vĆi bệnh héo vàng chuối vén thách thĀc, phæn lĆn ký chû lâu nëm nỗm bnh tn tọi lồu ỗt (Ploetz & Evans, 2015) Hin nay, phỵng phỏp ỵc s dýng ph bin nhỗt kim soỏt bnh hộo vng trờn chui l sā dýng thuốc hóa học để tiêu diệt trăc tiếp mổm bnh ỗt u im cỷa vic kim soỏt hóa học nhanh chóng, tiết kiệm, đĄn giân hiệu quâ thąi gian ngín Tuy nhiên đặc tớnh cỷa ỗt v s a dọng cỷa vi sinh vờt s b phỏ hỷy s dýng húa chỗt thąi gian dài Ngồi cịn tiềm èn nguy c v mụi trỵng v an ton thc phốm Cỏc bin phỏp nụng nghip kim soỏt bnh nhỵ luồn canh, cõi tọo ỗt tiờu tn rỗt nhiu thi gian, cụng sc v khụng phự hp vi cỏc vỵn chui thâm canh đäi quy mô lĆn So vĆi cách phòng ngÿa khác nhau, biện pháp sinh học sā dýng vi sinh vờt i khỏng nỗm Foc ỵc coi l giõi phỏp chin lỵc phũng tr bnh hộo vng chuối hiệu quâ để giâm việc sā dýng thuốc diệt nỗm (Bubici & cs., 2019) Xọ khuốn cú khõ nởng tọo cỏc chỗt chuyn hoỏ th cỗp quan trng, sõn xuỗt 70% cỏc chỗt khỏng khuốn Streptomysec l chi quan trng nhỗt v l ngun cỹng cỗp 2/3 tỗt cõ cỏc khỏng sinh t nhiờn (Lucas & cs., 2012) Các nghiên cĀu chỵ rìng hĉp chỗt cú hoọt tớnh sinh hc liờn quan cht ch tĆi gen mã hóa polyketide synthase (PKS) nonribosomal peptide synthetase (NRPS) NRPS sinh tng hp chỗt th cỗp khụng thơng qua ribosome täo däng peptide nhą q trình tổng hĉp protein axit amin PKS enzyme chớnh cổn thit tng hp polyketide - hp chỗt chuyn húa th cỗp (Albright & cs., 2014; Ginolhac & cs., 2004) Trong chi Streptomyces, có ba lội PKS (lội I, loäi II loäi III) (Lal & cs., 2000; Funabashi & cs., 2008; Okamoto & cs., 2009) Vì vêy, việc sàng lọc nghiên cĀu cým gen ngun d liu quan trng tỡm cỏc hp chỗt sinh hc Cỏc hp chỗt khỏng khuốn úng vai trũ quan trọng việc bâo vệ thăc vêt khỏi să tỗn cụng cỷa cỏc tỏc nhõn gõy bnh (Qi & cs., 2019; Wei & cs., 2020) Trên giĆi, có nhiều nghiên cĀu khám phá chûng xä khuèn thuộc chi Streptomysec có khâ nëng sinh hĉp chỗt th cỗp t cỏc loọi PKS v NRPS cú khõ nởng khỏng mọnh vi Foc TR4 Chợng họn nhỵ Streptomyces sp strain g10, S noursei Da07210, Streptomyces sp SCA3-4 có khâ nëng đối kháng mänh vĆi Foc TR4 (Getha & cs., 2005; Wu & cs., 2009; Qi & cs., 2019) Hp chỗt th cỗp chit t Streptomyces sp YYS-7, Streptomyces sp 5-10, Streptomyces sp H4 cho đối kháng mänh, gây biến däng hệ sĉi Āc chế să nây mæm cûa Foc TR4, câi thiện să phát triển cûa chuối sau tái lây nhiễm chêu (Wei & cs., 2020; Li & cs., 2021; Yun & cs., 2021) Vit Nam, s lỵng nghiờn cu khõ nởng khỏng nỗm Fusarium oxysporum f sp cubense (Foc), c bit nghiên cĀu xä khuèn có khâ nëng sinh tổng hp cỏc hp chỗt sinh hc nhúm polyketide cũn rỗt hän chế Vì vêy, nghiên cĀu sàng lọc hĉp chỗt sinh hc nhúm polyketide v NRPS t xọ khuốn l hỵng nghiờn cu trin vng v an ton sinh học ć Việt Nam Bài báo têp trung nghiên cu rừ cỏc c tớnh i khỏng vi nỗm Fusarium 1043 Nghiên cứu đặc tính đối kháng với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh chuối chủng xạ khuẩn Streptomyces sp VNUA27 oxysporum f sp cubense TR4 (Foc TR4) gây bệnh chuối cûa chûng xä khuèn Streptomyces sp VNUA27 (vit tớt l VNUA27) phõn lờp t ỗt trng chui täi Hà Tïnh Cý thể, nghiên cĀu chỵ rõ ânh hỵng cỷa dch nuụi chỷng xọ khuốn VNUA27 ti bo t v h si cỷa nỗm, nh danh v sng lọc phát gen KS mã hố PKSII có khâ nởng sinh tng hp cỏc hp chỗt th cỗp PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Chûng xä khuèn Streptomyces sp VNUA27 ỵc phõn lờp t ỗt trng chui ć xã Xn Liên, huyện Nghi Xn, tỵnh Hà Tïnh Chỷng VNUA27 ó ỵc phõn lờp theo phỵng phỏp cỷa Rahman & cs (2011), lm thuổn v lỵu gi ging trờn mụi trỵng Gause Chỷng nỗm Fusarium oxysporum f.sp cubense, TR4 ó ỵc nghiờn cu chi tit v c im sinh hc, nh danh v lỵu gia tọi phũng thí nghiệm Bộ mơn Cơng nghệ vi sinh, Khoa Cơng nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Chûng giống coi chûng tham chiếu chuèn để nghiên cĀu khác sā dýng 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Khâo sát khâ đối kháng nấm Foc TR4 chủng VNUA27 Khâo sát khâ nëng đối khỏng nỗm Foc TR4 cỷa chỷng VNUA27 bỡng phỵng phỏp ng nuụi cỗy trờn mụi trỵng Potato Dextrose Agar (PDA) (Sadeghian & cs., 2016; Wei & cs., 2020; Qi & cs., 2021; Zou & cs., 2021) v phỵng phỏp khuch tán đïa thäch (Mohseni & cs., 2013; Wei & cs., 2020; Qi & cs., 2021; Zou & cs., 2021) Sau nuụi cỗy 28C 5-7 ngy, hoọt tớnh i khỏng nỗm cỷa chỷng xọ khuốn ỵc xỏc nh bỡng cỏch o ỵng kớnh vựng c ch (khoõng cỏch cỷa si nỗm ti xọ khuốn) v tớnh tợ l phổn trởm c ch s phỏt trin cỷa si nỗm (GI) theo công thĀc sau: GI = 1044 D – D1 × 100% D Trong đó: D D1 lỉn lỵt l ỵng kớnh cỷa si nỗm ùa i chĀng đïa thí nghiệm 2.2.2 Ảnh hưởng dịch nuôi từ chủng VNUA27 phát triển sợi nấm Foc TR4 Khâ nëng Āc chế cûa dðch nuụi i vi s phỏt trin cỷa h si nỗm Foc TR4 ỵc phỏt hin bỡng phỵng phỏp cỷa Yun & cs (2021) Nhỏ dðch nuôi xä khuèn sau ngy lờn trờn tỗm lam kớnh cha si nỗm Foc TR4 phát triển Sau nuôi ć 28C 2-3 ngy, cỏc mộu si nỗm ỵc quan sỏt dỵi kính hiển vi quang học (Axio Scope A1, Carl ZEISS, ĐĀc) 2.2.3 Ảnh hưởng dịch nuôi từ chủng VNUA27 đến nây mầm bào tử nấm Foc TR4 Thớ nghim ỏnh giỏ õnh hỵng s nõy mổm cỷa bo t ỵc thc hin theo phỵng phỏp cỷa Phuakjaiphaeo & cs (2016) S nõy mổm cỷa bo t ỵc quan sát đếm kính hiển vi quang học (Axio Scope A1, Carl ZEISS, ĐĀc), chỵ nhĂng ống mỉm cú kớch thỵc di hn kớch thỵc bo t cỷa chỳng mi ỵc tớnh l ó nõy mổm Tợ l phæn trëm Āc chế să nây mæm cûa bào tā (PSGI) ỵc tớnh theo cụng thc cỷa Gemeda & cs (2014): PSGI = Sc – St × 100% Sc Trong ú: Sc v St lổn lỵt l s lỵng trung bình bào tā nây mỉm méu đối chĀng méu thí nghiệm 2.2.4 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học định danh chủng xạ khuẩn VNUA27 Đặc im hỡnh thỏi v nuụi cỗy chỷng xọ khuốn VNUA27 ỵc xỏc nh trờn h thng mụi trỵng ISP v mụi trỵng Gause-1 (Shirling & Gottlieb, 1966) sau 5-7 ngy nuụi cỗy 30C Khõ nởng sinh sớc t melanin ỵc quan sỏt trờn mụi trỵng ISP6 sau ngy, nu mụi trỵng chuyn t mu vng nhọt sang mu nâu đen chûng xä khn có khâ nëng sinh melanin Các đặc điểm khuèn läc gồm màu sớc khuốn ty c chỗt (KTCC), khuốn ty khớ sinh Đinh Trường Sơn, Nguyễn Thị Thanh Mai, Nguyễn Thị Thu, Nguyễn Thanh Hải, Trần Thị Đào, Ngô Thị Vân Anh, Nguyễn Xuân Cảnh (KTKS) khâ nëng sinh síc tố tan ỵc ỏnh giỏ bỡng cỏch so sỏnh vi bõng mu ISCC-NBS (Kelly, 1958) Phỵng phỏp xỏc nh hỡnh thỏi chui sinh bo t, khõo sỏt õnh hỵng cỷa nhit , pH, nng NaCl ti sinh trỵng v phỏt trin cỷa chỷng VNUA27, nh danh chỷng VNUA27 ỵc thc hin theo phỵng phỏp cỷa Nguyn Xuõn Cõnh & cs (2016) Cý thể, xác đðnh hình thái chuỗi sinh bào t thc hin nhỵ sau: Cỗy chỷng xọ khuốn trờn mụi trỵng Gause ó gởm lamen vo thọch vi góc nghiêng 45 so vĆi bề mặt thäch Sau ngy nuụi cỗy 30C, tin hnh rỳt lamen cú khuèn ty khí sinh cûa xä khuèn bám lên quan sát kết quâ kính hiển vi điện tā quột (SEM) Khõo sỏt õnh hỵng nhit , pH, nng mui NaCl n sinh trỵng v phỏt trin cỷa chỷng xọ khuốn VNUA27 bỡng cỏch nuụi cỗy chỷng VNUA27 trờn mụi trỵng Gause vi cỏc iu kin nuụi cỗy khỏc bao gm: nhit (20, 25, 30, 35, 40, 45, 50C); pH (4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12); nồng độ muối NaCl (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9%) Chỷng VNUA27 ỵc đðnh danh cën cĀ vào đặc điểm hình thái, ni cỗy v phõn tớch trỡnh vựng 16S rRNA ỵc khuch đäi bìng cặp mồi 27F 1492R (Weisburg & cs., 1991) 2.2.5 Phát gen KS sinh tổng hợp PKS II Khuếch đäi gen KS sinh tổng hĉp PKS II theo phỵng phỏp cỷa Metsa-Ketela & cs (1999), bỡng trỡnh tă mồi: KS-F: 5'-GATGGT CTCCACCGGCTGC-3' KS-R: 5'-GTCTCG TGGCGGTCGTTCTGC-3' Cặp mồi đặt täi công ty Macrogen (Seoul, Hàn Quốc) Tổng hỗn hĉp phân Āng PCR 20µl bao gồm 10µl mastermix 2X, 1l KS-F (10M), 1l KS-R (10M), 1l DNA (140 ng/l), 7µl H2O Chu trình nhiệt cho phân Āng PCR bít đỉu 95C phút, 40 chu kĊ ć 95C phút, 58C 30 giây, 72C phút thąi gian kéo dài mäch cuối 10 phút täi 72C Cp mi khuych ọi sõn phốm cú kớch thỵc 470bp (Bundale & cs., 2014) 2.2.6 Phân tích số liệu Số liu ỵc x l s b trờn phổn mm Excel Vẽ biểu đồ, thống kê bìng phỉn mềm GraphPad Prism vĆi độ tin cêy P