Bài viết đánh giá các đặc tính di truyền để ứng dụng trong phân loại là rất hữu ích. Do vậy, nghiên cứu này chúng tôi cung cấp đa dạng di truyền vùng gen COII-16SrRNA của 3 loài M. incognita, M. javanica và M. arenaria ký sinh cây cà phê ở Tây nguyên.
TIỂU BAN ĐA DẠNG SINH HỌC VÀ BẢO TỒN ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÙNG GEN TY THỂ COII-16S-RRNA MỘT SỐ LOÀI TUYẾN TRÙNG SẦN RỄ MELOIDOGYNE SPP KÝ SINH CÂY CÀ PHÊ Ở TỈNH ĐẮK LẮK Lê Thị Mai Linh1,2, Nguyễn Thị Duyên1,2 Phan Kế Long2,3, Trịnh Quang Pháp1,2 Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Tuyến trùng sần rễ M incognita, M javanica, M arenaria ghi nhận gây hại nghiêm trọng ký sinh đa thực nhiều trồng có Cà phê (Perry et al., 2009) Hiện giới ghi nhận 17 loài ký sinh cà phê (Souza, 2008) Tại Việt Nam, công bố trước cho cho thấy có lồi M incognita ghi nhận nhiều vùng trồng cà phê xuất thêm loài khác ký sinh với loài M incognita M exigua, M coffeicola (Trinh et al., 2013) Nhiều nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền tuyến trùng nói chung tuyến trùng sần rễ nói riêng dựa vùng gen nhân gen ty thể áp dụng rộng rãi nhứng năm gần (Perry et al., 2009) Tuy nhiên, nhóm lồi tuyến trùng sần rễ, M incognita, M javanica M arenaria, việc sử dụng vùng gen nhân (18S, ITS, 28S) có nhiều hạn chế mức độ đa dạng di truyền thấp (Perry et al., 2009) Các nghiên cứu vùng gene ty thể (mtDNA) có kết tốt cho việc phân tích phát sinh chủng loại giống Meloidogyne (Holterman et al., 2009) Đặc biệt đoạn gen ty thể nằm COII-mtDNA 16S-rRNA sử dụng hiệu phân loại loài Meloidogyne spp., số lồi có đa dạng di truyền thấp như: M enterolobii, M incognita M javanica (Powers & Harris, 1993; Blok et al., 2002) Những nghiên cứu đa dạng di truyền hay phân loại nhóm tuyến trùng sần rễ Việt Nam thực cho thấy số vùng gen COI, ITS có độ đa dạng di truyền thấp với lồi M incognita, M javanica M Arenaria, nên khó sử dụng phân loại (Lê Thị Mai Linh & cs., 2015) Với quan trọng nhóm loài tuyến trùng sần rễ nhiệt đới trồng đặc biệt cà phê, việc nghiên cứu đánh giá đặc tính di truyền để ứng dụng phân loại hữu ích Do vậy, nghiên cứu cung cấp đa dạng di truyền vùng gen COII-16SrRNA loài M incognita, M javanica M arenaria ký sinh cà phê Tây nguyên I VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp thu thập cà phê vối (Coffea canephora) huyện Cư M‟gar- Tỉnh Đắk Lắk Đặc điểm hình thái mẫu nghiên cứu (ký hiệu M4533, M4531, M4546), phân loại tương ứng với loài M incognita, M javanica, M arenaria Mẫu lưu trữ dung dịch TAF DESS phòng Tuyến trùng học (Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật) 768 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ Phƣơng pháp nghiên cứu Tách chiết DNA: Cắt cá thể trưởng thành vào ống effendorf có chứa μl dung dịch đệm WLB (Worm Lysis Buffer) [50 mM KCl, 10 mM Tris pH 8,0, 15 mM MgCl 2, 0,45% Tween 20] 10 μl nước, thêm μl proteinase K đặt tủ lạnh sâu -75°C 60 phút Sau chuyển mẫu sang ủ nhiệt độ 65°C 60 phút, ủ nhiệt độ 96°C 10 phút Bảo quản DNA thu tủ lạnh sâu -20°C (Subbotin et al., 2001) Khuếch đại vùng gen COII: Cặp mồi C2F3/1108: C2F3 (5-GGTCAATGTTCAGAAATTT GTGG-3)/ 1108(5-TACCTTTGACCAATCACGCT-3) (Powers & Harris (1993) sử dụng cho khuếch đại vùng gen COII-16S-rRNA kỹ thuật PCR Các sản phẩm PCR tinh QIA quick Gel Extraction Kit (GmbH Qiagen, Hilden, Germay) gửi đọc trình tự Cơng ty Macrogen - Hàn Quốc Phân tích số liệu di truyền: Sử dụng chương trình BLAST để tìm kiếm trình tự tương đồng tác giả khác công bố ngân hàng ADN Genbank Phân tích khác vị trí nucleotide lồi sử dụng với ClustalW phần mềm Bioedit 7.2.0 (Hall 1999) Khoảng cách di truyền phát sinh chủng loại dựa trình tự vùng gene COII-16S-rRNA quần thể/loài gần gũi sử dụng phương pháp Minimum Likelihood (Rzhetsky & Nei, 1992) với mơ hình HKY+G+I phương pháp Maximum parsimony với thuật toán hoán vị nhánh - Subtree Pruning Regrafting (SPR), lặp lại 10 lần thêm taxon ngẫu nhiên, phân tích bootstrap với 1000 lần lấy lại mẫu Phần mềm MEGA 6.0 (Tamura et al., 2013) II KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Vùng gen COII-16S-rRNA mẫu nghiên cứu có chiều dài khoảng 950bp đối chiếu với trình tự tương dồng lồi thuộc giống Meloidogyne công bố ngân hàng trình tự ADN genbank cho thấy có tương đồng cao mẫu nghiên cứu với loài giống Meloidogyne, từ 95-100% Phân tích khoảng cách di truyền ma trận khoảng cách di truyền trình tự theo mơ hình Tamura Nei với phân phối Gamma (TN93 + Γ) trình bày bảng Bảng Ma trận khoảng cách di truyền chủng Meloidogyne nghiên cứu với loài Meloidogyne spp (TN93 + Γ) 769 TIỂU BAN ĐA DẠNG SINH HỌC VÀ BẢO TỒN Bảng cho thấy mẫu nghiên cứu có mức độ tương đồng với lồi M javanica, M incognita, M Arenaria tham khảo cao Quần thể lồi M incognita (M4533) có khoảng cách di truyền loài M incognita (KP001571.1; FJ159631.1) 0.00, quần thể loài M arenaria (M4546) tương đồng với M arenaria (KX280643.1; JQ446377.1; KX983450.1) 0.00 quần thể loài M javanica (M4531) tương đồng M javanica (KC287197.1; KC287196.1) 0.00 Các quần thể loài M javanica, M incognita, M arenaria tương đồng với loài M hapla, M enterolobii, M gramminicola, M mali, M partityla, M marylandi, M fallax M naasi từ 0.17 - 0.49 Như cho thấy ranh giới cách biệt loài M javanica, M incognita, M arenaria thấp từ 0.00 - 0.01 Quần thể loài Việt Nam có 12 biến đổi nucleotide vùng gen COII-16S Trong vị trí nucleotide thứ 126, 223, 287, 680, 682, 807 quần thể loài M incognita có biến đổi so với lồi cịn lại, quần thể lồi M arenaria có vị trí biến đổi vị trí 298 982 khác biệt so với lồi cịn lại Quần thể lồi M javanica có biến đổi vị trí 529 807 so với lồi cịn lại Tuy nhiên lồi lại khơng có biến đổi (sai khác 0- nucleotide) (Bảng 2) Bảng Vị trí biến đổi nucleotide chủng Meloidogyne spp., nghiên cứu với loài gần gũi Tên mẫu/ Loài Meloidogyne sp 4533 KP001571 M incognita FJ159631 M incognita Meloidogyne sp 4546 KX280643 M arenaria JQ446377 M arenaria KX983450 M arenaria Meloidogyne sp 4531 KC287197 M javanica KC287196 M javanica Vị trí biến đổi nucleotide 126 223 287 298 G A C A G A C A G A C A G T G A G T G A G T G A G T G A G T G G G T G G G T G G 529 A A A A A A A G G G 550 T T T G T T T T T T 568 G G G A G G G G G G 680 A A A G G G G G G G 682 T T T G G G G G G G 807 G G G A A A 900 A G G G G G G G G G 928 G G G A A A A G G G Cây phát sinh chủng loại loài giống Meloidogyne, sử dụng loài Radopholus similis làm loài tham chiếu ngoài, xây dựng với thuật toán Maximumlikelihood (ML) Maximum parsimony (MP) xây dựng với thuật toán hoán vị nhánh Subtree Pruning Regrafting (SPR), cho hai phát sinh chủng loại có độ tương đồng cao dạng hình học chiều dài nhánh, phản ánh tính trung thực đánh giá mối quan hệ phát sinh chủng loại loài Các giá trị bootstrap gốc nhánh từ 75 trở lên cho thấy kết xác tin cậy (hình 1, hình 2) Cây phát sinh chủng loại thể rõ phân nhánh loài M incognita, M arenaria, M javanica so với lồi cịn lại, nhiên nhánh lồi thể phân hóa nhỏ, khó tách lồi ML, phân hóa thể rõ MP phương pháp yêu cầu liệu đầu vào phải cân đối để mang đủ đặc điểm phát sinh nhóm cần thiết cho phân tích Trong lồi M arenaria thể phân hóa rõ chủng thuộc loài tạo thành nhánh riêng biệt MP Qua phân nhánh phát sinh chủng loại cho thấy chủng Meloidogyne sp 4533, Meloidogyne sp 4546, Meloidogyne sp 4531 với lồi M incognita, M arenaria, M javanica có mức độ đa dạng di truyền thấp khó sử dụng phân loại 770 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ KX280643 M arenaria M arenaria 4546 JQ446377 M arenaria M javanica 4531 KC287197 M javanica KC287196 M javanica JN673275 M incognita KP001571 M incognita 99 93 M incognita 4533 FJ159631 M incognita 84 KJ146864 M enterolobii 100 AY446975 M.mayaguensis KF993633 M hapla AY672413 M partityla 82 KC112913 M mali JN241955 M marylandi 87 KF993640 M exigua JN241914 M naasi KJ576894 M graminicola JN241954 M fallax KF251138 R similis 91 92 88 95 83 0.1 Hình 1: Cây phát sinh chủng loại quần thể/loài Meloidogyne spp theo phƣơng pháp Maximum Likelihood (HKY+G+I) giá trị bootstrap (%) thể nhánh gốc Các nghiên cứu trước cho sử dụng vùng gen COII đánh giá mức độ đa dạng loài Meloidogyne với vùng gen IGS 28S-D2d3 Vùng gen ty thể COII xem vùng bảo thủ sử dụng để phân biệt loài Meloidogyne (Blouin, 2002; Tigano et al., 2005) Hơn nữa, vùng gen hầu hết loài Meloidogyne từ nhiệt đới tạo thành nhánh riêng biệt phát sinh chủng loại với giá trị Bootstrap lên tới 86%, lồi ơn đới nhóm lại với bootrstrap 93 (Onkendi & Moleleki., 2013) Đối với loài M arenaria, M incognita, M javanica nghiên cứu trước cho thấy chúng có đa dạng di truyền thấp vùng gen 18S, ITS, 28S IGS (McClure et al., 2012; Deley et al., 2002; Adam et al., 2009; Carneiro et al., 2014, Block et al., 1997), vùng gen nhân khơng thể phân biệt lồi Vùng gen ty thể có mức độ tiến hóa nhanh hơn, tạo biến đổi nucleotide đủ cho phân loại cấp độ loài (Block et al., 2009) Vùng gen COII-16S sử dụng thành cơng phân loại lồi Meloidogyne gần gũi (Powers et la., 2005) Các nghiên cứu trước ghi nhận trình tự vùng gen COII-16S lồi M incognita có chiều dài khoảng 1500bp 1700bp, 1700 bp loài M javanica, 1100bp loài M arenaria (Blok et al., 2002; Powers and Harris, 1993) Tuy nhiên nghiên cứu ghi nhận trình tự dài 950 bp gen lồi, nên chưa đủ để phân tích phân hóa chúng, cần có thêm nghiên cứu vùng gen 771 TIỂU BAN ĐA DẠNG SINH HỌC VÀ BẢO TỒN 92 90 92 94 92 82 82 100 95 85 92 100 89 74 85 99 98 83 KP001571 M incognita FJ159631 M incognita M incognita 4533 JN673275 M incognita KX280643 M arenaria JQ446377 M arenaria M arenaria 4546 KC287196 M javanica KC287197 M javanica M javanica 4531 KJ146864 M enterolobii AY446975 M.mayaguensis KF993633 M hapla AY672413 M partityla KC112913 M mali JN241955 M marylandi KF993640 M exigua JN241914 M naasi KJ576894 M graminicola JN241954 M fallax KF251138 R similis Hình 2: Cây phát sinh chủng loại MP (Maximum parsimony) Giá trị bootstrap (%) với 1000 lần lấy lại mẫu thể nhánh gốc III KẾT LUẬN Đã xác định đoạn ADN với chiều dài khoảng 950bp thuộc vùng gen COII-16S-rRNA quần thể tuyến trùng Meloidogyne incognita, M javanica, M arenarea ký sinh cà phê Đắk Lắk Đa dạng di truyền đoạn trình tự thấp, với khoảng cách di truyền từ 0.000.01 có 12 biến đổi nucleotide đoạn gen so với trình tự tương đồng lồi nhóm cơng bố Genbank Lời cảm ơn: Bài báo hoàn thành trợ giúp kinh phí đề tài sở mã số IEBR.DT.04/17-18 TÀI LIỆU THAM KHẢO Blok V C., Wishart J., Fargette M., Berthier K & Phillips M S., 2002 Mitochondrial DNA differences distinguishing Meloidogyne mayaguensis from the major species of tropical root-knot nematodes Nematology 4, 773-781 De Ley I T., De Ley P., Vierstraete A., Karssen G., Moens M., Vanfleteren J., 2002 Phylogenetic analyses of Meloidogyne small subunit rDNA J Nematol 34: 319-327 Lê Thị Mai Linh., 2015 Phân tích mối quan hệ di truyền số loài tuyến trùng ký sinh gây sần rễ Meloidogyne spp Hồ tiêu Quảng Trị Báo cáo kết nghiên cứu đề tài cán trẻ 2015 Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật McClure M A., Nischwitz C., Skantar A M., Schmitt M E,, Subbotin S A., 2012 Root-knot nematodes in golf course greens of the western United States Plant Dis 96: 635647 772 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ Onkendi E M., Moleleki L N., 2013 Distribution and genetic diversity of root-knot nematodes (Meloidogyne spp.) in potatoes from South Africa Plant Pathology (2013) 62: 1184-1192 Powers T O., Harris T S., 1993 A polymerase chain reaction method for identification of five major Meloidogyne species Journal of Nematology 25, 1-6 Powers T O., Mullin P G., Harris T S., Sutton L A., Higgins R S., 2005 Incorporating molecular identification of Meloidogyne spp into a large-scale regional nematode survey J Nematol 37: 226-235 Subbotin S A., Vierstraete A., De Ley P., Rowe J., Waeyenberge L., Moens M & Vanfleteren J R., 2001 Phylogenetic relationships within the cystforming nematodes (Nematoda, Heteroderidae) based on analysis of sequences from the ITS regions of ribosomal DNA Molecular Phylogenetics and Evolution, 21(1): 1-16 Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., and Kumar S., 2013 MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0 Molecular Biology and Evolution 30: 2725-2729 10 Trinh P Q., 2013 Emerging Meloidogyne species threats to coffee and black pepper in the Western Highland in Vietnam Emerging Meloidogyne species (root-knot nematodes) threats to coffee in the Western Highlands in Vietnam In: Proceedings of the 2nd VASTKAST workshop on biodiversity and bio-active compounds: 313-318 GENETIC DIVERSITY OF COII-16S-RRNA SEQUENCE OF SOME MELOIDOGYNE SPP SPECIES ON COFFEE IN DAK LAK Le Thi Mai Linh, Nguyen Thi Duyen, Phan Ke Long, Trinh Quang Phap SUMMARY The genetic diversity of the three root knot nematodes species: M javanica, M incognita and M arenaria isolated on coffee growing provinces in Dak Lak- Tay nguyen Highland was based on sequences of the cytochrome oxidase small subunit II (COII) and the 5‟ end region of the 16S-rRNA gene had length about 950bp but had low genetic diversity with genetic distances from 0.00-0.01 and 12 nucleotide mutations of various in the gene with other M javanica, M incognita and M arenaria species in this genbank 773 ... thể nhánh gốc III KẾT LUẬN Đã xác định đoạn ADN với chiều dài khoảng 950bp thuộc vùng gen COII-16S-rRNA quần thể tuyến trùng Meloidogyne incognita, M javanica, M arenarea ký sinh cà phê Đắk Lắk. .. J., 2002 Phylogenetic analyses of Meloidogyne small subunit rDNA J Nematol 34: 319-327 Lê Thị Mai Linh., 2015 Phân tích mối quan hệ di truyền số loài tuyến trùng ký sinh gây sần rễ Meloidogyne. .. Meloidogyne với vùng gen IGS 28S-D2d3 Vùng gen ty thể COII xem vùng bảo thủ sử dụng để phân biệt lồi Meloidogyne (Blouin, 2002; Tigano et al., 2005) Hơn nữa, vùng gen hầu hết loài Meloidogyne từ