Mục tiêu nghiên cứu: (1) Đánh giá sự đa dạng di truyền và so sánh với các đặc điểm hình thái, giải phẫu của các loài nghiên cứu; (2) Định lượng berberin trong các loài nghiên cứu. MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN................................................................................. 2 1.1. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN LOẠI DỰA TRÊN CHỈ THỊ PHÂN TỬ ADN………………………………............................................ 2 1.1.1. Thành phần và cấu trúc ADN…………………………………………….. 2 1.1.2. Quá trình sao chép ADN………………………………………………..... 2 1.1.3. Các loại chỉ thị ADN……………………………………………………... 3 1.2. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ CỦA CHI BERBERIS L. …........ 7 1.2.1. Đặc điểm chung của họ Hoàng liên gai (Berberidaceae)............................ 7 1.2.2. Vị trí phân loại của chi Berberis L. ............................................................ 7 1.2.3. Đặc điểm thực vật chi Berberis L. .............................................................. 8 1.2.4. Đặc điểm một số loài thuộc chi Berberis L. ở Việt Nam............................ 8 1.2.5. Công dụng và tình hình khai thác sử dụng của các loài thuộc chi Berberis L. ở Việt Nam.................................................................................................. 9 1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BERBERIN................................... 10 1.3.1. Phương pháp cân........................................................................................ 10 1.3.2. Phương pháp đo quang............................................................................... 11 1.3.3. Phương pháp HPLC .................................................................................. 11 1.3.4. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)........................................................ 11 1.3.5. Phương pháp HPTLC................................................................................. 12 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................... 13 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ.................................................................. 13 2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu............................................................................... 13 2.1.2. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu....................................................................... 13 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU.......................................................................... 13 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................. 14 2.3.1. Nghiên cứu đa dạng di truyền...................................................................... 14 2.3.1.1. Thu mẫu..................................................................................................... 14 2.3.1.2. Tách chiết ADN........................................................................................ 14 2.3.1.3. Nhân bản ADN bằng máy PCR................................................................ 14 2.3.1.4. Điện di trên gel Agarose........................................................................... 15 2.3.1.5. Phân tích kết quả....................................................................................... 16 2.3.2. Phương pháp phân loại so sánh hình thái................................................... 17 2.3.3. Phương pháp định lượng berberin.............................................................. 17 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.......................................................... 19 3.1. KẾT QUẢ....................................................................................................... 19 3.1.1. Nghiên cứu đa dạng di truyền..................................................................... 19 3.1.2. Đặc điểm thực vật và giải phẫu các mẫu nghiên cứu................................. 22 3.1.3. Phân loại bằng so sánh hình thái................................................................. 29 3.1.4. Định lượng berberin.................................................................................... 32 3.2. BÀN LUẬN .............................................................................................. 34 3.2.1. Bàn luận về phương pháp............................................................................ 34 3.2.2. Bàn luận về kết quả……………………………………………………….. 35 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ....................................................................... 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phiếu giám định tên khoa học và Giấy chứng nhận mã số tiêu bản. Phụ lục 2: Hình ảnh sắc ký trong định lượng berberin bằng phương pháp HPTLC ở các bước sóng. Phụ lục 3: Pic cường độ màu các vết sắc ký.
BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU HẰNG NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ ĐỊNH LƢỢNG BERBERIN CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI BERBERIS L Ở VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2012 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU HẰNG NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ ĐỊNH LƢỢNG BERBERIN CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI BERBERIS L Ở VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: T.S Nguyễn Quốc Huy Nơi thực hiện: Bộ môn Thực Vật HÀ NỘI - 2012 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Quốc Huy, TS Hoàng Quỳnh Hoa, DS Phạm Hà Thanh Tùng – thầy tận tình dạy bảo, trực tiếp hƣớng dẫn tơi suốt q trình thực hồn thành khóa luận Xin gửi lời cảm ơn chân thành tới DS Nghiêm Đức Trọng, tập thể giảng viên, kỹ thuật viên môn Thực vật tạo điều kiện giúp tơi hồn thành khóa luận Tôi xin cảm ơn anh, chị Viện di truyền nơng nghiệp nhiệt tình bảo, hƣớng dẫn kiến thức sinh học phân tử Cảm ơn anh chị công ty Sapa Napro giúp đỡ tơi q trình thu mẫu tỉnh Lào Cai Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới bạn làm đề tài mơn Thực vật gia đình tơi, ngƣời bên cạnh động viên, giúp đỡ suốt thời gian qua Hà Nội, ngày 16 tháng năm 2012 Sinh viên Nguyễn Thị Thu Hằng MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI DỰA TRÊN CHỈ THỊ PHÂN TỬ ADN……………………………… 1.1.1 Thành phần cấu trúc ADN…………………………………………… 1.1.2 Quá trình chép ADN……………………………………………… 1.1.3 Các loại thị ADN…………………………………………………… 1.2 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ CỦA CHI BERBERIS L … 1.2.1 Đặc điểm chung họ Hoàng liên gai (Berberidaceae) 1.2.2 Vị trí phân loại chi Berberis L 1.2.3 Đặc điểm thực vật chi Berberis L 1.2.4 Đặc điểm số loài thuộc chi Berberis L Việt Nam 1.2.5 Công dụng tình hình khai thác sử dụng lồi thuộc chi Berberis L Việt Nam 1.3 CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG BERBERIN 10 1.3.1 Phƣơng pháp cân 10 1.3.2 Phƣơng pháp đo quang 11 1.3.3 Phƣơng pháp HPLC 11 1.3.4 Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 11 1.3.5 Phƣơng pháp HPTLC 12 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 13 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 13 2.1.2 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 13 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 13 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.3.1 Nghiên cứu đa dạng di truyền 14 2.3.1.1 Thu mẫu 14 2.3.1.2 Tách chiết ADN 14 2.3.1.3 Nhân ADN máy PCR 14 2.3.1.4 Điện di gel Agarose 15 2.3.1.5 Phân tích kết 16 2.3.2 Phƣơng pháp phân loại so sánh hình thái 17 2.3.3 Phƣơng pháp định lƣợng berberin 17 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 3.1 KẾT QUẢ 19 3.1.1 Nghiên cứu đa dạng di truyền 19 3.1.2 Đặc điểm thực vật giải phẫu mẫu nghiên cứu 22 3.1.3 Phân loại so sánh hình thái 29 3.1.4 Định lƣợng berberin 32 BÀN LUẬN 34 3.2.1 Bàn luận phƣơng pháp 34 3.2.2 Bàn luận kết quả……………………………………………………… 35 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 37 3.2 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phiếu giám định tên khoa học Giấy chứng nhận mã số tiêu Phụ lục 2: Hình ảnh sắc ký định lƣợng berberin phƣơng pháp HPTLC bƣớc sóng Phụ lục 3: Pic cƣờng độ màu vết sắc ký DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT A Adenine ADN Acid deoxyribonucleic AFLP Amplified fragment Length Polymorphism ARN Acid ribonucleic B Berberis C Cytosine CTAB Cetyl Trimethylammonium Bromide dATP 2’ – deoxyadenosine – 5’ – triphosphate dCTP 2’ – deoxycytidine – 5’ – triphosphate dGTP 2’ – deoxyguanosine – 5’ – triphosphate dNTPs Deoxynucleotide Triphosphates dTTP 2’ – deoxythymidine – 5’ – triphosphate G Guanine HPLC High performance Liquid chromatography HPTLC Hight performance Thin layer chromatography KT Kích thƣớc L Linnaeus NTSYS-PC Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System computer program PCR Polymerase Chain Reaction RAPD Randomly Amplified Polymorphic DNA RFLP Rectriction fragment Length Polymorphism sdv Standard deviation - Độ lệch chuẩn SKLM Sắc ký lớp mỏng SRFA Selective Restriction Fragment Amplication SSR Simple sequence repeats DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STS Sequence tagged site T Thymine TE Tris – base EDTA TLC Thin layer chromatography TT Thuốc thử UV Ultraviolet DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng số Tên bảng Trang 2.1 Các thành phần phản ứng PCR 15 2.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 15 3.1 Thống kê số băng ADN thu đƣợc mẫu với 13 mồi RAPD 19 3.2 Hệ số tƣơng đồng di truyền mẫu nghiên cứu 21 3.3 So sánh đặc điểm hình thái, giải phẫu mẫu mẫu 29 nghiên cứu với mơ tả khóa phân loại Trung Quốc 3.4 Kết định lƣợng berberin 33 DANH MỤC HÌNH Hình số Tên hình Trang 1.1 Cơng thức cấu tạo Berberin 10 3.1 Sản phẩm PCR – RAPD với mồi OPA3 20 3.2 Sản phẩm PCR – RAPD với mồi OPA18 20 3.3 Sản phẩm PCR – RAPD với mồi OPC11 20 3.4 Sản phẩm PCR – RAPD với mồi OPM9 20 3.5 Sản phẩm PCR – RAPD với mồi S201 20 3.6 Sản phẩm PCR – RAPD với mồi BiO24 20 3.7 Cây phân loại dựa vào thị phân tử RAPD 21 3.8 Hình thái mẫu BE1 22 3.9 Cấu tạo vi phẫu mẫu BE1 23 3.10 Cấu tạo vi phẫu thân mẫu BE1 23 3.11 Hình thái mẫu BE3 24 3.12 Vi phẫu mẫu BE3 25 3.13 Vi phẫu thân mẫu BE3 25 3.14 Hình thái mẫu BE4 27 3.15 Vi phẫu mẫu BE4 28 3.16 Vi phẫu thân mẫu BE4 29 3.17 Đƣờng chuẩn định lƣợng theo diện tích pic 33 ĐẶT VẤN ĐỀ Berberin alcaloid có nhân isoquinolin, có khoảng 150 loài thực vật bậc cao, thuộc 23 chi họ giới [7] Nó hoạt chất đƣợc ứng dụng lâu đời để chữa bệnh nhƣ lỵ trực khuẩn, tiêu chảy, đau mắt, ăn uống tiêu Cây thuốc chứa berberin thƣờng đƣợc ngâm rƣợu uống chữa triệu chứng huyết áp cao nhƣ hoa mắt, nhức đầu, chóng mặt, đau ngang lƣng Rễ sắc đặc ngâm rƣợu ngậm chữa đau Ngày nay, berberin có tiềm lớn điều trị bệnh nhƣ tiểu đƣờng, tăng huyết áp, ung thƣ, mỡ máu cao… [4], [8], [16], [30], [37], [38] Tại Việt Nam, xác định có 26 lồi thực vật thuộc họ khác chứa berberin Berberidaceae, Menispermaceae, Ranunculaceae, Rutaceae, Papaveraceae [7] Trong đó, thuộc chi Berberis L., họ Berberidaceae bị khai thác mức dẫn đến cạn kiệt nguồn nguyên liệu, trở thành thuốc quý đƣợc ghi sách đỏ [2] Về đặc điểm hình thái bên ngồi, lồi chi Berberis L giống nhau, chí giống với thuộc chi khác họ nhƣ chi Mahonia Điều dẫn đến nhầm lẫn việc xác định loài thu hái, sử dụng Trên giới có nghiên cứu phân biệt lồi chi mức độ phân tử số loài B asiatica Roxb, B aristata DC., B lycium Royle [36], v.v… so sánh loài họ Berberidaceae [31], nhƣng Việt Nam chƣa thấy nghiên cứu tƣơng tự Xuất phát từ lý trên, thực đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền định lƣợng berberin số loài thuộc chi Berberis L Việt Nam” với mục tiêu nghiên cứu là: Đánh giá đa dạng di truyền so sánh với đặc điểm hình thái, giải phẫu loài nghiên cứu Định lƣợng berberin loài nghiên cứu 35 bán định lƣợng, giúp xác định sơ nhanh hàm lƣợng berberin thân rễ mẫu 3.2.2 Bàn luận kết Về phân loại Chúng tiến hành đồng thời phƣơng pháp phân loại phƣơng pháp phân loại thị ADN phƣơng pháp phân loại so sánh đặc điểm hình thái giải phẫu mẫu nghiên cứu Cả phƣơng pháp cho kết mẫu đƣợc chia thành nhóm: - Nhóm 1: mẫu BE1 - Nhóm 2: mẫu BE3 BE4 Chỉ thị phân tử RAPD – PCR cho thấy mẫu nghiên cứu thuộc chi Berberis L đƣợc thu thập có độ đa dạng mặt di truyền không cao, giống đến 86% Kết hoàn toàn phù hợp với đặc điểm hình thái giải phẫu mẫu Vì việc phối hợp sử dụng thị phân tử hỗ trợ cho phƣơng pháp phân loại hình thái thu đƣợc kết có độ xác cao hơn, thêm đƣợc thơng tin phân loại cho loài Berberis L Tuy nhiên để có đƣợc kết xác cần thu thêm mẫu khu vực nghiên cứu, nhƣ thu rộng thêm nhiều mẫu khu vực phân bố loài Berberis L Định lượng berberin: Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng dựa diện tích pic chiều cao pic có sdv < Kết định lƣợng berberin thân rễ mẫu nghiên cứu cho thấy hàm lƣợng berberin rễ mẫu BE3 cao (3,98%) Các mẫu thân có hàm lƣợng dao động từ 1,61% đến 3,1%, mẫu BE4 thu Trạm nghiên cứu trồng thuốc Sapa cho hàm lƣợng berberin cao Nhƣ hàm lƣợng berberin rễ cao thân nên thu hái, sử dụng cần cân nhắc nên thu phận Kết định lƣợng phù hợp với tài liệu công bố [4], [8], [16] 36 Hàm lƣợng berberin thân mẫu BE3 BE4 khác (1,61% 3,1%) Nguyên nhân mẫu đƣợc thu thời điểm sinh trƣởng khác cây, thời gian sống khác nên hàm lƣợng berberin khác Một nguyên nhân dẫn đến khác khác vị trí địa lý mẫu (độ cao, thổ nhƣỡng, ) [28] 37 KẾT LUẬN Đã xây dựng đƣợc phân loại dựa hệ số tƣơng đồng di truyền mẫu Ở lần chia thứ với hệ số tƣơng đồng di truyền 0,86 (khác 0,14 hay 14%), mẫu đƣợc chia thành nhóm: nhóm gồm mẫu BE1 nhóm gồm mẫu BE3 BE4 Ở lần chia thứ với hệ số tƣơng đồng di truyền 0,95 (khác 0,05 hay 5%) tách thành nhóm: nhóm gồm mẫu BE3 nhóm gồm mẫu BE4 Kết hoàn toàn phù hợp với đặc điểm hình thái giải phẫu mẫu Đã mô tả đặc điểm vi phẫu thân mẫu nghiên cứu, góp phần tiêu chuẩn hóa nguồn dƣợc liệu chứa berberin Đã xác định đƣợc hàm lƣợng berberin có thân rễ mẫu nghiên cứu: thân mẫu BE1, BE3, BE4 rễ mẫu BE3 lần lƣợt 2,32%; 1,61%; 3,10%; 3,98% KHUYẾN NGHỊ Trong khuôn khổ đề tài dựa kết thu đƣợc, xin có số khuyến nghị sau : Tiếp tục nghiên cứu, hoàn thiện kỹ thuật phƣơng pháp đánh giá đa dạng di truyền phân loại lồi thuộc chi Berberis L Việt Nam nói riêng đối tƣợng khác nói chung thị phân tử Tiến tới xây dựng đồ gen cho loài thuộc chi Berberis L Việt Nam Tiếp tục thu thêm mẫu nghiên cứu để xác định xác lồi thuộc chi Berberis L cho hàm lƣợng berberin cao Tiêu chuẩn hóa đặc điểm thực vật, dƣợc liệu để xây dựng nguồn nguyên liệu chiết xuất berberin TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Nguyễn Tiến Bân (1997), Cẩm nang tra cứu nhận biết họ thực vật hạt kín Việt Nam, Nhà xuất Nông nghiệp, tr 10-11 Nguyễn Tiến Bân (2007), Sách đỏ Việt Nam, tập 2, Nhà xuất Khoa học kĩ thuật công nghệ, tr 129-131 Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007), Thực vật học, Nhà xuất Y học, tr 224241 Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung,…(2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập 1, Nhà xuất Khoa học kĩ thuật, tr 955-956 Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam III, , Nhà xuất Y học, tr 372-373, 500-501 Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, , Nhà xuất Y học, tr 779, 783-784, 929-930 Nguyễn Kim Cẩn (2002), “Nghiên cứu chứa berberin giới nƣớc”, Tạp chí Dược liệu, Tập 7, số 1,2,3,4 Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, tập 1, Nhà xuất Khoa học kĩ thuật, tr 440-441 Nguyễn Thị Minh Dân (2008), “Tính đa dạng chi Gynostemma tỉnh Cao Bằng”, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ khóa 2003-2008 10 Trịnh Đình Đạt (2010), Cơng nghệ sinh học, tập 4, Nhà xuất Giáo dục Việt Nam, tr 34-55 11 Đặng Nguyễn Hiền Giang (2010), “Phân loại số loài chi Gynostemma Blume tỉnh Lào Cai”, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ khóa 2005-2010 12 Nguyễn Nhƣ Hiền (2011), Công nghệ sinh học, tập 1, Nhà xuất Giáo dục Việt Nam, tr 48-52, 66-70, 193-197 13 Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, I, Nhà xuất Trẻ, tr 326 14 Điêu Thị Mai Hoa, Lê Trần Bình (2005), “Nghiên cứu tính đa hình di truyền 57 giống đậu xanh kĩ thuật RAPD”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, tập 3, số 1/2005, tr 57-66 15 Phạm Thanh Kỳ (2007), Dược liệu học, tập II, Nhà xuất Y học, tr.99 16 Đỗ Tất Lợi (2009), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, Nhà xuất Thời đại, tr 191-192 17 Đinh Đoan Long, Nguyễn Tập, Phạm Thanh Huyền, Lê Thanh Sơn, Ngô Đức Phƣơng (2009), “Sử dụng thị RAPD-PCR nghiên cứu đa hình di truyền nhằm góp phần giá trị bảo tồn hai lồi thuốc ngũ gia bì hƣơng (Acanthopanax gracilistylus W.W.Smith) ngũ gia bì gai (A.trifoliatus (L.) Merr) Việt Nam”, Tạp chí Dược liệu, tập 14 (1), tr 10-16 18 Phạm Thị Hồng Nhung (2002), “Nghiên cứu alcaloid số tác dụng sinh học Hồng liên rơ mọc đèo Gió – Tỉnh Cao Bằng (Mahonia sp.)”, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ khóa 1997-2002 19 Phạm Ngọc Oanh, Đỗ Thanh Phú, Nguyễn Thị Lang, Trần Công Luận, Trần Thu Hoa (2006), “Nghiên cứu mối quan hệ di truyền loài sâm bố kĩ thuật nhân ngẫu nhiên ADN đa hình (RAPD)”, Tạp chí Dược học, số 362, năm 46, 6/2006, tr 32-35 20 Đỗ Lê Thăng, Đinh Đoàn Long (2010), Chú giải di truyền học, Nhà xuất Giáo dục Việt Nam, tr 7-10, 38-44, 221-225 21 Nguyễn Xuân Thắng (2007), Hóa sinh học, Nhà xuất Y học, tr.109-121 22 Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Mậu, Lê Trần Bình (2006), “Nghiên cứu đa dạng di truyền số giống đậu xanh chịu hạn thị SSR RAPD”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, tập 4, số 4/2006, tr 99-106 23 Nguyễn Nghĩa Thìn, Các phương pháp nghiên cứu thực vật, Nhà xuất Đại học Quốc Gia Hà Nội, tr 5-68 24 Cao Văn Thu (2005), Sinh học đại cương, Trung tâm Thông tin – Thƣ viện Đại học Dƣợc Hà Nội, tr 83-112 25 Khuất Hữu Trung, Hà Trọng Huy, Nguyễn Trƣờng Khoa, Đồn Trắc Quỳnh, Ngơ Hồng Bình, Đặng Trọng Lƣơng (2009), “Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn bƣởi địa miền Bắc Việt Nam kĩ thuật SSR (microsatellite), Tạp chí khoa học công nghệ nông nghiệp Việt Nam 26 Khuất Hữu Trung, Nguyễn Trƣờng Khoa, Trần Minh Hoa, Ngơ Hồng Bình, Lê Thị Tƣơi, Nguyễn Xuân Viết, Đặng Trọng Lƣơng (2010), “Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn nhãn địa Việt Nam kĩ thuật SSR (microsatellite), Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nông thôn, số (149) 2010 27 Viện Dƣợc liệu (1993), Tài nguyên thuốc Việt Nam, Nhà xuất Khoa học kĩ thuật, tr 506-508 TIẾNG ANH 28 Andola HC, Gaira KS, Rawal RS, Rawat MS, Bhatt ID, “Habitat-dependent variations in berberine content of Berberis asiatica Roxb ex DC in Kumaon, Western Himalaya”, Chemistry Biodiversity Journal 2010 Feb, (2): 415-20 29 Cheng YJ, Guo WW, Yi HL, Pang XM, Deng XX (2003), An efficient protocol for genomic ADN extraction from Citrus species, Plant Mol Biol Rep 21:177 30 Choi MS, Oh JH, Kim SM, et al (May 2009), “Berberine inhibits p53dependent cell growth through induction of apoptosis of prostate cancer cell”, International Journal of Oncology, 34 (5): 1221 – 30 31 C.ROB and W.DURKA (2009), “Isolation and characterization of microsatellite markers the invasive shrub Mahonia aquifolium (Berberidaceae) and their applicability in related species”, Molecular Ecology Notes (2006), 6, 948-950 32 Clark MS (1997), Plant Molecular Biology – A laboratory manual, Springer, Heidelberg 33 Harish C Andola, R.S Rawal, M.S.M Rawat, I.D Bhatt, Vijay Kant Purohit (2010), “Analysis of Berberine content using HPTLC Fingerprinting of root and bark of three Himalayan Berberis species”, Asian Journal of Biotechnology (4): 239-245 34 Junsheng Ying, David E Boufford and Anthony R Brach, “Berberidaceae”, Flora of China Vol.19 35 Rohlf FJ (2000), NTSys-pc numerical taxonomy and multivariable analysis system, Exeter software Applied Biostatistics Ins., New York 36 Subramani Paranthaman Balasubramani, Gurinder Singh Goraya and Padma Venkatasubramanian (2010), “Development of ITS sequence-based markers to distinguish Berberis aristata DC from B lycium Royle and B asiatica Roxb.”, Biotechnology, 2011 July; 1(1): 11–19 37 Zhang H, Wei J, Xue R, et al (2009), “Berberine lowers blood glucose in type diabetes mellitus patients through increasing insulin receptor expression”, Metabolism: Clinical and Experimental 59 (2): 285 – 92 38 Zhang Y, Li X, Zuo D, et al (2008), “Treatment of type diabetes and dyslipidemia with the natural plant alkaloid berberine”, The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 93 (7): 2559-65 PHỤ LỤC Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội Bộ môn thực vật PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC Số: 07/12/HUY/TVD Mẫu do: Nguyễn Thị Thu Hằng Địa chỉ: K62, ĐH Dƣợc HN Lấy ngày: Tháng 11/2011 đến tháng 3/2012 Mang đến: Bộ môn Thực Vật, ĐH Dƣợc Hà Nội Gồm có: mẫu có thân, Yêu cầu: Giám định tên khoa học Kết giám định: Căn vào tài liệu có Trường đại học Dược đặc điểm phận xác định mẫu có: - Tên khoa học mẫu: Berberis sp1.; Berberis sp3.; Berberis sp4 - Họ: Berberidaceae - Tên thƣờng gọi: Hoàng liên gai Tiêu mẫu khơ lồi phân tích đƣợc lƣu tại: Phòng tiêu Bộ mơn Thực vật Trƣờng đại học Dƣợc Hà nội (HNIP), Mã tiêu (Lần lƣợt là: HNIP/17813/12 ; HNIP/17814/12 ; HNIP/17815/12) Tài liệu tham khảo: Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, Nxb Trẻ, Thành phố Hồ Chí Minh, Quyển 1, tr 326 Fl Reipubl Popularis, vol 29, pp 50–343 Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2012 Ngƣời giám định TS Nguyễn Quốc Huy TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI BỘ MƠN THỰC VẬT PHỊNG TIÊU BẢN CÂY THUỐC (HNIP) *** GIẤY CHỨNG NHẬN MÃ SỐ TIÊU BẢN Tên mẫu Tên khoa học: (Theo danh sách kèm theo) Tên thường dùng: (Theo danh sách kèm theo) Tên địa phương: (Theo danh sách kèm theo) Nguồn gốc: (Theo danh sách kèm theo) Ngày thu mẫu: Tháng 11/2011 đến 03/2012 Ngày nộp mẫu: 15/05/2012 Ngƣời thu mẫu: Nguyễn Thị Thu Hằng Cơ quan: K62, ĐH Dƣợc HN Ngƣời nộp mẫu: Nguyễn Thị Thu Hằng Cơ quan: K62, ĐH Dƣợc HN Số hiệu phòng tiêu bản: (Theo danh sách kèm theo) Ngƣời giám định tên khoa học: TS Nguyễn Quốc Huy Số lƣợng mẫu nộp: (Theo danh sách kèm theo) Ngƣời nộp mẫu Ngƣời nhận mẫu Nguyễn Thị Thu Hằng TS Nguyễn Quốc Huy DANH MỤC KÈM THEO GIẤY CHỨNG NHẬN MÃ SỐ TIÊU BẢN Stt Tên KH Berberis sp1 Berberis sp3 Tên thường dùng Nơi lấy mẫu Hoàng liên gai, Núi Phan-xi-păng, Sapa, Lào Hoàng liên gai Cai Hoàng liên gai, Số lượng mẫu Mã số tiêu nộp Tên mẫu HNIP/17813/12 BE1 Tả Phìn, Sapa, Lào Cai HNIP/17814/12 BE3 Hoàng liên gai, Trạm nghiên cứu trồng HNIP/17815/12 BE4 Hoàng liên gai thuốc Sapa, Sapa, Lào Cai Hoàng liên gai Berberis sp4 PHỤ LỤC 2: HÌNH ẢNH SẮC KÝ TRONG ĐỊNH LƢỢNG BERBERIN BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPTLC Ở CÁC BƢỚC SĨNG Bƣớc sóng 254nm Bƣớc sóng 366nm Ber 1, Ber 2, Ber 3, Ber 4, Ber : berberin chuẩn nồng độ 0,01%; 0,02%; 0,03%; 0,04%; 0,05% BE1, BE3, BE4 : thân mẫu BE1, BE3, BE4 RBE3: rễ mẫu BE3 PHỤ LỤC 3: PIC CƢỜNG ĐỘ MÀU CÁC VẾT SẮC KÝ Dung dịch berberin chuẩn 0,01% Dung dịch berberin chuẩn 0,04% Thân BE3 Dung dịch berberin chuẩn 0,02% Dung dịch berberin chuẩn 0,05% Thân BE4 Dung dịch berberin chuẩn 0,03% Thân BE1 Rễ BE3