Bước đầu nghiên cứu phân lập tuyển chọn vi khuẩn bacillus spp từ phụ phế phẩm có hoạt tính kháng nấm sinh aflatoxin

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố công trình khác Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn đƣợc cảm ơn thơng tin trích dẫn Luận văn đƣợc rõ nguồn gốc Sinh viên thực luận văn Trần Chi Phúc LỜI CÁM ƠN Đầu tiên, xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến cha mẹ gia đình ln bên cạnh, cổ vũ, động viên giúp đỡ gặp khó khăn suốt q trình q trình học tập thực Đồ án Em xin cám ơn thầy, thuộc khoa CƠNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MƠI TRƢỜNG, Trƣờng Đại Học Cơng Nghệ TP Hồ Chí Minh tận tình dạy truyền đạt cho em đầy kiến thức suốt trình học tập trƣờng Đặc biêt, em chân thành cám ơn Ts Nguyễn Hồi Hƣơng tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn truyền đạt cho em nhiều kiến thức suốt thời gian nghiên cứu thực đồ án Em xin cám ơn quý thầy, phụ trách Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học, Khoa CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MƠI TRƢƠNG, Trƣờng Đại Học Cơng Nghệ TP Hồ Chí Minh tạo điều kiện tốt giúp cho em thực hoàn thành Đồ án tốt nghiệp Tơi xin cám ơn giúp đỡ nhiệt tình cộng tất bạn làm việc phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học giúp đỡ cho tơi suốt q trình thực Đồ án tốt nghiệp TP Hồ Chi Minh, ngày … tháng … năm 2014 Trần Chí Phúc Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH ẢNH v MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Độc tố nấm mốc 1.2 Độc tố aflatoxin 1.2.1 Lịch sử nghiên cứu 1.2.2 Tính chất vật lý phân loại 1.2.3 Sự tạo thành aflatoxin nấm mốc 1.2.4 Cơ chế gây độc aflatoxin 1.2.5 Độc tính aflatoxin 1.2.6 Giới hạn mức cho phép độc tố aflatoxin 10 1.2.7 Tình hình nhiễm độc aflatoxin 11 1.2.8 Phương pháp phát aflatoxin 12 1.3 Phƣơng pháp khử nhiễm aflatoxin 15 1.3.1 Phương pháp vật lý học 15 1.3.2 Phương pháp hóa học 17 1.3.3 Phương pháp sinh học 18 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Thời gian – địa điểm nghiên cứu 20 2.2 Vật liệu - Thiết bị - Hóa chất 20 2.2.1 Vật liệu 20 2.2.2 Thiết bị dụng cụ 20 2.2.3 Mơi trường – Hóa chất 20 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 i Đồ án tốt nghiệp 2.3.1 Phương pháp luận 22 2.3.2 Bố trí thí nghiệm 23 2.3.3 Một số phương pháp khảo sát sinh hóa vi khuẩn 34 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Phân lập chủng khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo cách tiếp cận thứ 40 3.1.1 Khảo sát khả đối kháng chủng khuẩn phân lập với nấm phương pháp đồng nuôi cấy môi trường hỗn hợp 40 3.1.2 Khảo sát khả đối kháng với nấm dịch ly tâm canh trường nuôi cấy vi khuẩn môi trường hỗn hợp 42 3.2 Phân lập chủng khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo cách tiếp cận thứ hai 43 3.2.1 Khảo sát khả đối kháng chủng khuẩn phân lập với nấm mốc môi trường PDA 47 3.2.2 Khảo sát khả ức chế khả sinh aflatoxin chủng khuẩn phân lập với nấm môi trường CCA 48 3.3 Khảo sát sinh hóa chủng khuẩn phân lập đƣợc 50 3.3.1 Nhuộm bào tử 50 3.3.2 Thử nghiệm Simmon citrate 51 3.3.3 Thử nghiệm catalase 52 3.3.4 Thử nghiệm protease 52 3.3.5 Thử nghiệm chitinase 53 3.3.6 Thử nghiệm lên men carbohydrate 53 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 57 4.1 Kết luận 57 4.2 Đề nghị 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC ii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC VIẾT TĂT A.O.A.C: Association of Analytical Communities CCA: coconut cream agar Ctv: cộng tác viên ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FDA: Food and Drug Administration HPTLC : high ferformane thin layer chromatography TLC NA: Nutrient agar NB: Nutrient broth PDA: Potato dextrose agar PDB: Potato dextrose broth ppb: parts per billion TFA: Tryfloacetic acid TLC: Thin layer chromatographi UV: Ultraviolet iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG TRANG Bảng 1.1 Tính chất hóa lý số aflatoxin .5 Bảng 1.2 Một số lồi nấm có khả sinh aflatoxin .6 Bảng 1.3 Ảnh hƣởng aflatoxin có mặt thức ăn đến biểu bệnh lý vật nuôi Bảng 1.4 Giới hạn aflatoxin số nƣớc theo tiêu chuẩn FDA .10 Bảng 1.5 Những quy định tạm thời cho phép thức ăn chăn nuôi nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi Việt Nam 11 Bảng 1.6 Các phƣơng pháp khử nhiễm aflatoxin đƣờng sinh học 16 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái nguồn gốc chủng vi khuẩn phân lập 40 Bảng 3.2 Kết thử nghiệm sinh hóa vi khuẩn CS1b 51 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH TRANG Hình 1.1 Cơ chế tác dụng aflatoxin B1 mức tế bào gan Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát phân lập tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm sinh aflatoxin 23 Hình 2.2 Sơ đồ trình bày chi tiết phân lập tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm mốc theo cách tiếp cận thứ 24 Hình 2.3 Sơ đồ trình bày chi tiết phân lập tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm mốc theo cách tiếp cận thứ hai 29 Hình 3.1 Kết đối kháng chủng vi khuẩn phân lập đƣợc môi trƣờng hỗn hợp 41 Hình 3.2 Kết đối kháng nấm dịch tăng sinh môi trƣờng PDA 44 Hình 3.3 Chủng vi khuẩn CS1a phân lập từ trái cà phê 45 Hình 3.4 Chủng vi khuẩn CS1b phân lập từ trái cà phê 46 Hình 3.5 Kết đối kháng nấm dịch ly tâm canh trƣờng với nấm mốc môi trƣờng PDA 48 Hình 3.6 Kết ức chế phát triển khả tổng hợp aflatoxin nấm mốc dịch ly tâm canh trƣờng vi khuẩn môi trƣờng CCA 49 Hình 3.7 Kết nhuộm bào tử khuẩn CS1b 51 Hình 3.8 Thử nghiệm Simmon citrate CS1b cho kết dƣơng tính 51 Hình 3.9 Thử nghiệm catalase CS1b cho kết dƣơng tính 52 Hình 3.10 Thử nghiệm protease Chủng CS1b cho kết dƣơng tính 52 Hình 3.11 Kết thí nghiệm chintinase Chủng CS1b cho kết âm tính 53 Hình 3.12 Kết lên men Glucose Chủng CS1b cho kết dƣơng tính 54 Hình 3.13 Kết lên men Lactose Chủng CS1b cho kết âm tính 54 Hình 3.14 Kết lên men Sucrose Chủng CS1b cho kết âm tính 55 Hình 3.15 Kết lên men Sucrose Chủng CS1b cho kết âm tính 55 v Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Đặt vấn đề - Mycotoxin hay độc tố nấm mốc nhóm độc chất tự nhiên nấm mốc sản xuất trình phát triển Ngƣời ta phát hàng ngàn loại mycotoxin (đƣợc sinh chủ yếu nhóm nấm mốc Aspergillus, Penicillium Fusarium), phải kể đến aflatoxin Aflatoxin vừa gây độc cấp tính (ở liều lƣợng lớn gây chết số loài gia súc, gia cầm) vừa gây độc mãn tính (ở liều lƣợng thấp tích tụ gan, gây rối loạn chức năng, suy giảm miễn dịch, thối hóa gan thận…) Một số nghiên cứu chứng minh aflatonxin nguyên nhân gây ung thƣ cho động vật thí nghiệm, nguy hiểm ngƣời Nhóm độc tố aflatoxin sinh chủ yếu hai loài nấm mốc Aspergillus flavus Aspergillus parisiticus Các loài nấm mốc có mặt nhiều số loại lƣơng thực nhƣ ngơ, lạc… vài loại hạt có chứa dầu Trong điều kiện nhiệt độ độ ẩm tƣơng đối cao nhƣ nƣớc ta, việc bảo quản nguồn lƣơng thực sau thu hoạch nhƣ nguồn nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi cần thiết Nếu khơng có điều kiện bảo quản thích hợp điều kiện thuận lợi cho xâm nhập phát triển nấm mốc sinh aflatoxin Ngoài việc làm giảm chất lƣợng dinh dƣỡng cho lƣơng thực ngun liệu làm thức ăn chăn ni, mà cịn gây tích tụ độc tố nguồn Điều gây tổn thất lớn cho ngành chăn ni nói chung cho ngƣời nơng dân nói riêng Bên cạnh đó, việc sử dụng nguồn lƣơng thực thực phẩm có tích tụ độc tố aflatoxin ảnh hƣởng không nhỏ đến sức khỏe ngƣời tiêu dung - Nhận đƣợc tình hình thực tế đó, nhà khoa nƣớc giới có nhiều nghiên cứu nhằm giải vấn đề Các tác nhân nhƣ vật lí, hóa học đƣợc đƣa thí nghiệm nhằm làm hiệu lực aflatoxin Đặc biệt, xu hƣớng đƣợc trọng dựa vào tác nhân vi sinh vật Các loài nấm mốc (Rhizopus stolonifer, Rhizopus arrhizus), vi khuẩn (Bacillus subtilis, Bacillus pulimus…) đƣợc thử nghiệm khả làm giảm aflatoxin thu đƣợc kết khả quan Đồ án tốt nghiệp - Vì lí thực tiễn nhƣ trên, định chọn đề tài: “ Bƣớc đầu nghiên cứu phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp từ phụ phế phẩm có hoạt tính kháng nấm sinh aflatoxin.” Trong khóa luận tốt nghiệp Mục đích - Phân lập tuyển chọn đƣợc vi khuẩn có khả kháng nấm Mục tiêu đề tài - Bƣớc đầu phân lập tuyển chọn Bacillus spp từ phụ phế phẩm có khả kháng nấm sinh aflatoxin Nơi dung đồ án - Phân lập chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm mốc sinh aflatoxin - Sàng lọc tuyển chọn vi khuẩn dựa hoạt tính đối kháng hoạt tính ức chế sinh tổng hợp aflatoxin nấm mốc - Định danh sơ vi khuẩn xác định chế kháng nấm mốc sinh aflatoxin thử nghiệm sinh hóa Kết cấu đồ án - Chƣơng I: Tổng quan tài liệu – nội dung chƣơng đề cập đến nội dung liên quan đến tài liệu nghiên cứu - Chƣơng II: Vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu – nội dung chƣơng đề cập đến dụng cụ, thiết bị phƣơng pháp nghiên cứu đồ án - Chƣơng III: Kết thảo luận – nội dung chƣơng đƣa kết mà đề tài thực đƣợc đƣa thảo luận, biện chứng cho kết thu đƣợc - Chƣơng IV: Kết luận đề nghị - nội dung chƣơng tóm lại kết mà đề tài đạt đƣợc đề nghị cho hƣớng cần cải thiện thêm đề tài Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 - Độc tố nấm mốc: Độc tố nấm mốc hay gọi mycotoxin hợp chất có phân tử nhỏ, bền điều kiện, sản phẩm trao đổi chất thứ cấp trình phát triển loài vi nấm Các mycotoxin dễ dàng xâm nhập giữ đƣợc độc tính chuỗi thức ăn khó khăn để loại bỏ tiêu diệt - Độc tố nấm mốc đƣợc phát lần đầu liên vào năm 1960, sau chết hàng loạt hàng trăm cá thể trang trại gà tây Anh (T Asao ctv,1963; F.Wu P Khlangwiset, 2010) - Cho đến có 300 loại độc tố nấm mốc đƣợc phát nghiên cứu Nhƣng có 20 loại độc tố nấm mốc có độc tính gây hại - Bệnh nấm mốc ngƣời động vật khơng có khả lây lan chúng tác nhân độc tố (hóa học) gây ra.Tuy nhiên, hầu nhƣ tất sản phẩm thực vật chất cho phát triển nấm mốc tạo mycotoxin tiếp theo, có khả nhiễm trực tiếp cho thực phẩm ngƣời Khi gia súc ăn thức ăn có nhiễm mycotoxin, chúng khơng chịu tác dụng trực tiếp mà nguồn mang mycotoxin vào sữa, thịt, nhƣ tạo nhiễm mycotoxin cho ngƣời 1.2 Độc tố aflatoxin: 1.2.1 Lịch sử nghiên cứu: - Aflatoxin mycotoxin đƣợc phát sớm vào năm 1961 nhà khoa học Butler Qua việc xác định đƣợc loài Aspergillus flavus tiết độc tố gây chết hàng loạt gà tây Anh, ông đặt tên cho độc tố aflatoxin (độc tố sinh Aspergillus flavus) (W.H Butler, 1964) - Các cơng trình nghiên cứu sau xác nhận Aflatoxin đƣợc tạo nấm Aspergillus flavus nguyên nhân gây khối u gan động vât (Halver, 1969; Wales, 1970; New, 1987 trích dẫn Chaver-Sanchelez, 1994) Đồ án tốt nghiệp Thử nghiệm cho thấy chủng CS1b phân lập tổng hợp đƣợc hệ enzyme - protease, đƣợc xem tác nhân ức chế phát triển nấm mốc 3.3.5 Thử nghiệm chitinase - Kết thử nghiệm, chủng CS1b không phân giải đƣợc chất chitin khơng tạo vịng sáng Mơi trƣờng bắt màu lugol (hình 3.11) Hình 3.11 Kết thí nghiệm chintinase Chủng CS1b cho kết âm tính - Nhƣ chủng CS1b không tổng hợp đƣợc enzyme chitinase Vậy hoạt tính kháng nấm chủng CS1b khơng phải chitinase 3.3.6 Thử nghiệm lên men carbohydrate - Sau 24 - 48 nuôi cấy, số nguồn đƣờng khảo sát, chủng CS1b cho kết dƣơng tính với đƣờng Glucose (mơi trƣờng ni cấy chuyển màu vàng) cho kết âm tính với ba nguồn carbohydrate sucrose, lactose manitol (môi trƣơng nuôi cấy chuyển sang màu đỏ) Kết đƣợc thể qua hình 3.12; hình 3.13; hình 3.14; hình 3.15 - Kết thí nghiệm cho thấy vi khuẩn CS1b có khả lên men Glucose tạo aicd Các sản phẩm acid tác nhân kháng lại phát triến nấm mốc Từ chúng tơi xem xét việc tiến hành bổ sung Glucose vào mơi trƣờng nuôi cấy CS1b nhằm thu đƣợc sản phẩm có hoạt tính kháng nấm 53 Đồ án tốt nghiệp ĐC CS1b Hình 3.12 Kết lên men Glucose Chủng CS1b cho kết dƣơng tính ĐC CS1b Hình 3.13 Kết lên men Lactose Chủng CS1b cho kết âm tính 54 Đồ án tốt nghiệp ĐC CS1b Hình 3.14 Kết lên men Sucrose Chủng CS1b cho kết âm tính ĐC CS1b Hình 3.15 Kết lên men Sucrose Chủng CS1b cho kết âm tính 55 Đồ án tốt nghiệp - Nhƣ kết thử nghiệm sinh hóa chủng vi khuẩn CS1b phân lập đƣợc phần phù hợp đặc điểm sinh hóa với vi khuẩn Bacillus, chúng tơi kết luận chủng Bacillus sp - Qua có thử nghiệm hóa sinh, chúng tơi cịn nhận thấy khả ức chế tổng hợp aflatoxin nhƣ phát triển nấm mốc sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn CS1b Các sản phẩm khơng có hoạt tính chitinase nhƣng kháng nấm theo chế khác Nhƣ protease β- glucanase, hợp chất hữu khác - Sau thử nghiệm hai phƣơng pháp tiếp cận để phân lập vi khuẩn kháng nấm từ phụ phế phẩm, nhận thấy khơng khó khăn nhiều phân lập đƣợc vi sinh vật kháng nấm tự nhiên Tuy nhiên để nghiên cứu sản xuất hợp chất kháng nấm từ vi sinh vật chất cảm ứng đóng vai trò quan trọng Trong thời gian thực đề tài, sử dụng tơ nấm làm chất cảm ứng Tuy nhiên chƣa sử dụng đơn chất tạo nên sinh khối nấm để làm chất cảm ứng, từ rút kết luận tác nhân kháng nấm vi khuẩn 56 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 4.1 - Kết luận Thử nghiệm hai phƣơng pháp tiếp cân để phân lập vi khuẩn đối kháng nấm sinh aflatoxin cho thấy, muốn khảo sát khả kháng nấm canh trƣờng vi khuẩn loại bỏ tế bào, cần nuôi cấy vi khuẩn môi trƣờng chứa chất cảm ứng thuộc sinh khối nấm mốc - Bằng phƣơng pháp trên, chủng vi khuẩn Bacillus sp đƣợc phân lập trái cà phê nhiễm nấm, có khả tổng hợp chất kháng nấm sinh aflatoxin (Aspergillus sp.) 4.2 - Đề nghị Cần mở rộng nguồn phân lập khác nhƣ đất trồng, trái cây… để tìm kiếm thêm chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm - Định danh vi khuẩn CS1b đến cấp lồi nhờ sử dụng API kit giải trình tự gen 16S rRNA - Cần tìm hiểu thêm chế tác động tác nhân vi khuẩn phân lập đƣợc ức chế phát triển hình thành độc tố aflatoxin - Cần có nghiên cứu trích ly hợp chất có canh trƣờng ni cấy vi khuẩn phân lập đƣợc, thu hợp chất tinh khiết có hoạt tính kháng nấm cao - Nghiên cứu xem xét đến hoạt tính kháng nấm sinh aflatoxin, cần mở rộng khảo sát chủng khuẩn Bacillus sp phân lập đƣợc lên nấm sinh độc tố khác nhƣ Fusarium, Aspergillus Penicilium… - Các thí nghiệm nghiên cứu dừng lại cấp độ in vitro Cần thực thí nghiệm in vivo để xác định khả kháng nấm tốt 57 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Đậu Ngọc Hào, Lê Thị Ngọc Diệp (2003) Nấm mốc độc tố aflatoxin thức ăn chăn nuôi NXB nông nghiệp [2] Dƣơng Thanh Liêm, Bùi Huy Nhƣ Phúc, Dƣơng Duy Đồng, (2002) Thức ăn dinh dưỡng động vật NXB nông nghiệp [3] Lê Anh Phụng( 2001) Bệnh nhiễm độc aflatoxin phương pháp phát aflatoxin Chuyên đề cấp tiến sĩ Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh [4] Phạm Văn Tất (1996), Tác hại Aflatoxin Tạp chí thuốc sức khỏe số 79 (1- 11 - 1996) [5] Phạm Hoàng Thái (2007) Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất, khảo sát khả ức chế sản sinh aflatoxin chủng phân lập Luận án tốt nghiệp Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Tài liệu tiếng Anh [6] Asao T., Buchi G., Adbel-Kader M.M., Chang S.B., Wick E.L., Wogan G.N (1963) Aflatoxins B and G Journal of American Chemical Society, 85, 17061707 [7] Butler W.H, 1964 Acute toxicity of aflatoxin Bl in rats B J Cancer 18:756 [8] Davis N.D., Iyer S.K., Diener U.L 1987 Improved Method of Screening for Aflatoxin with a Coconut Agar Medium Applied and Environmental Microbiology 53:1593-1595 [9] Kondo T., Sakurada M., Okamoto S., Ono M., Tsukigi H., Suzuki A., Nagasawa H., Sakuda S (2001) Effects of aflastatin A, an inhibitor of aflatoxin production, on aflatoxin biosynthetic pathway anh glucose metabolism in Aspergillus parasiticus J Antibiot (Tokyo) 54: 650-657 [10]Kurtzman C.P., Horn B.Q., Heseltine C.W (1987) Aspergillus nomius, a new aflatoxin producing species related to Aspergillus flavus and Aspergillus tamari Antonie van Leeuwenhoek 53: 147-158 58 Đồ án tốt nghiệp [11]Munimbazi C., Bullerman LB (1998) Inhibition of aflatoxin production of Aspergillus parasiticus NRRL 2999 by Bacillus pumilus Mycopathologia 140: 163-169 [12]Ono M., Sakuda S., Suzuki A., Isogai A (1997) Aflastatin A, a novel inhibitor of aflatoxin production by aflatoxingenic fungi J Antibiot (Tokyo) 50: 111-118 [13]Peterson S.W., Ito Y., Horn B.W., Goto T (2001) Aspergillus bombycis, a new aflatoxigenic species and genetic variation in its sibling species, A monius Mycologia 93: 689-703 [14]Wild CP., Gong YY 2010 Mycotoxins and human disease: a largely ignored global health issue Carcinogenesis 31:71-82 WHO (2008) World Health Statistics (2008) WHO Press, Geneva [15]Wu F., Khlangwiset P 2010 Health economic impacts and cost-effectiveness of aflatoxin reduction strategies in Africa: Case studies in biocontrol and postharvest interventions Food Additives & Contaminants 27:496-509 [16]Yan PS., Song Y., Sakuno E., Nakajima H., Nakagawa H., Yabe K (2004) Cyclo(L-leucyl-L-prolyl) produced by Achromobacter xylosoxidans inhibits aflatoxin production by Aspergillus parasiticus Appl Environ Microbiol 70:7466-7473 59 PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: THÀNH PHẦN MÔI TRƢỜNG SỬ DỤNG TRONG CÁC THÍ NGHIỆM A.1 Thành phần môi trƣờng Potato Dextrose Agar (PDA) Môi trƣờng PDA D - Glucose 20 g Agar 20 g Dịch chiết khoai tây 1000 ml A.2 Thành phần môi trƣờng Potato Dextrose Broth (PDB) Môi trƣờng PDB D - Glucose 20 g Dịch chiết khoai tây 1000 ml Lưu ý: - Dịch chiết khoai tây: 200g khoai tây thái lát, cho thêm vào 1000ml đun sôi 30 phút, thu dịch chiết định mức lên 1000ml Bảo quản tủ mát chƣa sử dụng - Khi nuôi cấy nấm mốc, bổ sung Chloramphenicol vào thành phần mơi trƣờng với tỉ lệ 0.02% A.3 Thành phần môi trƣờng Nutrient Broth (NB) Môi trƣờng NB Peptone 5g Meat extract 3g NaCl 5g Nƣớc cất 1000 ml A.4 Thành phần môi trƣờng Nutrient Broth_1 (NB1) Môi trƣờng NB1 Peptone 2.5 g Meat extract 1.5 g NaCl 2.5 g Nƣớc cất 500 ml Dịch tơ nấm (10g/l) 500 ml A.5 Thành phần môi trƣờng Nutrient Agar (NA) Môi trƣờng NA Peptone 5g Meat extract 3g NaCl 5g Agar 20 g Nƣớc cất 1000 ml A.6 Thành phần môi trƣờng Coconut Cream Agar (CCA) Môi trƣờng CCA Agar 20 g Dịch nƣớc cốt dừa 500 ml Nƣớc cất 500 ml Lưu ý: - Dịch nƣớc cốt dừa: 250g cơm dừa đƣợc trộn phút 500ml nƣớc cất đun sôi Lọc loại bỏ cặn - Khi pha môi trƣờng, cần đun sôi hỗn hợp trƣớc khử trùng bắng autoclave A.7 Thành phần môi trƣờng Simmon citrate Môi trƣờng Simmon citrate MgSO4 0.2 g NH4H2PO4 1g K2HPO4 1g Natri Citrate 2g NaCl 5g Bromothymol Blue 0.08 g Agar 15 g Nƣớc cất 1000 ml A.8 Thành phần môi trƣờng Phenol Red Carbohydrate Broth Môi trƣờng Phenol Red Carbohydrate Broth Tryticase peptone 10 g NaCl 5g Meat extract 1g Phenol red 0.018 g (7.2 ml dung dịch Phenol red 0.25%) Nƣớc cất 1000 ml Carbohydrate A.9 Thành phần môi trƣờng Casein 1% Môi trƣờng CCA Agar 15 g Casein 10 g Đệm Phosphate (pH=7) 1000 ml A.10 Thành phần môi trƣờng Chitin 1% Môi trƣờng CCA Agar 15 g Huyền phù chitin 2% 500 ml Đệm Phosphate (pH=7) 500 ml Lưu ý: - Huyền phù hóa chitin: lấy 10 g chitin hòa vào 100ml HCl đậm đặc Khuấy 10 phút Sau cho từ từ nƣớc cất làm lạnh đến 500ml, chitin huyền phù có màu trắng sữa Để qua đêm ngăn mát tủ lạnh Huyền phù đƣợc rửa cách ly tâm (4000 vòng/10 phút) nhiều lần với dung dich có pH = đến huyền phù đạt pH = Bảo quản huyền phù tủ mát PHỤ LỤC B: HÌNH ẢNH NẤM MỐC ASPERGILLUS SP X3 PHÂN LẬP TRÊN ĐẬU PHỘNG - Nấm Aspergillus sp X3 đƣợc sinh viên Nguyễn Vân Hƣơng (lớp 11DSH04_ Đại học Công nghệ TP Hồ Chi Minh) phân lập từ đậu phộng - Trên môi trƣờng PDA, nấm Aspergillus sp X3 có sợi nấm màu trắng, bào tử có màu vàng lục đến luc - Định danh sơ bộ, X3 thuộc lồi Aspergillus Có hình thái lạc nấm hình thái cuống bào tử tƣơng đối giống với chủng Asp flavus Asp parisiticus - Trên mơi trƣờng AFPA, Aspergillus sp X3 làm hóa cam môi trƣờng - Trên môi trƣờng CCA, Aspergillus sp X3 phát huỳnh quang dƣới ánh sáng cực tím (UV) bƣớc sóng 365 nm ... có khả kháng nấm sinh aflatoxin Nôi dung đồ án - Phân lập chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm mốc sinh aflatoxin - Sàng lọc tuyển chọn vi khuẩn dựa hoạt tính đối kháng hoạt tính ức chế sinh tổng... kháng nấm sinh aflatoxin. ” Trong khóa luận tốt nghiệp Mục đích - Phân lập tuyển chọn đƣợc vi khuẩn có khả kháng nấm Mục tiêu đề tài - Bƣớc đầu phân lập tuyển chọn Bacillus spp từ phụ phế phẩm có. .. giảm aflatoxin thu đƣợc kết khả quan Đồ án tốt nghiệp - Vì lí thực tiễn nhƣ trên, định chọn đề tài: “ Bƣớc đầu nghiên cứu phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp từ phụ phế phẩm có hoạt tính kháng