Nghiên cứu đặc điểm thực vật, tính đa dạng di truyền, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của dây hoàng liên (arcangelisia flava (l ) merr )

MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ 1.1.1 Đặc điểm chung thuộc họ Tiết dê 1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Arcangelisia Beccari 1.1.3 Đặc điểm thực vật loài Arcangelisia flava (L.) Merr 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 1.3 TÁC DỤNG DƢỢC LÝ VÀ CÔNG DỤNG 1.3.1 Tác dụng dƣợc lý Arcangelisia flava (L.) Merr 1.3.2 Tác dụng dƣợc lý berberin 1.3.3 Công dụng 1.4 TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI DỰA TRÊN CHỈ THỊ PHÂN TỬ ADN 1.4.1 Thành phần cấu trúc ADN 1.4.2 Quá trình chép ADN 10 1.4.3 Các loại thị ADN 10 1.4.4 Chỉ thị RAPD kỹ thuật PCR 11 1.5 TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP THỬ TÁC DỤNG HẠ ĐƢỜNG HUYẾT IN VITRO THÔNG QUA MÔ HÌNH HOẠT HÓA AMPK 13 1.5.1 Vài nét bệnh đái tháo đƣờng 13 1.5.2 Vai trò AMPK đái tháo đƣờng 13 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 15 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 15 2.1.2 Dung môi, hóa chất 16 2.1.3 Máy móc, thiết bị 18 2.1.4 Tế bào động vật thí nghiệm 19 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.2.1 Nghiên cứu thực vật 19 2.2.1.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái 19 2.2.1.2 Nghiên cứu đặc điểm vi học 20 2.2.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền 20 2.2.2.1 Tách chiết ADN tổng số 20 2.2.2.2 Khuếch đại ADN PCR sử dụng thị RAPD 21 2.2.2.3 Phương pháp điện di gel agarose 22 2.2.2.4 Phương pháp phân tích số liệu 23 2.2.3 Nghiên cứu thành phần hóa học 23 2.2.3.1 Định tính nhóm chất hóa học mẫu nghiên cứu 23 2.2.3.2 Định tính thành phần berberin, palmatin dịch chiết alcaloid mẫu nghiên cứu sắc ký lớp mỏng 24 2.2.3.4 Định lượng berberin HPLC 26 2.2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu tác dụng sinh học 29 2.2.4.1 Thử độc tính cấp chuột nhắt trắng 29 2.2.4.2 Thử tác dụng hạ đường huyết in vitro mô hình hoạt hóa AMPK 30 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 31 3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật đa dạng di truyền Dây hoàng liên 31 3.1.1 Đặc điểm thực vật Dây hoàng liên 31 3.1.1.1 Đặc điểm hình thái 31 3.1.1.2 Đặc điểm cấu tạo giải phẫu 34 3.1.1.3 Đặc điểm vi học bột dược liệu 35 3.1.2 Đa dạng di truyền Dây hoàng liên 37 3.1.2.1 Kết tách chiết AND tổng số 37 3.1.2.2 Kết phân tích đa hình ADN thị RAPD 38 3.1.2.3 Xác định hệ số tương đồng di truyền quan hệ di truyền 44 3.2 Nghiên cứu thành phần hoá học Dây hoàng liên 45 3.2.1 Định tính thành phần hoá học Dây hoàng liên 45 3.2.1.1 Định tính phản ứng hoá học 45 3.2.1.2 Định tính berberin palmatin Dây hoàng liên sắc ký lớp mỏng 48 3.2.1.3 Xây dựng phân loại quan hệ gần gũi mẫu AR1 – AR8 dựa hình ảnh sắc ký đồ dịch chiết alcaloid toàn phần 49 3.2.2 Định lƣợng thành phần berberin mẫu Dây hoàng liên 50 3.2.2.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 50 3.2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích 50 3.2.2.3 Định lượng berberin mẫu 56 3.3 Nghiên cứu tác dụng sinh học Dây hoàng liên 57 3.3.1 Tác dụng hạ đƣờng huyết in vitro thông qua mô hình hoạt hoá AMPK Dây hoàng liên 57 3.3.2 Thử độc tính cấp Dây hoàng liên 58 CHƢƠNG BÀN LUẬN 60 4.1 Về đặc điểm thực vật đa dạng di truyền 60 4.1.1 Về đặc điểm hình thái 60 4.1.2 Về đa dạng di truyền 60 4.2 Về thành phần hoá học 61 4.2.1 Về thành phần alcaloid có mẫu nghiên cứu 61 4.2.2 Về hàm lƣợng berberin Dây hoàng liên 63 4.3 Về tác dụng sinh học 63 4.3.1 Tác dụng hoạt hoá AMPK mẫu Dây hoàng liên 63 4.3.2 Độc tính cấp 63 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu A Diễn giải Adenin ACC Acetyl Coenzym A Carboxylase ADN Acid DeoxyriboNucleic AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism AMPK Adenosin monophosphat – activated protein kinase AMP Adenosin Monophosphat ATP Adenosin Triphosphat bp Base pair Cr Circularized RNA CTAB CetylTrimethylAmmonium Bromid dATP DeoxyAdenosin TriPhosphat DĐVN Dƣợc điển Việt Nam ĐTĐ Đái tháo đƣờng dTTP DeoxyThymidin TriPhosphat dGTP DeoxyGuanosin TriPhosphat dCTP DeoxyCytidin TriPhosphat DD Dung dịch DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO dNTPs DPPH DiMethyl SulfOxid Nucleosid triphosphat 2,2-DiPhenyl-1-PicrylHydrazyl EC50 Effective concentration 50% EDTA Ethylen Diamin TetraAcetat EtBr Ethidium Bromide EtOH Ethanol FBS Fetal Bovine Serum G Guanin HeLa Tế bào ung thƣ cổ tử cung HPLC High-Performance Liquid Chromatographic HPTLC HRP IC50 High-Performance Thin Layer Chromatographic enzym HorseRadish Peroxidase Inhibitory Concentration 50% IPNI International Plant Names Index kDa kiloDaltons LC50 Lethal Concentration 50% MCF-7 MRC5 ppm Michigan Cancer Foundation-7 Medical Research Council cell strain parts per million PCR Polymerase chain reaction PTP1B Protein Tyrosine Phosphatase 1B RAPD Random Amplified Polymorphic ADN RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RNA Ribonucleic acid RNase Enzym Ribonuclease RSD Relative Standard Deviation SDS Sodium Dodecyl Sulfat SCARs Sequence Characterized Amplified Region STT Số thứ tự T Thymine TAE Tris - Acetate - EDTA TE Tris - EDTA TT Thuốc thử TLC Thin Layer Chromatographic UV Ultraviolet DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 2.1 Danh mục mẫu nghiên cứu 15 Bảng 2.2 Các hóa chất dung môi sử dụng HPLC 16 Bảng 2.3 Danh sách mồi RAPD 16 Bảng 2.4 Đặc điểm hình thái mô tả mẫu nghiên cứu 19 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR-RAPD 21 Bảng 2.6 Chu trình chạy PCR-RAPD 22 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Các đặc điểm phân biệt hình thái mẫu nghiên cứu Thống kê số băng ADN thu đƣợc mẫu loài Dây hoàng liên với 26 mồi RAPD đa hình Bảng tóm tắt thống kê phân tích đa hình PCR-RAPD mẫu giống loài Dây hoàng liên Số băng ADN thu đƣợc mẫu giống thuộc loài Dây hoàng liên với mồi OPN6 Số băng ADN thu đƣợc mẫu giống loài Dây hoàng liên với mồi OPF13 Số băng ADN thu đƣợc mẫu giống loài Dây hoàng liên với mồi S208 Hệ số tƣơng đồng di truyền mẫu loài Dây hoàng liên 33 38 39 40 42 43 44 Bảng 3.8 Thành phần hoá học Dây hoàng liên 45 Bảng 3.9 Kết đánh giá độ phù hợp hệ thống sắc ký 51 Bảng 3.10 Bảng 3.11 Kết khảo sát tính tuyến tính nồng độ diện tích pic berberin 53 Kết đánh giá độ lặp lại phƣơng pháp (mẫu 54 AR1) Bảng 3.12 Bảng 3.13 Kết khảo sát độ phƣơng pháp Kết hàm lƣợng berberin mẫu Dây hoàng liên 55 56 Bảng 3.14 Số lần tăng mức độ biểu p-AMPK so với lô chứng 57 Bảng 3.15 Số chuột chết lô vòng 72 58 Bảng 3.16 Mô tả tình trạng chuột lô vòng ngày 59 DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1 Họ Tiết dê (Menispermaceae Juss.,) Hình 1.2 Arcangelisia flava (L.) Merr Hình 1.3 Hình 1.4 Công thức hóa học alcaloid Arcangelisia flava (L.) Merr Công thức hóa học furanoditerpen đƣợc phân lập từ Arcangelisia flava (L.) Merr 5 Hình 3.1 Các đặc điểm hình thái Dây hoàng liên 32 Hình 3.2 Hình dạng phiến mẫu loài Dây hoàng liên 33 Hình 3.3 Đặc điểm vi phẫu thân (A) (B) mẫu AR1 35 Hình 3.4 Đặc điểm bột thân Dây hoàng liên 36 Hình 3.5 Đặc điểm bột Dây hoàng liên 37 Hình 3.6 Hình 3.7 Hình 3.8 Hình 3.9 Hình 3.10 Hình 3.11 Hình 3.12 Ảnh điện di ADN tổng số mẫu giống loài Dây hoàng liên Kết điện di sản phẩm RAPD-PCR mẫu Dây hoàng liên với mồi OPN6 (M: marker 1kb) Kết điện di sản phẩm RAPD-PCR mẫu giống nghiên cứu với mồi OPF13 (M: marker 1kb) Kết điện di sản phẩm RAPD-PCR mẫu giống nghiên cứu với mồi S208 (M: marker 1kb) Sơ đồ hình quan hệ di truyền mẫu loài Dây hoàng liên Sắc ký đồ alcaloid toàn phần thân mẫu AR7 bƣớc sóng 366nm Sắc ký đồ dịch chiết alcaloid toàn phần mẫu loài Dây hoàng liên (366 nm) 38 40 41 43 44 48 49 Hình 3.13 Hình 3.14 Hình 3.15 Cây phân loại mẫu Dây hoàng liên dựa vào thành phần hoá học sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng Sắc ký đồ mẫu trắng (dung môi pha mẫu) (A), mẫu chuẩn berberin (B), mẫu thử AR3 (C) Đồ thị biểu diễn phụ thuộc nồng độ (µg/ml) diện tích pic (mAU.s) berberin Hình 3.16 Hình ảnh mức độ biểu p-AMPK β-actin Hình 3.17 Hình 4.1 Số lần tăng biểu p-AMPK lô ủ với mẫu thử so với lô chứng Cây phân loại mẫu nghiên cứu 50 52 53 57 58 62 Phụ lục Phiếu giám định tên khoa học Chứng nhận mã số tiêu mẫu AR1-AR8 ... từ yêu cầu thực tế trên, đề tài Nghiên cứu đặc điểm thực vật, tính đa dạng di truyền, thành phần hóa học số tác dụng sinh học Dây hoàng liên (Arcangelisia flava (L.) Merr.) đƣợc thực với ba... 31 3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật đa dạng di truyền Dây hoàng liên 31 3.1.1 Đặc điểm thực vật Dây hoàng liên 31 3.1.1.1 Đặc điểm hình thái 31 3.1.1.2 Đặc điểm cấu... hệ số tương đồng di truyền quan hệ di truyền 44 3.2 Nghiên cứu thành phần hoá học Dây hoàng liên 45 3.2.1 Định tính thành phần hoá học Dây hoàng liên 45 3.2.1.1 Định tính phản ứng hoá học