Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của rong câu chỉ ( gracilaria tenuistipitata (zang et xia) gracilariaceae) ở hải phòng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH THỊ QUYÊN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA RONG CÂU CHỈ (Gracilaria tenuistipitata (Zhang et Xia) - Gracilariaceae) Ở HẢI PHÒNG LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH THỊ QUYÊN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA RONG CÂU CHỈ (Gracilaria tenuistipitata (Zhang et Xia) - Gracilariaceae) Ở HẢI PHÒNG LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 60720406 Người hướng dẫn khoa học: Ts BÙI HỒNG CƯỜNG Ts ĐÀM ĐỨC TIẾN HÀ NỘI 2016 LỜI CẢM ƠN Với kính trọng lòng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới hai người Thầy đáng kính TS Bùi Hồng Cường TS Đàm Đức Tiến – người trực tiếp hướng dẫn, bảo truyền đạt kinh nghiệm quý báu động viên, hỗ trợ mặt từ bước hoàn thiện luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Lê Tất Thành, ThS Trần Quốc Toàn anh chị cán Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam Tôi xin chân thành cảm ơn TS Phạm Thị Nguyệt Hằng anh chị cán Khoa Dược lý Sinh hóa - Viện Dược liệu Đã nhiệt tình giúp đỡ thời gian làm thực nghiệm nghiên cứu đề tài Tôi xin trân trọng cảm ơn toàn thể Thầy Cô giáo anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược học cổ truyền, Trường đại học Dược Hà Nội hỗ trợ kịp thời tạo điều kiện cho trình học tập, nghiên cứu môn Nhân dịp xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu toàn thể Thầy Cô giáo Trường đại học Dược Hà Nội dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập trường Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình bạn yêu quý động viên, khích lệ nhắc nhở, sát cánh bên tôi, động lực lớn giúp vượt qua khó khăn Do thời gian làm thực nghiệm kiến thức thân có hạn, luận văn có nhiều thiếu sót Tôi mong nhận góp ý thầy cô, bạn bè để khóa luận hoàn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, Ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Đinh Thị Quyên MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Gracilaria tenuistipitata hệ thống phân loại 1.2 Đặc điểm thực vật 1.3 Phân bố Sinh thái 1.4 Thành phần hóa học 1.5 Tác dụng sinh học 1.5.1 Độc tính 1.5.2 Tác dụng chống oxy hóa bảo vệ gan 1.5.3 Tác dụng chống viêm 11 1.5.4 Một số tác dụng sinh học khác 11 1.6 Công dụng theo dân gian, y học cổ truyền rong Câu 11 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Đối tượng nghiên cứu 13 2.2 Phương tiện nghiên cứu, động vật thí nghiệm 14 2.2.1 Hóa chất, dung môi 14 2.2.2 Máy thiết bị 14 2.2.3 Động vật thí nghiệm 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 16 2.3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 16 2.3.3 Nghiên cứu tác dụng sinh học 21 2.4 Phương pháp xử lý số liệu đánh giá kết 24 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25 3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 25 3.1.1 Đặc điểm hình thái 25 3.1.2 Đặc điểm giải phẫu 26 3.1.3 Đặc điểm sinh sản 27 3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 30 3.2.1 Định tính nhóm chất rong Câu Chỉ phản ứng hóa học 30 3.2.2 Định lượng số nhóm chất có rong Câu Chỉ 31 3.2.3 Phân lập chất rong Câu Chỉ 32 3.3 Nghiên cứu số tác dụng sinh học 39 3.3.1 Thử tác dụng chống oxy hóa in vitro 39 3.3.2 Thử tác dụng chống oxy hóa in vivo 40 CHƯƠNG BÀN LUẬN 44 4.1 Về thực vật 44 4.2 Về thành phần hóa học 45 4.2.1 Định tính 45 4.2.3 Định lượng 45 4.2.2 Phân lập chất 46 4.3 Về tác dụng sinh học 47 4.3.1 Tác dụng chống oxy hóa in vitro 47 4.3.2 Tác dụng chống oxy hóa in vivo 47 KẾT LUẬN 49 Về thực vật 49 Về thành phần hóa học 49 Về tác dụng sinh học 49 KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ALT Alanin amino transferase AST Aspartat amino transferase BHA Butyled hydroxylanisol CC50 Cytotoxic concentration DMSO Dimethyl sulfoxid DPPH 1,1 – diphenyl – picrylhydazyl EC50 Nồng độ đạt hiệu 50% EtOAc, Ethyl acetat IC50 Nồng độ ức chế 50% Kgtt Kilogram thể trọng LSP Lipipolysaccharid MDA Malonyl dialdehyd MeOH Methanol RCCh Rong Câu Chỉ Rf Retension factor SD Standard deviation (độ lệch chuẩn) SKLM Sắc ký lớp mỏng TT Thuốc thử TLTK Tài liệu tham khảo UV Ultra violet (tia cực tím) δ Độ dịch chuyển hóa học (Đơn vị tính học ppm) DANH MỤC CÁC BẢNG TT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Gracilaria Việt Bảng 1.2 Tác dụng dọn gốc oxy hóa dịch chiết số loài rong Câu Bảng 3.1 Kết định tính nhóm chất phản ứng hóa học 30 Bảng 3.2 Hàm lượng polysaccharid rong Câu Chỉ 31 Bảng 3.3 Hàm lượng lipid rong Câu Chỉ 32 Bảng 3.4 Thành phần acid béo rong Câu Chỉ 32 Bảng 3.5 Phổ 1H - 13C - NMR hợp chất RC1 35 Bảng 3.6 Phổ 1H- 13C-NMR hợp chất RC2 37 Bảng 3.7 Tỉ lệ dọn gốc DPPH cắn dịch chiết rong Câu Chỉ 39 10 Bảng 3.8 Ảnh hưởng cắn dịch chiết methanol RCCh lên hoạt độ 40 ALT huyết chuột bị tổn thương gây paracetamol 11 Bảng 3.9 Ảnh hưởng cắn dịch chiết methanol RCCh lên hoạt độ 41 AST huyết chuột bị tổn thương gây paracetamol 12 Bảng 3.10 Ảnh hưởng cắn dịch chiết methanol RCCh lên hàm lượng MDA dịch đồng thể gan 43 DANH MỤC CÁC HÌNH TT Tên Hình Trang Hình 2.1 Hình ảnh thu mẫu rong Câu Chỉ 13 Hình 2.2 Nguyên tác định lượng MDA dịch đồng thể gan 23 Hình 3.1 Toàn thân rong Câu Chỉ 25 Hình 3.2 Mặt cắt ngang thân (10x) 26 Hình 3.3 Mặt cắt ngang thân (40x) 26 Hình 3.4 Mặt cắt dọc qua túi tứ bào tử 27 Hình 3.5 Nhánh rong Câu mang tảo 27 Hình 3.6 Mặt cắt dọc qua tảo 27 Hình 3.7 Sinh sản dinh dưỡng rong Câu (40x) 28 10 Hình 3.8 Hình ảnh bào tử rong Câu (40x) 28 11 Hình 3.9 Chu trình sống rong Câu Chỉ 29 12 Hình 3.10 Cấu trúc hóa học hợp chất RC1 (cholesterol) 36 14 Hình 3.11 Cấu trúc hóa học hợp chất RC2 39 15 Hình 3.12 Đường chuẩn hàm lượng MDA dịch đồng thể gan 42 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm vùng nhiệt đới gió mùa với bờ biển dài 3200km Do trải dài nhiều vĩ độ nên có đa dạng loại hình đáy khu hệ (các kiểu thủy vực đầm, phá, cửa sông, vũng vịnh loại đáy khác nên đáy cát, sỏi, đá, san hô chết) Đây điều kiện thuận lợi cho tồn tại, phát triển đa dạng loài rong biển Rong Câu Chỉ Gracialria tenuistipitata Zhang et Xia, họ rong Câu Gracilaria (Gracilariales, Rhodophyta) có tổng trữ lượng lớn, sử dụng làm nguyên liệu chế biến agar - agar, ethanol Việt Nam nhiều nước giới mang lại giá trị kinh tế cao Trong lĩnh vực Y - dược, agar - agar dùng làm môi trường nuôi cấy vi khuẩn, chế thuốc nhuận tràng, làm vỏ bọc thuốc, phối liệu chế thuốc viên, thuốc cao, làm khuôn mắt giả, thuốc đông máu, khâu phẫu thuật [6] Ngoài ra, rong Câu Chỉ dùng làm nộm, nấu thạch giải khát, làm bánh tương đối phổ biến dân gian nước ta số nước Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Brazil [6], [17] Ở Việt Nam, rong Câu Chỉ mọc phổ biển bãi triều trồng với diện tích lớn hệ thống đầm, phá tỉnh ven biển trải dài từ Bắc vào Nam Hải Phòng số địa phương có diện tích trồng khai thác rong Câu Chỉ lâu đời lớn nước Nước ta nghiên cứu rong Câu từ năm 1945, nhiên nghiên cứu tập trung vào đánh giá đa dạng loài, nguồn lợi, điều kiện nuôi trồng, hay tối ưu hóa quy trình chế biến agar mà chưa sâu vào đánh giá tác dụng sinh học rong Câu Gần đây, nhiều công trình nghiên cứu công bố cho thấy rong Câu chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học cao Chan cộng công bố, sản phẩm thủy phân từ polysaccharid thu từ rong Câu agaro – oligosaccharid có tác dụng chống oxy hóa bảo vệ gan mô hình in vitro in vivo [26] Rong Câu Chỉ thu Trung Quốc có tác dụng làm hạ men gan mô hình chuột bị gây tổn thương gan CCl4 [59] Với mục đích tìm nguồn nguyên liệu ứng dụng ngành dược, tiến hành sàng lọc tác dụng chống oxy hóa in vitro, cho thấy rong Câu Chỉ có tiềm có tác dụng chống oxy hóa Vì vậy, tiến hành đề tài: « Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học số tác dụng sinh học rong Câu Chỉ (Gracilaria tenuistipitata (Zhang et Xia) – Gracilariaceae) Hải Phòng » Đề tài thực với mục tiêu: Nghiên cứu đặc điểm hình thái thực vật, giám định tên khoa học loài rong Câu Chỉ Định tính, định lượng số nhóm chất rong Câu Chỉ Phân lập, xác định cấu trúc 1-2 chất từ rong Câu Chỉ Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro, tác dụng chống oxy hóa bảo vệ gan cắn dịch chiết rong Câu Chỉ PHỤ LỤC 5.2 Phổ 13C RC2 PHỤ LỤC 5.3 Phổ HMBC HSQC RC2 PHỤ LỤC 6: Phiếu kết thử nghiệm tính chống oxy hóa in vitro PHỤ LỤC 7: số liệu thực nghiệm Lô 1: Chứng sinh lý TT m chuột m gan ALT AST 26 1,076 80,8 158 24 0,878 66 166,6 26,3 1,297 76,8 180,8 28,4 1,578 88 195,2 27,2 1,388 68,4 158,4 23,3 1,209 68,4 169,4 25,3 1,332 92,6 188 23,6 1,211 88 176,4 24,3 1,300 75 158 X 25,4 1,2521 78,2 172,3 SD 0,58 0,0656 3,25 4,57 0,12534 0,000296 7,39E-05 P1-2 Lô 2: Chứng bệnh lý TT m chuột m gan ALT AST 11 24,5 1,244 1562,4 2876,4 13 25,3 1,717 6696 3434,4 14 22,6 1,148 5064,3 9792 15 28,9 1,481 6120 13357,8 17 25,3 1,522 13590 12780 18 24,9 1,438 15732 10330,2 19 29,5 2,064 14850 15843,6 20 26,6 1,406 11160 16457,4 21 24,9 1,598 4315,5 7248,6 10 22 25,9 1,340 14184 13921,2 X 25,84 1,4958 9327,42 10604,16 SD 0,65 0,08187 1624,24 1520,78 Lô 3: Rong Câu liều 600 mg /kgtt TT m chuột m gan ALT AST 40 22,6 1,229 5342,0 6319,4 41 25,8 1,175 6578,6 7778,4 42 23,1 1,285 2232,0 2485,8 43 26,2 1,614 5051,7 5241,8 45 25,5 1,118 3504,9 4662,4 46 25,7 1,218 1540,4 1748,8 48 30,2 1,325 1379,8 1581,4 49 24,2 1,284 1628,1 1710,0 50 20,9 1,322 5035,5 11113,2 10 51 22,1 1,272 4667,4 5711,4 X 24,6 1,2842 3696,0 4835,3 SD 0,84 0,0420 596,86 981,16 P3-2 0,269942 0,004403 0,0051 0,062372 0,082087 P3-4 Lô 4: Rong Câu liều 800 mg/kgtt TT m chuột m gan ALT AST 25 25 1277 13320,0 11826,0 26 27,3 1639 5394,6 5029,2 27 23,9 1267 9003,6 15298,2 28 24,8 1374 6221,7 9090,0 29 26,4 1538 7119,0 9144,0 30 26 1066 4842,0 12528,0 32 24,7 1746 9324,0 7650,0 34 25,6 1498 5411,7 7218,0 35 21,9 1036 532,8 860,4 10 36 22,6 1234 1872,0 1908,0 X 24,82 1367,5 6304,14 8055,18 SD 0,53 74,54 1169,11 1447,29 P4-2 0,238458 0,261668 0,14822 0,240378 Lô 5: Chứng dương TT m chuột m gan ALT AST 55 25,8 1,742 6734,7 4091,4 57 25,7 1,607 6480,0 8250,0 58 25,9 1,375 6631,2 10500,0 59 26 1,328 1173,6 991,8 60 25,1 1,436 6192,0 4068,0 61 25 1,511 7560,0 10844,0 63 24,9 1,258 567,9 8646,0 64 24,2 1,471 2277,9 4632,0 65 26,3 1,486 2610,0 10544,0 10 66 30,5 1,368 7650,0 2574,0 X 26,0 1,4267 4571,4 6783,3 SD 0,58 0,03345 905,55 1190,21 P5-2 0,027808 0,047122 P5-3 0,320277 0,112875 Dd chuẩn: 1,1,3,3- tetra ethoxypropan ng µl 460 3000 gốc C (ng/ml) D ng co 0 0 c1 0,5 0,1095 0,1506 0,076667 c2 0,2190 0,1902 0,153333 c3 0,4381 0,4536 0,306667 c4 0,8762 0,8185 0,613333 Lô 1: Sinh lý X Lô 2: Bệnh lý DMDA MDA ng pro gan (mg/10 0g gan) 549 412,0 36,8 335433,5 927 695,6 36,40 573246,1 740 555,3 38,3 434812,8 903 677,6 34,42 590551,5 672 504,3 36,7 412229,9 748 561,3 31,05 542378,5 740 555,3 37,7 441870,5 893 670,1 35,16 571819,1 681 511,0 35,9 427028,1 681 511,0 32,07 477975,9 568 426,2 36,4 351276,2 1099 824,7 31,05 796895,8 662 496,8 37,8 394248,2 791 593,6 48,37 368156,8 546 409,7 36,6 335824,8 629 472,0 38,68 366082,9 686 514,8 34,6 446325,7 776 582,3 38,75 450784,9 494 370,7 36,48 304864,6 794,1 595,9 36 504275,6 649 487,2 SD MDA/1g pro DMDA MDA (ng) pro gan (mg/100g gan) MDA/ 1g pro 36,8 397672,2 0,7607 15200,9 p1-2 45311,8 0,0475 Lô 3: Rong Câu liều 600 mg/kgtt Lô 4: Rong Câu liều 800 mg/kgtt DMDA MDA (ng) pro gan (mg/100g gan) MDA/ 1g pro DMDA MDA (ng) pro gan (mg/100 g gan) MDA/ 1g pro 932 699,4 35,52 590627,5 975 731,6 32,95 666042,1 958 718,9 35,74 603364,6 865 649,1 33,61 579286,1 720 540,3 33,25 487500,6 691 518,5 30,17 515675,7 771 578,5 33,54 517463,5 688 516,3 34,72 446136,5 X 750 562,8 35,30 478252,7 532 399,2 31,19 383937,1 790 592,8 35,16 505863,5 474 355,7 30,31 352017,4 548 411,2 33,69 366189,3 649 487,0 33,47 436535,6 1321 991,3 111,56 266565,9 1165 874,2 70,39 372607,8 499 374,4 32,66 343935,6 622 466,7 37,50 373343,7 809,9 607,7 43 462195,9 740,1 555,4 37 458398,0 0,464187 37961,4 0,845571 35958,0 SD p 0,4863 0,4390 (p3-2) (p4-2) Lô 5: Chứng dương X SD P 5-2 D- MDA MDA (ng) pro gan (mg/100g gan) MDA/ 1g pro 703 527,5 32,5 486734,6 623 467,5 33,2 422755,2 659 494,5 32,8 452186,8 703 527,5 40,37 392042,6 572 429,2 40,44 318407,1 620 465,2 41,10 339580,7 565 424,0 36,70 346590,5 735 551,5 39,12 422961,8 622 466,7 36,18 386974,9 651 488,5 36,99 396177,9 645,3 484,2 37 396441,2 0,733018 16523,7 0,0481