Tam thất (Panax pseudoginseng Wall) là cây lâm sản ngoài gỗ có giá trị kinh tế cao, nấm Fusarium oxysporum gây bệnh thối rễ là những trở ngại chính để phát triển loài cây này trên diện rộng. Bài viết trình bày việc phân lập tuyển chọn vi khuẩn nội sinh đối kháng với nấm (Fusarium oxysporum) gây bệnh thối rễ Tam thất (Panax pseudoginseng Wall).
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI KHUẨN NỘI SINH ĐỐI KHÁNG VỚI NẤM (Fusarium oxysporum) GÂY BỆNH THỐI RỄ TAM THẤT (Panax pseudoginseng Wall) Vũ Văn Định1* TÓM TẮT Tam thất (Panax pseudoginseng Wall) lâm sản ngồi gỗ có giá trị kinh tế cao, nấm Fusarium oxysporum gây bệnh thối rễ trở ngại để phát triển lồi diện rộng Áp dụng biện pháp hóa học để phịng trừ bệnh hại Tam thất thường không đảm bảo vệ sinh an tồn thực phẩm ảnh hưởng đến mơi trường sinh thái Nghiên cứu vi khuẩn nội sinh Tam thất có khả đối kháng với nấm F oxysporum gây bệnh thối rễ Số lượng chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ phận khác Từ 27 chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ lá, thân, rễ Tam thất xác định có 22 chủng có hiệu lực kháng nấm F oxysporum tuyển chọn chủng (PP16; PP18; PP23) có hiệu lực kháng nấm cao với đường kính vịng kháng nấm 21,2; 20,7; 20,8 mm Phân tích di truyền phân tử dựa trình tự 16S rARN cho thấy chủng PP16 có tên khoa học Bacillus subtilis chủng PP18; PP23 thuộc lồi Bacillus aryabhattai Từ khóa: Panax pseudoginseng Wall, fusarium oxysporum, vi khuẩn nội sinh, bệnh thối rễ MỞ ĐẦU1 Tam thất tên khoa học là: Panax pseudoginseng Wall (Panax repens Maxim), tên đồng nghĩa: Panax notoginseng (Burkill) F H Chen ex C Y Wu & K M Feng thuộc họ Ngũ gia bì Araliaceae (Võ Văn Chi, 2012) Đặc biệt Tam thất có hoạt chất đặc trưng Ginsennosid Rb1, Ginsennosid Rg1, Majonosid R2 (MS2) Do Tam thất có nhiều hoạt chất quý nên có khả điều trị số bệnh ung thư (Nguyen et al., 1994) Đối với Tam thất củ, hoa, nụ, có giá trị có tác dụng bổ dưỡng, tăng sức đề kháng, điều hòa miễn dịch, bảo vệ tim chống lại tác nhân gây loạn nhịp ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tăng khả chịu đựng thể bị thiếu oxy (Võ Văn Chi, 2012) Ngoài tác dụng kể Tam thất giúp lưu thơng tuần hồn máu, giảm lượng Cholesterol máu, hạ đường huyết, kích thích hệ miễn dịch, ức chế vi khuẩn, giảm tiểu đường, chống viêm tốt (Nguyễn Văn Đạt Trần Thị Phương Anh, 2013) Áp dụng biện pháp hóa học để phịng trừ bệnh hại dược liệu nói chung Tam thất nói riêng khơng đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm Vi sinh vật nội sinh (VSVNS) có khả kiểm sốt ngăn cản trình xâm nhiễm mầm * Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam Email: vudinhfsiv@gmail.com bệnh thực vật (Sturz Matheson, 1996), côn trùng (Azevedo et al., 2000) tuyến trùng (Hallmann et al., 1997) Trong số trường hợp chúng đẩy mạnh tốc độ nảy mầm hạt, thúc đẩy hình thành điều kiện bất lợi nâng cao khả tăng trưởng thực vật thiết lập mối quan hệ hai bên có lợi (Bent Chanway, 1998) Vi sinh vật nội sinh thúc đẩy trình sinh trưởng chủ tạo hàng rào kiểm soát sinh học cách tiêu diệt trực tiếp mầm bệnh xâm nhiễm vào chủ (Chanway, 1998) Nghiên cứu trình bày phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh thối rễ Tam thất (Panax pseudoginseng Wall) trồng huyện Si Ma Cai huyện Mường Khương tỉnh Lào Cai từ làm sở khoa học cho việc phịng trừ bệnh hại Tam thất biện pháp sinh học NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm thu mẫu Huyện Mường Khương, huyện Si Ma Cai tỉnh Lào Cai 2.2 Vật liệu 24 mẫu Tam thất (Panax pseudoginseng Wall) thu huyện Mường Khương huyện Si Ma Cai tỉnh Lào Cai; nấm Fusarium oxysporum gây bệnh hại Tam thất Phòng thớ nghim, Trung Nông nghiệp phát triển nông thôn - KỲ - TH¸NG 12/2021 77 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ tâm Nghiên cứu Bảo vệ rừng, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam 2.3.2 Đánh giá hiệu lực vi khuẩn nội sinh đối kháng nấm Fusarium oxysporum Các loại vật liệu, dụng cụ thí nghiệm, trang thiết bị sử dụng nghiên cứu: Hóa chất: (NaCl; KH2PO4; NaOH; Pepton; K2HPO4; MgSO4.7 H2O; Agar khoai tây, D-Glucose, cồn; dụng cụ thí nghiệm: đĩa petri, ống nghiệm, que trang, que cấy, đèn cồn, pipatman; máy móc, thiết bị khác: cân điện tử, máy chuẩn độ pH, nồi hấp, tủ định ôn, tủ cấy, máy lắc Các mẫu vi khuẩn sau phân lập cấy đĩa hộp lồng có chứa mơi trường PDA đồng thời cấy nấm F oxysporum gây bệnh hại rễ Tam thất vào sát mép hộp lồng tạo thành tam giác sau để tủ định ôn nhiệt độ 280C sau 72 đánh giá hiệu lực kháng nấm bệnh, thời gian theo dõi thí nghiệm vịng 15 ngày Đường kính vịng kháng nấm tính cơng thức sau: 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh Tam thất Nghiên cứu thực huyện có diện tích trồng Tam thất tỉnh Lào Cai (huyện Mường Khương huyện Si Ma Cai) Mỗi huyện chọn vườn trồng Tam thất giai đoạn - 12 tháng tuổi, vườn chọn - luống ngẫu nhiên, luống lập ô tiêu chuẩn (1 m2/OTC) vị trí đầu luống, luống cuối luống, luống thu - mẫu điển hình bao gồm khơng bị bệnh bị bệnh tổng số 24 mẫu (mỗi địa điểm 12 mẫu) Hai mươi bốn mẫu (24) Tam thất (lá, thân, rễ (củ)) rửa vòi nước để loại bỏ đất, tạp chất làm khô mẫu nhiệt độ phòng 20 phút Mẫu Tam thất chia thành phần: lá, thân, rễ khử trùng riêng rẽ điều kiện vô trùng Mẫu thực vật rửa với nước cất khử trùng đến lần, sau khử trùng với NaClO 5% phút Rửa mẫu lần Na2S2O3 2,0% (w/v) phút để loại bỏ NaClO dư Tiếp tục xử lý mẫu ethanol 70% 10 phút, rửa lại nước cất khử trùng để loại bỏ ethanol Tiến hành thu dịch rửa mẫu lần cuối với nước cất khử trùng cấy trải môi trường LB nhằm kiểm tra độ mẫu sau khử trùng (El - Deeb et al., 2013) Mẫu cắt thành miếng nhỏ có kích thước 0,5 x cm Sau miếng nhỏ đặt ống nghiệm chứa 4,5 ml môi trường PBS (NaCl: 8,5 gam, KH2PO4: 6,8 gam, NaOH: 1,16 gam, nước cất: 1.000 ml, điều chỉnh pH: 7) nút bịt miệng ống nghiệm giấy để qua đêm Phân lập vi khuẩn theo phương pháp pha loãng tới hạn trang môi trường King’B (Pepton: 20 g; K2HPO4: 1,5 g; MgSO4.7 H2O: 1,5 g; Agar 17 g bổ sung nước đủ 1.000 ml) Sau tách làm chủng vi khuẩn nội sinh (VKNS) môi trường PDA (khoai tây: 200 g; D - Glucose: 20 g; Agar: 17 g; nước cất: 1.000 ml) nuôi vi khuẩn điều kiện nhiệt độ 28oC 78 V (mm) = D (mm) - d (mm) Trong đó: D đường kính trung bình vịng kháng nấm phát triển nấm bao quanh khuẩn lạc tính theo chiều vng góc; d đường kính trung bình tính theo chiều vng góc khuẩn lạc Căn vào trị số V, xác định chủng vi khuẩn có hiệu lực kháng nấm Fusarium oxysporum Hiệu lực kháng nấm bệnh chủng vi khuẩn nội sinh phân thành cấp theo phương pháp Phạm Quang Thu Nguyễn Thị Thúy Nga, 2007) cụ thể sau: Hiệu lực kháng mạnh (++++): Đường kính vịng kháng V ≥ 20 mm Hiệu lực kháng mạnh (+++): Đường kính vịng kháng 10 mm ≤ V < 20 mm Hiệu lực kháng trung bình (++): Đường kính vịng kháng mm ≤ V < 10 mm Hiệu lực kháng yếu (+): Đường kính vịng kháng mm ≤ V