Bài viết tiến hành khảo sát đặc điểm protease trên nhiều đối tượng Bacillus khác nhau làm cơ sở để sử dụng nguồn enzym này rộng rãi và mang lại hiệu quả kinh tế cao.
PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS SP SINH PROTEASE TỪ NƯỚC THẢI NGUYỄN THỊ KIM CƠ*, TRẦN QUỐC DUNG Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế * Email: nguyenthikimcow@dhsphue.edu.vn Tóm tắt: Từ mẫu nước thải, sau gia nhiệt phân lập 47 chủng vi khuẩn khác 16 chủng xác định sơ thuộc chi Bacillus theo khoá phân loại Bergey (1957); kí hiệu từ B1 đến B16 Kết nghiên cứu cho thấy 16 chủng có khả sinh tổng hợp protease ngoại bào thể đường kính vịng thuỷ phân gelatin phương pháp xác định kích thước vịng thủy phân với thuốc thử HgCl2 10% Bốn chủng B6, B8, B9, B14 có đường kính vịng thuỷ phân cao 14,33; 18,33; 16,67 18,67 mm chọn để xác định hoạt độ enzym theo phương pháp Sigma Ở mức pH 7,9 với chất cảm ứng gelatin 1%, sau 24h lên men lỏng 30oC chủng B14 cho thấy hoạt độ cao (175,2 UI/ml), theo sau chủng B6 (130,1 UI/ml) Sau 36 nuôi cấy hoạt độ protease thu cực đại chủng B6 170,2 (UI/ml) chủng B14 200,2 (UI/ml)) Từ khoá: Bacillus sp.; protease; nước thải; hoạt độ enzym MỞ ĐẦU Enzym chất xúc tác sinh học có vai trị quan trọng đời sống người, protease chiếm khoảng 60% giá trị thương mại thị trường enzym giới [1, 5] Ngày nay, protease trở thành enzym có vai trị quan trọng hàng đầu ngành cơng nghiệp ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực thực phẩm, dệt, da, mỹ phẩm, dược phẩm xử lí nước thải…[ 2, 6] Protease phân loại bao gồm exopeptidase (aminopeptidase carboxypeptidase) endopeptidase (serine, cysteine, aspartic, metallico, threonine, glutamic endopeptidase asparagine peptide lyase) dựa vị trí peptide Dựa pH, protease phân loại thành kiềm, trung tính axit [4] Protease kiềm quan trọng thị trường công nghiệp tồn cầu chúng có khả chịu điều kiện pH cao [8, 9] Trong tất nguồn thu nhận protease, vi khuẩn xem nguồn thu nhận protease lý tưởng so với động vật thực vật nấm, đặc biệt Bacillus chi quan trọng nuôi cấy để thu nhận protease tốc độ tăng trưởng nhanh, khả tiết enzym ngoại bào vào mơi trường cao an tồn dễ kiểm soát [8] Mặc dù chế phẩm protease thương mại hoá vào ứng dụng cách rộng rãi, nhiên giới ngày ghi nhận nhiều cơng trình nghiên cứu thu nhận, xác định điều kiện tối ưu cho sinh tổng hợp xác định tính chất chế phẩm thu W Nascimento cộng (2004); I Muhammad cộng Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế ISSN 1859-1612, Số 3(55)/2020: tr.100-108 Ngày nhận bài: 21/10/2019; Hoàn thành phản biện: 28/12/2019; Ngày nhận đăng: 29/12/2019 PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS SP 101 (2010); B.Asha cộng (2014) nghiên cứu ứng dụng protease ngoại bào từ Bacillus sp làm kính áp trịng; B.K.M Lakshmi cộng (2014) thu nhận protease từ Bacillus licheniformis; Gaurav Pant cộng (2015) tiến hành tinh protease từ Bacillus subtilis; N Laili cộng (2017) đánh giá hoạt tính protease thu nhận từ Bacillus sp 140-B phân lập từ mẫu đất trồng dứa; B Asha, M Palaniswamy (2018) tối ưu hoá điều kiện để thu nhận protease cực đại q trình ni cấy Bacillus cereus FT1 phân lập đất Ở Việt Nam, có số nghiên cứu khả sinh protease ngoại bào Bacillus subtilis (Trần Thị Hồng Nhi cộng (2012)) ứng dụng tạo chế phẩm để thuỷ phân phụ phẩm cá tra (Đỗ Thị Bích Thuỷ (2012); thuỷ phân phụ phẩm thức ăn gia cầm (Trần Ngọc Hùng cộng (2013)); nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến thu nhận chế phẩm protease ngoại bào Bacillus amyloliquefaciens (Đỗ Thị Bích Thuỷ, 2012) Tuy nhiên, nghiên cứu nước ta hạn chế quy mô, đối tượng hướng ứng dụng thực tế; cần thiết phải khảo sát đặc điểm protease nhiều đối tượng Bacillus khác làm sở để sử dụng nguồn enzym rộng rãi mang lại hiệu kinh tế cao NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu Các chủng vi khuẩn Bacillus sp phân lập giữ giống từ mẫu nước thải thu bể chứa nước thải chưa qua xử lí mơi trường LB (Luria- Bertani) lỏng rắn có bổ sung 1.5% agar Cơ chất cảm ứng cho sinh tổng hợp protease gelatin (Merck) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phân lập khiết chủng vi khuẩn Bacillus sp Mẫu nước thải thu từ bể chứa nhà máy sản xuất sữa chua thành phố Huế dụng cụ vô trùng bảo quản 4oC trước tiến hành thí nghiệm Nước thải xử lí gia nhiệt 80oC (bằng Wish Bath) vòng 20 phút nhằm loại bỏ tế bào sinh dưỡng chủng vi sinh vật không sinh bào tử Sau gia nhiệt, mẫu nước thải pha lỗng đến 10-6 nước cất vơ trùng dàn 100 l nồng độ môi trường thạch LB tiến hành nuôi cấy điều kiện hiếu khí, nhiệt độ 30oC thời gian từ 24-48 Các khuẩn lạc đơn riêng lẽ khiết môi trường LB rắn Những khuẩn lạc sơ xác định Bacillus sp dựa khả di chuyển, đặc điểm sinh hoá hình thái khuẩn lạc (màu sắc, độ cao, hình dạng, rìa, độ đồng nhất…) qua kính hiển vi soi nổi; khả sinh catalase bao gồm kết nhuộm Gram nhuộm bào tử theo đối chiếu khoá phân loại Bergey (1957) Các chủng vi khuẩn khiết lưu trữ dung dịch glycerol 30% -20oC trì ống mơi trường LB thạch nghiêng cách cấy truyền hai tuần lần 2.2.2 Xác định hoạt tính protease 50 ml mơi trường dịch thể LB có chứa chất cảm ứng gelatin 1% phân phối vào bình tam giác 250 ml hấp vô trùng 121oC 15 phút; sau bổ sung 1% 102 NGUYỄN THỊ KIM CƠ, TRẦN QUỐC DUNG dung dịch chứa vi khuẩn Bacillus sp tăng sinh sau 24 Các chủng vi khuẩn lên men lỏng cách đặt bình tam giác lên máy lắc (Voxter) với tốc độ 200 rpm 30oC vòng 24 Sau 24 nuôi cấy bề sâu, tiến hành thu protease thô ly tâm 14000 rpm 10 phút 4oC Dịch enzym thô bảo quản 4oC sử dụng cho thí nghiệm Khả sinh protease ngoại bào chủng Bacillus xác định theo phương pháp đục lỗ thạch (Ponnuswamy cộng sự, 2013) 100 l enzym protease chủng cho vào lỗ khoan đường kính mm đĩa thạch LB có bổ sung chất gelatin 1% ủ 30oC Hoạt tính protease chủng Bacillus xác định thơng qua đo đường kính vòng phân giải gelatin sau 24 với thuốc thử HgCl2 10% Các chủng vi khuẩn Bacillus có đường kính thuỷ phân lớn chọn lựa để tiến hành xác định hoạt độ protease ngoại bào 2.2.3 Xác định hoạt độ protease Phương pháp dựa thuỷ phân protein protease, tiếp làm ngừng phản ứng dung dịch acid tricloracetic 110 mM (TCA) Định lượng sản phẩm tạo thành phản ứng thuỷ phân phản ứng tạo màu với thuốc thử Folin 0.5 M Sau đó, dựa vào đồ thị chuẩn tyrosin để tính lượng sản phẩm enzym xúc tác tạo nên Đồ thị đường chuẩn tyrosin hoạt độ enzym xác định theo mô tả quốc tế Sigma Mỗi đơn vị hoạt độ protease (UI) lượng enzym tối thiểu điều kiện thí nghiệm (30oC, pH = 7,9) thuỷ phân gelatin (0.65%) phút tạo thành sản phẩm hoà tan TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho độ hấp thụ OD bước sóng 660 nm tương ứng với 1M tyrosin đường chuẩn Hoạt độ protease xác định theo công thức: 𝑇 ∗ 11 𝐻𝑜ạ𝑡 độ 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 (𝑈𝐼 ⁄𝑚𝑙 ) = ∗ 10 ∗ Trong đó: T: số 1M tyrosin tương ứng giải phóng 11: tổng số thể tích phản ứng (ml) 1: thể tích enzym dùng cho phản ứng (ml) 2: thể tích dùng để đo cường độ quang sau phản ứng với thuốc thử Folin (ml) 10: thời gian phản ứng (phút) 2.2.4 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt độ protease Các chủng vi khuẩn Bacillus sp có hoạt độ protease cao lựa chọn tiếp tục nuôi cấy điều kiện môi trường ban đầu chất cảm ứng gelatin, pH 7.9, nhiệt độ 30 20C thay đổi thời gian nuôi cấy từ 12 đến 72 Sau khoảng thời gian 12 giờ, dịch nuôi cấy sử dụng để thu protease thô xác định hoạt độ enzym theo phương pháp Sigma PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS SP 103 2.2.5 Phương pháp xử lí số liệu Mỗi thí nghiệm lặp lại lần để tính giá trị trung bình độ lệch chuẩn xung quanh giá trị trung bình Số liệu phân tích ngơn ngữ lập trình R 3.5.1 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập chủng Bacillus sp có khả sinh tổng hợp protease Từ mẫu nước thải sản xuất, phân lập 47 chủng vi khuẩn khác môi trường LB sau 24-48 nuôi cấy 30oC điều kiện hiếu khí Các chủng khiết mơi trường LB rắn sau tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc kính hiển vi soi nổi, hình thái kích thước tế bào, nhuộm gram nhuộm quan sát nội bào tử kính hiển vi quang học, thử hoạt tính catalase oxidase Sau đối chiếu với khoá phân loại vi khuẩn Bergey (1957) 16 số 47 chủng kết luận sơ thuộc chi Bacillus kí hiệu từ B1 đến B16 (bảng 1) Bảng Đặc điểm chủng Bacillus sp phân lập từ nước thải sản xuất Nhuộm Gram Catalase Oxidase Giữa Giữa Giữa Giữa Giữa Giữa + + + + + + + + + + + + + + + + + + Khả di động + + + + + + 0,3- 0,8 x 1,3- 2,6 Lệch tâm + + + + Que 0,5- 0,9 x 1,3 -2,6 Giữa + + + + B9 Que 0,4- 0,7 x 1,2- 2,2 Lệch tâm + + + + B10 B11 Que Que 0,5- 0,8 x 1,1- 2,1 0,3- 0,9 x 1,2- 2,6 Giữa Giữa + + + + + + + + B12 Que 0,7- 1,1 x 1,9- 3,1 Giữa + + + + B13 Que 0,6- 0,8 x 1,4- 2,6 Giữa + + + + B14 B15 B16 Que Que Que 0,5- 0,8 x 1,5- 2,8 0,4-0,6 x 1,6- 3,0 0,5- 0,7 x 1,3- 2,8 Giữa Giữa Giữa + + + + + + + + + + + + B1 B2 B3 B4 B5 B6 Hình dạng TB Que Que Que Que Que Que 0,5-0,8 x 1,5-2,3 0,9-1,0 x 2,7-3,1 0,2 - 0,5 x 1,2-1,9 0,6 -1,1 x 1,8- 2,7 0,3 – 0,8 x 1,2- 2,1 0,5- 0,9 x 1,4- 2,3 B7 Que B8 Chủng Kích thước TB (m) Vị trí nội bào tử Khuẩn lạc đại đa số chủng hình trịn, số có bờ rìa cưa, phẳng đắp nổi, bề mặt nhẵn, mờ; màu sắc khuẩn lạc trắng đục vàng kem mơi trường thạch dinh dưỡng (hình 1) Tế bào vi khuẩn Bacillus có hình que, kích thước tế bào dao động trung bình từ 0,5-0,9 x 1,4-2,6 m, gram dương, catalase oxidase dương tính Tất 16 chủng phân lập cho thấy khả di động khả hình thành nội bào tử; vị trí bào tử nằm lệch tâm tế bào NGUYỄN THỊ KIM CƠ, TRẦN QUỐC DUNG 104 (b) (a) Hình Đặc điểm hình thái khuẩn lạc (a) tế bào nhìn kính hiển vi quang học x.1000 (b) chủng B6 2.2 Sàng lọc chủng Bacillus sp có khả sinh tổng hợp protease cao Bảng Đường kính vịng thuỷ phân gelatin STT KH chủng B1 B2 B3 B4 10 11 12 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 13 14 B13 B14 15 16 B15 B16 Đường kính (mm) 5,67 1,15 5,33 1,15 12,33 1,53 2,33 0,58 7,33 0,58 14,33 0,58 1,33 1,15 18,33 1,53 16,67 1,15 13,33 1,53 12,33 1,53 10,67 1,15 11,67 1,15 18,67 1,15 13,33 1,15 11,67 1,53 Kết nghiên cứu cho thấy tất 16 chủng vi khuẩn Bacillus phân lập có khả sinh protease ngoại bào thể đường kính vịng thuỷ phân gelatin (1%) đĩa thạch với thuốc thử dung dịch HgCl2 (10%) Ngoại trừ chủng B1, B2, B4, B5 B7 tất chủng cịn lại có đường kính vịng thuỷ phân protein lớn 10 mm (bảng 2); đặc biệt chủng ghi nhận PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS SP 105 có khả sinh enzym protease cao bao gồm B6, B8, B9 B14 với đường kính vịng phân giải 14,33; 18,33; 16,67 18,67 mm (hình 2) chọn để xác định hoạt độ protease thí nghiệm G Pant cộng (2015) ghi nhận đường kính vịng thuỷ phân protein vi khuẩn Bacillus subtilis 22 mm N Laili S Antonius (2017) tiến hành đo vòng phân giải protein chủng Bacillus sp phân lập đất kết luận chủng có vịng thuỷ phân lớn 15 mm (a) (b) (c) (d) (e) Hình Đường kính vịng thuỷ phân gelatin chủng B6 (a), B8 (b), B9(c), B14 (d) đối chứng (e) 2.3 Hoạt độ protease chủng Bacillus sp phân lập Một đơn vị hoạt độ protein (UI) định nghĩa lượng enzym mà phút 30 oC có khả phân giải protein tạo thành sản phẩm hoà tan acid tricloacetic cho phản ứng màu với 1m tyrosine Hoạt độ protein thu từ thực nghiệm tính tốn theo phương trình y = - 0.02265 + 0.53477x có độ tương thích cao giá trị R2 = 0,966 (hình 3) Hình Đồ thị đường chuẩn Tyrosine (m) OD = 660nm Khả sinh tổng hợp chủng vi khuẩn Bacillus sp đánh giá sau 24 lên men lỏng bình tam giác 250 ml với nguồn chất cảm ứng sinh enzym gelatin (1%) Hoạt độ protease thô bốn chủng Bacillus sp thể bảng cho thấy chủng B14 có hoạt độ cao 175,2 (UI/ml), theo sau chủng B6 với hoạt độ 130,1 (UI/ml); hoạt độ hai chủng B8, B9 ghi nhận 98,2 102,5 (UI/ml) So với cơng trình nghiên cứu hoạt độ enzym protease ngoại bào sinh tổng hợp từ vi khuẩn Bacillus cereus kết thấp B Asha cộng (2018) ghi nhận hoạt độ protease sinh tổng hợp từ Bacillus NGUYỄN THỊ KIM CƠ, TRẦN QUỐC DUNG 106 cereus 187 UI/ml với đối tượng C Kotlar (2015) đo hoạt độ cực đại đạt 295 UI/ml So sánh với nghiên cứu nhiều đối tượng vi khuẩn Bacillus khác kết nghiên cứu thu tương đương N Laili cộng (2017) xác định hoạt độ protease Bacillus sp 140-B đạt cực đại 119 UI/ml sau 22 nuôi cấy Nghiên cứu khả sinh tổng hợp protease Bacillus subtilis G Pant cộng (2015) cho thấy chủng đạt hoạt độ điều kiện tối ưu 143,73 (UI/ml) Tuy nhiên hoạt độ enzym phụ thuộc chặt chẽ vào đối tượng vi sinh vật điều kiện môi trường nuôi cấy [2, 4, 5] Bảng Hoạt độ protease chủng Bacillus sp phân lập KH chủng B6 B8 B9 B14 Đường kính vịng thuỷ phân (mm) 14,33 0,58 18,33 1,53 16,67 1,15 18,67 1,15 Hoạt độ protease (UI/ml) 130,1b 98,2c 102,5c 175,2a (Các chữ số khác biểu thị sự sai khác có ý nghĩa, Duncan’s test (P