(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học chống một số nấm gây bệnh cây trồng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Hồng NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC CHỐNG MỘT SỐ NẤM GÂY BỆNH CÂY TRỒNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Hồng NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC CHỐNG MỘT SỐ NẤM GÂY BỆNH CÂY TRỒNG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHẠM ĐỨC NGỌC TS TRẦN VĂN TUẤN HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Phạm Đức Ngọc, Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy trực tiếp hướng dẫn cơng việc thí nghiệm Thầy tận tình hướng dẫn, dạy bảo cho hiểu biết lĩnh vực nghiên cứu ứng dụng tạo điều kiện thuận lợi để tơi tiến hành cơng việc thí nghiệm cách tốt hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn tới TS Trần Văn Tuấn, Trưởng Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, người hướng dẫn thứ hai Thầy dạy dỗ, giúp đỡ, đưa lời khuyên góp ý quan trọng cho tơi suốt q trình học tập để tơi hồn thành luận văn cách tốt Tơi xin chân thành cảm ơn đến thầy cô Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên dạy dỗ, bảo, cho thêm kiến thức vi sinh vật học để tơi hồn thành khóa học Cuối tơi muốn gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, anh chị, bạn bè sát cánh bên tôi, động viên tôi, tiếp thêm cho sức mạnh lúc gặp khó khăn sống, học tập để vững vàng bước đường chọn Do thời gian trình độ cịn hạn chế, nên luận văn không tránh khỏi thiếu sót, tơi mong nhận góp ý thông cảm thầy, cô người Tôi xin chân thành cảm ơn Học viên Nguyễn Thị Hồng DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT A niger Aspegillus niger A flavus Aspegillus flavus bp Base pair DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxyribonucleotide triphosphate F oxysporum Fusarium oxysporum kb Kilo base pair ITS Internal Transcribed Spacer N dimidiatum Neoscytalidium dimidiatum P capsici Phytophthora capsici PCR Polymerase Chain Reaction P digitatum Penicillium digitatum PDA Potato dextrose agar PSM Phytase-screening medium S hydrophilum Sclerotium hydrophilum SDS Sodium dodecyl sulfate MỤC LỤC Nội dung LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU .1 Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan tác nhân gây bệnh trồng .3 1.2 Các vi nấm gây bệnh phổ biến trồng .5 1.2.1 Fusarium oxysporum 1.2.2 Phytophthora capsici 1.2.3 Neoscytalidium dimidiatum 1.2.4 Sclerotium hydrophilum .8 1.2.5 Aspergillus spp 1.2.6 Penicillium digitatum 10 1.2.7 Colletotrichum .11 1.3 Những biện pháp phòng trừ nấm bệnh trồng .12 1.3.1 Biện pháp giới vật lý .12 1.3.2 Biện pháp phịng trừ hóa học .13 1.3.3 Biện pháp đấu tranh sinh học .13 1.3.3.1 Vi sinh vật đối kháng chống nấm gây bệnh trồng .14 1.3.3.2 Tình hình nghiên cứu chế phẩm vi sinh vật phòng chống nấm gây bệnh Việt Nam 21 1.4 Ứng dụng chế phẩm sinh học dạng bột phòng chống nấm gây bệnh .23 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tượng 25 2.2.1 Các chủng vi sinh vật kiểm định: 25 2.2.2 Hóa chất 25 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ 26 2.3 Phương pháp nghiên cứu 26 2.3.1 Phương pháp phân lập tuyển chọn vi sinh vật đối kháng 26 2.3.2 Phương pháp định danh vi sinh vật 29 2.3.2.1 Phân tích đặc điểm hình thái .29 2.3.2.2 Phương pháp sinh học phân tử 29 2.3.3 Phương pháp nghiên cứu xác định hoạt tính sinh học vi sinh vật 32 2.3.4 Quy trình tạo chế phẩm vi sinh vật đối kháng dạng bột .33 2.3.5 Bước đầu thử nghiệm hiệu chế phẩm đồng ruộng 35 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Phân lập sàng lọc chủng vi sinh vật có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trồng 37 3.1.1 Phân lập sàng lọc chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm 37 3.1.2 Phân lập sàng lọc chủng Trichoderma có hoạt tính kháng nấm 39 3.1.3 Phân lập sàng lọc chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm 44 3.2 Phân loại chủng tuyển chọn 47 3.2.1 Phân loại chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm mạnh 47 3.2.2 Phân loại số chủng Trichoderma 50 3.2.3 Quan sát đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn S21 51 3.3 Khả phân giải chất chủng vi sinh vật tuyển chọn 52 3.4 Nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bacillus – Trichoderma - Streptomyces quy mô phịng thí nghiệm 54 3.4.1 Chế phẩm sinh học từ chủng B subtilis N5 54 3.4.1.1 Xác định thông số lên men phù hợp chủng B subtilis N5 54 3.4.1.2 Lựa chọn chất mang phù hợp chủng B subtilis N5 60 3.4.2 Chế phẩm sinh học từ chủng nấm T asperellum Tr.4 .62 3.4.3 Chế phẩm sinh học từ chủng xạ khuẩn S21 64 3.5 Thử nghiệm sơ khả chống bệnh thán thư ớt Colletotrichum ớt chế phẩm 68 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Số lượng vi khuẩn phân lập từ mẫu đất thu 37 Bảng Hoạt tính kháng nhiều nấm chủng vi khuẩn tuyển chọn 38 Bảng Số lượng chủng Trichoderma phân lập từ mẫu đất, vỏ 40 Bảng Khả đối kháng nấm gây bệnh chủng Trichoderma 41 Bảng Khả kháng loại nấm gây bệnh chủng xạ khuẩn tuyển chọn 46 Bảng Hình thái khuẩn lạc, hình dạng vi khuẩn kính hiển quang học(x100) 48 Bảng Kết định danh 11 chủng vi khuẩn chọn lọc 49 Bảng Khả sinh enzyme phân giải chất chủng có hoạt tính kháng nấm mạnh 53 Bảng Ảnh hưởng tỷ lệ giống cấp bổ sung đến chất lượng dịch lên men 59 Bảng 10 Thông số kỹ thuật nhân sinh khối chủng B subtilis N5 59 Bảng 11 Ảnh hưởng chất mang đến mật độ tế bào chủng B subtilis N5 60 Bảng 12 Ảnh hưởng cúa môi trường bán xốp đến khả nhân sinh khối nấm T asperellum Tr.4 62 Bảng 13 Ảnh hưởng loại môi trường nhân nuôi dạng bán xốp đến khả nhân sinh khối xạ khuẩn S21 65 Bảng 14 Khả tồn vi sinh vật chế phẩm theo thời gian 67 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Bệnh đốm nâu long tác nhân gây bệnh N dimidiatum [66] Hình Bệnh thán thư C scovillei gây ớt đặc điểm hình thái bệnh thán thư ớt [44] 12 Hình Tương tác cây-vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng sức khỏe thực vật: Phương thức hoạt động tiềm sử dụng ứng dụng công nghệ sinh học [10] 15 Hình Hình thái T harzianum 18 Hình Sợi nấm Trichoderma kí sinh nấm gây bệnh Rhizoctonia solani 19 Hình Hình thái khuẩn lạc chủng Trichoderma phân lập từ mẫu đất, vỏ 40 Hình Khả đối kháng chủng Tr.4 với nấm gây bệnh trồng 42 Hình Khả đối kháng chủng Tr.2 với loài nấm gây bệnh trồng 43 Hình 10 Khả đối kháng chủng Tr.7 với lồi nấm gây bệnh trồng 43 Hình 11 Khả đối kháng chủng Trichoderma với Collectotrichum gây bệnh thán thư ớt 43 Hình 12 Khuẩn lạc số chủng xạ khuẩn phân lập từ Rừng ngập mặn Vườn Quốc gia Cát Bà 45 Hình 13 Khả kháng nấm chủng xạ khuẩn S7, S19, S20 46 Hình 14 Khả kháng nấm chủng xạ khuẩn S21 47 Hình 15 Phân tích ba chủng LU4.4, N5, DH4.15 sử dụng trình tự16S rRNA 49 Hình 16 Hình thái khuẩn lạc cuống bào tử ba chủng Trichoderma 50 Hình 17 Phân tích hai chủng Trichoderma Tr.2, Tr.4 Tr.7 sử dụng trình tự ITS (A) ADN tổng số chủng Tr.2, Tr.4, Tr.7 (B) Kết PCR vùng ITS chủng Tr.2, Tri4, Tri7 51 Hình 18 Hình thái khuẩn lạc hình thái cuống sinh bào tử chủng S21 môi trường nuôi cấy 30oC, sau ngày tuổi (A), sau ngày tuổi (B) cuống sinh bào tử (C) 52 Hình 19 Hoạt tính phân giải chất chủng tuyển chọn 53 Hình 20 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng phát triển chủng B subtilis (x108) 55 Hình 21 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng phát triển chủng B subtilis N5 56 Hình 22 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng phát triển chủng B subtilis N5 57 Hình 23 Ảnh hưởng tốc độ cánh khuấy đến sinh trưởng phát triển chủng B subtilis N5 58 Hình 24 Mật độ tế bào chủng B subtilis N5 chất mang khác với nồng độ pha loãng 10-5 61 Hình 25 Minh họa quy trình sản xuất chế phẩm Bacillus đối kháng nấm 61 Hình 26 Nấm T asperellum Tr.4 chất khác 63 Hình 27 Mật độ tế bào chủng S21 chất mang khác 65 Hình 28 Chủng xạ khuẩn S21 chất bột ngô (A) Ngày lên men xốp (B) Sau ngày lên men xốp 66 Hình 29 Cây ớt bị bệnh thán thư 69 Hình 30 Cây ớt sau tuần phun chế phẩm 69 MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, bệnh hại trồng gây thiệt hại đáng kể cho sản xuất bảo quản nông sản sau thu hoạch, phải kể đến bệnh vi nấm Fusarium oxysporum, Phytophthora capsici, Sclerotium sp., Neoscytalidium dimidiatum, Penicillium digitatum Aspergillus niger, Aspergillus flavus gây Các tác nhân nấm bệnh gây tổn thất nghiêm trọng đến sản lượng thu hoạch trồng có giá trị kinh tế ớt, tiêu, cà chua Hiện biện pháp phổ biến để diệt loại nấm bệnh sử dụng thuốc hóa học, biện pháp có ưu điểm phổ tác dụng rộng, hiệu nhanh Tuy nhiên, nay, thuốc hóa học ngày bộc lộ nhược điểm có hiệu thấp loại nấm bệnh đất, lạm dụng thuốc hóa học dẫn đến tình trạng nấm bệnh kháng thuốc, đặc biệt gây ô nhiễm môi trường ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người Hiện nay, với tiến công nghệ sinh học việc áp dụng biện pháp kiểm sốt sinh học thơng qua sử dụng phân bón hữu vi sinh chế phẩm sinh học có khả đối kháng nấm bệnh ưu tiên hàng đầu nông nghiệp hữu Sử dụng chế phẩm sinh học thay cho thuốc hóa học bảo vệ thực vật góp phần bảo vệ môi trường nâng cao sức khỏe người chất lượng sản phẩm nông nghiệp Ở Việt Nam, có nhiều nghiên cứu vi sinh vật đối kháng nhằm hạn chế nấm bệnh trồng, nhiên thực tế có nghiên cứu áp dụng để sản xuất chế phẩm, thương mại hóa sử dụng rộng rãi thị trường Trên sở đó, chúng tơi lựa chọn thực đề tài: “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học chống số nấm gây bệnh trồng” Mục tiêu đề tài: Nghiên cứu bước đầu sản xuất chế phẩm sinh học chứa vi sinh vật đối kháng chống số nấm gây bệnh trồng Bệnh thán thư tác nhân gây thiệt hại nghiêm trọng đến sản lượng ớt toàn giới, đặc biệt vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Trong hệ thống mầm bệnh Colletotrichum , lồi Colletotrichum khác liên quan với bệnh thán thư vật chủ Tình trạng phân loại cịn mơ hồ lồi Colletotrichum dẫn đến việc xác định khơng xác gây khó khăn quản lý bệnh Một số Colletotrichum loài phản ứng khác với biện pháp kiểm sốt khác Do đó, việc xác định xác dẫn đến việc kiểm sốt quản lý bệnh hiệu hơn, ví dụ, lựa chọn chế phẩm phịng trừ nấm thích hợp Việc quản lý kiểm soát bệnh thán thư nghiên cứu rộng rãi Các yếu tố mơi trường đóng vai trị phát triển dịch bệnh Mối quan hệ cường độ mưa, thời gian hình dạng trồng phân tán chủng dẫn đến mức độ nghiêm trọng khác bệnh [56] Cho đến nay, phương pháp kiểm soát sinh học bệnh thán thư ớt chưa ý nhiều Các nghiên cứu trước Trichoderma lồi có khả cạnh tranh hiệu diện tích bề mặt, làm giảm khả nhiễm vi nấm gây bệnh thán thư Các lồi Trichoderma áp dụng để kiểm sốt lồi Colletotrichum ớt, dâu tây, có múi với việc giảm bệnh đồng thời Các chủng vi sinh vật có khả kiểm sốt sinh học thử nghiệm cho hiệu chống lại C acutatum bao gồm Bacillus subtilis , Pseudomonas fluorescens [63] Mặc dù có nhiều nghiên cứu quản lý kiểm sốt dịch bệnh bao gồm chương trình nhân giống cho giống kháng bệnh thán thư, tình trạng bệnh thán thư ớt cần phải cải thiện Vẫn nhiều câu hỏi cần trả lời liên quan đến đặc tính lồi Colletotrichum liên quan đến bệnh thán thư; lồi đặc biệt có mặt quốc gia khu vực khác nhau; đa dạng mầm bệnh di truyền loài Colletotrichum tồn giới; q trình lây nhiễm chu kỳ bệnh loài Colletotrichum dẫn đến kiểm soát bệnh hiệu nhân giống trồng kháng bệnh [44] 70 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã phân lập 294 chủng vi khuẩn Lựa chọn chủng N5 có hoạt tính kháng nấm mạnh kháng đồng thời nhiều loại nấm bệnh từ 11 chủng vi khuẩn sàng lọc Phân lập 10 chủng Trichoderma có khả kháng loại nấm bệnh thử nghiệm, chọn chủng có khả kháng mạnh Từ 29 mẫu đất rừng ngập mặn, phân lập 109 chủng xạ khuẩn; có 21 chủng có khả kháng N dimidiataum, chủng có khả kháng 7/8 loại nâm thử nghiệm, chủng S21 có khả kháng loại nấm bệnh Đã phân loại dựa vào trình tự 16S rADN 11 chủng vi khuẩn, 10 chủng thuộc nhóm B subtilis loài an toàn Một chủng thuộc B vietnamienis Ba chủng Trichoderma thuộc T asperellum Đã lựa chọn đươc chủng từ nhóm vi sinh vật có hoạt tính sinh học cao để nghiên cứu tạo chế phẩm B subtilis N5, T asperellum Tr.4, xạ khuẩn S21 Đã nghiên cứu điều kiện lên men dịch thể chất mang thích hợp để sản xuất chế phẩm B subtilis N5 môi trường SX3, nuôi 24 giờ, pH7, nhiệt độ 30°C, tốc độ khuấy 30 vòng/phút, tỷ lệ giống 2%, chất mang cám gạo, đạt mật 5x108CFU/g Lên men xốp chủng nấm T asperellum Tr.4 cám gạo thóc xạ khuẩn S21 bột ngô đạt số lượng 109 CFU/g Bảo quản chế phẩm tháng, chủng đơn đạt mật độ 108 CFU/g Bước đầu thử nghiệm chế phẩm ớt cho thấy có hiệu hạn chế bênh thán thư Collectotrichum gây KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu điều kiện giúp bảo quản mật độ bào tử vi sinh vật chế phẩm tồn thời gian dài 71 Tiếp tục nghiên cứu điều kiện lên men để xác định thời điểm thu sinh khối tối ưu Thử nghiệm hiệu loại VSV đối kháng trồng chậu cách gây nhiễm thực nghiệm loại nấm bệnh khác so sánh với chế phẩm hỗn hợp Thử nghiệm hiệu chế phẩm đồng ruộng loại nấm bệnh khác quy mô lớn với số lần lặp lại thí nghiệm nhiều xác định xác mức độ nhiễm bệnh tỷ lệ nhiễm bệnh 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Hoàng Chiến (2001), ''Nghiên cứu chủng xạ khuẩn Streptomyces V6 sinh chất kháng sinh chống vi khuẩn gây bệnh héo xanh cà chua'', Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Đại học Sư Phạm-Đại học Thái Nguyên Bùi Thị Việt Hà (2006), ''Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam '', Luận án Tiến sỹ, Đại học Khoa học Tự Nhiên Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục Nguyễn Tất Thắng, Đỗ Tấn Dũng (2011), ''Nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn (Raltonia solanacearum Smith) hại khoai tây vùng Hà Nội-Phụ cận biện pháp phịng trừ'', Tạp chí Khoa học Phát triển, 9(5), tr 725-734 Phạm Văn Ty, Đào Thị Lương (2003), ''Khả sinh kháng sinh chống vi khuẩn gây bệnh héo xanh Streptomyces arabicus 112'', Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, tr 145-149 Trịnh Thành Trung (2013), ''Đặc điểm sinh học tiềm ứng dụng chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum sp 1901 phân lập Rừng Quốc gia Hoàng Liên'', VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, 29 (3), Phạm Văn Toàn (2013), ''Thực trạng sử dụng thuốc bảo vệ thực vật số giải pháp giảm thiểu việc sử dụng thuốc không hợp lý sản xuất lúa đồng sơng Cửu Long'', Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 28, tr 47-53 Phạm Văn Toản (2003), ''Khả sử dụng hỗn hợp vi sinh vật làm phân bón chức cho số trồng nông nghiệp, công nghiệp lâm nghiệp'', Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, tr 127-131 Tiếng Anh Ab Majid A H., Zahran Z.,Rahim A H A., Ismail N A.,Rahman W A., Zubairi K S M., Satho T (2015), ''Morphological and molecular characterization of fungus isolated from tropical bed bugs in Northern Peninsular Malaysia, Cimex hemipterus (Hemiptera: Cimicidae)'', Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, (9), 707-713 10 Avis T J., Gravel V., Antoun H., Tweddell R J (2008), ''Multifaceted beneficial effects of rhizosphere microorganisms on plant health and productivity'', Soil Biology and Biochemistry, 40 (7), 1733-1740 11 Bertram R., Schlicht M., Mahr K., Nothaft H., Saier M H., Titgemeyer F (2004), ''In silico and transcriptional analysis of carbohydrate uptake systems of Streptomyces coelicolor A3 (2)'', Journal of bacteriology, 186 (5), 13621373 73 12 Boopathi E., Rao K S (1999), ''A siderophore from Pseudomonas putida type A1: structural and biological characterization'', Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Protein structure and molecular enzymology, 1435 (1), 30-40 13 Calvo H.,Marco P.,Blanco D.,Oria R ,Venturini M (2017), ''Potential of a new strain of Bacillus amyloliquefaciens BUZ-14 as a biocontrol agent of postharvest fruit diseases'', Food microbiology, 63, 101-110 14 Carris L M., Little C R., Stiles C M (2012), ''Introduction to Fungi'', The Plant Health Instructor 15 Cavalcante R S., Lima H L., Pinto G A., Gava C A., Rodrigues S (2008), ''Effect of moisture on Trichoderma conidia production on corn and wheat bran by solid state fermentation'', Food and Bioprocess Technology, (1), 100-104 16 Chamoun R.Aliferis K A., Jabaji S (2015), ''Identification of signatory secondary metabolites during mycoparasitism of Rhizoctonia solani by Stachybotrys elegans'', Frontiers in microbiology, 6, 353 17 Chuang M., Ni H., Yang H., Shu S., Lai S., Jiang Y (2012), ''First report of stem canker disease of Pitaya (Hylocereus undatus and H polyrhizus) Caused by Neoscytalidium dimidiatum in Taiwan'', Plant Disease, 96 (6), 906-906 18 Cornforth D.M., Foster K R (2013), ''Competition sensing: the social side of bacterial stress responses'', Nature Reviews Microbiology, 11 (4), 285 19 Crowley D E (2006), "Microbial siderophores in the plant rhizosphere", Iron nutrition in plants and rhizospheric microorganisms, Springer, pp 169-198 20 Drenth A., Breton F., Flori T., Franqueville A., de Hayun H., Jacquemard Z., SPC Umi S (2001), Practical guide to detection and identification of Phytophthora, Australian Centre for International Agricultural Research, ACIAR 21 El_Komy M H., Saleh A A., Eranthodi A., Molan Y.Y (2015), ''Characterization of novel Trichoderma asperellum isolates to select effective biocontrol agents against tomato Fusarium wilt'', The plant pathology Journal, 31 (1), 50 22 Figueiredo M d V B., Seldin L., de Araujo F F., Mariano R d L R (2010), "Plant growth promoting rhizobacteria: fundamentals and applications", Plant growth and health promoting bacteria, Springer, pp 21-43 23 Gergerich R C a V V D ( 2006), ''Introduction to plant viruses, the invisible foe'', 24 Glick B R (1995), ''The enhancement of plant growth by free-living bacteria'', Canadian Journal of Microbiology, 41 (2), 109-117 25 Harris J L (1986), ''Modified method for fungal slide culture'', Journal of clinical microbiology, 24 (3), 460-461 26 He H., Silo-Suh L A.,Handelsman J., Clardy J (1994), ''Zwittermicin A, an antifungal and plant protection agent from Bacillus cereus'', Tetrahedron letters, 35 (16), 2499-2502 74 27 Hernández-Rodríguez A., Heydrich-Pérez M., Acebo-Guerrero Y., VelazquezDel Valle M G., Hernandez-Lauzardo A N (2008), ''Antagonistic activity of Cuban native rhizobacteria against Fusarium verticillioides (Sacc.) Nirenb in maize (Zea mays L.)'', Applied soil ecology, 39 (2), 180-186 28 Hibbing M E., Fuqua C., Parsek M R., Peterson S B (2010), ''Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle'', Nature Reviews Microbiology, (1), 15 29 Ito Y., Goto T., Oka H., Matsumoto H., Miyazaki Y., Takahashi N., Nakazawa H (2003), ''Simple and rapid determination of thiabendazole, imazalil, and ophenylphenol in citrus fruit using flow-injection electrospray ionization tandem mass spectrometry'', Journal of agricultural and food chemistry, 51 (4), 861-866 30 Jensen P R., Gontang E., Mafnas C., Mincer T J., Fenical W (2005), ''Culturable marine actinomycete diversity from tropical Pacific Ocean sediments'', Environ Microbiol, (7), 1039-48 31 Jeyarajan R., Nakkeeran S (2000), "Exploitation of microorganisms and viruses as biocontrol agents for crop disease management", Biocontrol Potential and its Exploitation in Sustainable Agriculture, Springer, pp 95-116 32 Jiang H., Zhang L., Zhang J.-z., Ojaghian M R., Hyde K D (2016), ''Antagonistic interaction between Trichoderma asperellum and Phytophthora capsici in vitro'', Journal of Zhejiang University-SCIENCE B, 17 (4), 271-281 33 Jones K L (1949), ''Fresh isolates of actinomycetes in which the presence of sporogenous aerial mycelia is a fluctuating characteristic'', Journal of bacteriology, 57 (2), 141 34 Kameda Y., Ouhira S., Matsui K., KANATOMO S., HASE T., ATSUSAKA T (1974), ''Antitumor activity of Bacillus natto V Isolation and characterization of surfactin in the culture medium of Bacillus natto KMD 2311'', Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 22 (4), 938-944 35 Kämpfer P (2006), "The family Streptomycetaceae, part I: taxonomy", The prokaryotes, Springer, pp 538-604 36 Kelman A (1953), ''The bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum'', Technical Bulletin of North Carolina Agricultural Experiment Station, (99), 37.Khandelwal S., Manwar A., Chaudhari B., Chincholkar S (2002), ''Siderophoregenic bradyrhizobia boost yield of soybean'', Applied biochemistry and biotechnology, 102 (1-6), 155-168 38 Kim K Y., Jordan D., McDonald G (1998), ''Enterobacter agglomerans, phosphate solubilizing bacteria, and microbial activity in soil: effect of carbon sources'', Soil Biology and Biochemistry, 30 (8), 995-1003 39 Kotasthane A., Agrawal T., Kushwah R., Rahatkar O V (2015), ''In-vitro antagonism of Trichoderma spp against Sclerotium rolfsii and Rhizoctonia solani and their response towards growth of cucumber, bottle gourd and bitter gourd'', European journal of plant pathology, 141 (3), 523-543 75 40 Kuffner M., Puschenreiter M., Wieshammer G., Gorfer M., Sessitsch A (2008), ''Rhizosphere bacteria affect growth and metal uptake of heavy metal accumulating willows'', Plant and Soil, 304 (1-2), 35-44 41 Lamour K H., Stam R., Jupe J., Huitema E (2012), ''The oomycete broad‐host‐ range pathogen Phytophthora capsici'', Molecular plant pathology, 13 (4), 329-337 42 Marshall K., Alexander M (1960), ''Growth characteristics of fungi and actinomycetes'', Journal of bacteriology, 80 (3), 412 43 Mohd M H., Salleh B., Zakaria L (2013), ''Identification and Molecular Characterizations of Neoscytalidium dimidiatum Causing Stem Canker of Red‐fleshed Dragon Fruit (Hylocereus polyrhizus) in Malaysia'', Journal of Phytopathology, 161 (11-12), 841-849 44 Oo M M., Lim G., Jang H A., Oh S.-K (2017), ''Characterization and pathogenicity of new record of anthracnose on various chili varieties caused by Colletotrichum scovillei in Korea'', Mycobiology, 45 (3), 184-191 45 Palou L (2014), "Penicillium digitatum, Penicillium italicum (Green mold, Blue mold)", Postharvest Decay, Elsevier, pp 45-102 46 Petatán-Sagahón I., Anducho-Reyes M A., Silva-Rojas H V., Arana-Cuenca A., Tellez-Jurado A., Cárdenas-Álvarez I O., Mercado-Flores Y (2011), ''Isolation of bacteria with antifungal activity against the phytopathogenic fungi Stenocarpella maydis and Stenocarpella macrospora'', International journal of molecular sciences, 12 (9), 5522-5537 47.Priest F., Goodfellow M., Shute L., Berkeley R (1987), ''Bacillus amyloliquefaciens sp nov., nom rev'', International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 37 (1), 69-71 48.Ramírez-Camejo L A., Zuluaga-Montero A., Lázaro-Escudero M., HernándezKendall V., Bayman P (2012), ''Phylogeography of the cosmopolitan fungus Aspergillus flavus: is everything everywhere?'', Fungal biology, 116 (3), 452463 49 Roy N., Chakrabartty P K (2000), ''Effect of aluminum on the production of siderophore by Rhizobium sp.(Cicer arietinum)'', Current microbiology, 41 (1), 5-10 50 Saba H., Vibhash D., Manisha M., Prashant K., Farhan H., Tauseef A (2012), ''Trichoderma promising plant growth stimulator and biocontrol agent'', Mycosphere, (4), 524-531 51.Schrey S D., Tarkka M T (2008), ''Friends and foes: streptomycetes as modulators of plant disease and symbiosis'', Antonie Van Leeuwenhoek, 94 (1), 11-19 52.Seipke R F., Kaltenpoth M., 37Hutchings M I (2012), ''Streptomyces as symbionts: an emerging and widespread theme?'', FEMS microbiology reviews, 36 (4), 862-876 76 53 Stabb E V., Jacobson L M., Handelsman J (1994), ''Zwittermicin A-producing strains of Bacillus cereus from diverse soils'', Applied and Environmental Microbiology, 60 (12), 4404-4412 54 Stein T (2005), ''Bacillus subtilis antibiotics: structures, syntheses and specific functions'', Molecular microbiology, 56 (4), 845-857 55 Sutton B C (1980), The Coelomycetes: Fungi Imperfecti with Pycnidia Acervuli and Stomata, Commonwealth Mycological Institute Kew, England 56 Suwannarat S., Steinkellner S., Songkumarn P., Sangchote S (2017), ''Diversity of Colletotrichum spp isolated from chili pepper fruit exhibiting symptoms of anthracnose in Thailand'', Mycological Progress, 16 (7), 677-686 57 Talboys P J., Owen D W., Healey J R., Withers P J., Jones D L (2014), ''Auxin secretion by Bacillus amyloliquefaciens FZB42 both stimulates root exudation and limits phosphorus uptake in Triticum aestivum'', BMC plant biology, 14 (1), 51 58 Tanja B., Milan K., Slavisa S., Ljubisa T., Giuliano D., Michael M., Vittorio V And Djordje F (2012), “Antimicrobial activity of Bacillus sp Natural isolates and their potential use in the biocontrol of phytopathogenic bacteria”, Food Technology and Biotechnology 50 (1), pp 25 – 31 59 Verma M., Brar S K., Tyagi R., Surampalli R., Valero J (2007), ''Antagonistic fungi, Trichoderma spp.: panoply of biological control'', Biochemical Engineering Journal, 37 (1), 1-20 60 Vessey J K (2003), ''Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers'', Plant and soil, 255 (2), 571-586 61 Vinale F., Manganiello G., Nigro M., Mazzei P., Piccolo A., Pascale A., Lanzuise S (2014), ''A novel fungal metabolite with beneficial properties for agricultural applications'', Molecules, 19 (7), 9760-9772 62 Vinale F., Marra R., Scala F., Ghisalberti E., Lorito M., Sivasithamparam K (2006), ''Major secondary metabolites produced by two commercial Trichoderma strains active against different phytopathogens'', Letters in Applied Microbiology, 43 (2), 143-148 63 Vinale F.,Sivasithamparam K.,Ghisalberti E L.,Woo S L.,Nigro M.,Marra R.,Lanzuise S (2014), ''Trichoderma secondary metabolites active on plants and fungal pathogens'', The Open Mycology Journal, (1), 64 Watve M G., Tickoo R., Jog M M., Bhole B D (2001), ''How many antibiotics are produced by the genus Streptomyces'', Archives of microbiology, 176 (5), 386-390 65 Wong M.-H (2002), ''Fungal diseases of black pepper and their management in Sarawak'', Malaysia, Symposium on Pests and Diseases on Pepper Sarawak, Malaysia 66 Yi R H., Mo J J., Wu F F., Chen J (2015), ''Fruit internal brown rot caused by Neoscytalidium dimidiatum on pitahaya in Guangdong province, China'', Australasian Plant Disease Notes, 10 (1), 1-4 77 67 Zlosnik J E., Zhou G., Brant R., Henry D A., Hird T J., Mahenthiralingam E.,Speert D P (2015), ''Burkholderia species infections in patients with cystic fibrosis in British Columbia, Canada 30 years’ experience'', Annals of the American Thoracic Society, 12 (1), 70-78 68.http://khuyennonglamdong.gov.vn/hoat-dong-kn-lam-dong/32-chuyen-giaokhkt/3020-phong-tr-cac-bnh-thi-r-va-than-co-ngun-gc-t-t-tren-cay-raumau.html, 69 http://www.chungvisinh.com/che-pham-nam-trichoderma/, 78 PHỤ LỤC Phụ lục Công thức môi trường Môi trƣờng LB (Luria-Bertani) Peptone 10g Cao nấm men 5g NaCl 5g Nước cất lít pH Mơi trƣờng PDA Khoai tây 200g Saccarose 20g Nước cất 1000ml Agar 16g pH Môi trƣờng King B Glycerol 30ml Peptone 10g K2HPO4 0.5g MgSO4 0.5g Nước cất 1000ml pH Môi trƣờng NB (Nutrient Broth) Cao thịt bò 3g 79 Peptone 5g NaCl 5g Nước cất lít pH Mơi trƣờng SX1 Bột đậu tương 10g Cao nấm men 1g K2HPO4 0.5g MgSO4 0.02g Nước cất 1000ml pH Môi trƣờng SX2 Rỉ đường 10g Cao nấm men 1g Bột đậu tương 10 g CaCO3 1g Nước cất 1000ml pH Môi trƣờng SX3 Nước mắm 20ml Peptone 5g NaCl 5g Nước cất lít 80 pH Mơi trƣtng SX3 (Phytase screening medium) Glucose 10g Na-phytase 4g CaCl2 2g NH4NO3 5g KCl 0,5g MgSO4 7H2O 0,5g FeSO4 0,01g MnSO4 0,01g Agar 16g Nước cất lít 81 Phụ lục Trình tự vùng rDNA chủng N5 có hoạt tính kháng nấm mạnh TGGGATGGGCGGGCTATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTT GCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGC CTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTT GTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTA CAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCA AGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGA CTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCC GCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGT TTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAA TAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACG TGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTAT TGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCC CCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAG AAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGT GGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTG AGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCC ACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGT GCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGA CTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATG TGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCT CTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGT GGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCC GCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACT CTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAAGAAAGGTGGGGATGACGTC AAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTAACACCGTGCTACAATGGGC AAAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCT GTTTCTCAGTCCGGATGCGAGTTCGCAACTCCAACTGCGGGAATCTTGG AATCCCTAGTAAACCCGGAATCAACATGCCCCGGGGAAATACTTTCCCG GGCCTTGAACAACCCCCCGTTCACCCCCAGAATTTGTTAACCCCCGAAT CCCGTGAGGATCCCTTTGG Phụ lục Trình tự vùng ITS chủng nấm Trichoderma có hoạt tính kháng nấm mạnh Tr.2 ACCCATGTGACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGT GCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACC TTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTTTACAGCTCTGAGCAAAAAT CAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGG AAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTA ATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGA TGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCGGG TTGGGGATCGGGACCCCTCACACGGGTGCCGGCCCCTAAATACAGTGGC GGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTGGTTTGCGCAACTCGCACCGG AGCGCGGCGCGTCCACGTCAGTAAAACACCTAACTTTCTGAAATGTTGA CCTCGGGATCAGGTAAGAAGGCGAACTTAACTTAAGCA Tr.4 GTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAG CGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGAC TATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAACTTTCAACA ACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATA AGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCAC ATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCA ACCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCGGCGTTGGGGATCGGGACCCCTCAC ACGGGTGCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCT GCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCC GTAAAACACCCAACTTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATA CCCGCTGAACTTAAGCATATCAAT Tr.7 CTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACC AGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCG GACGTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTT TCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAT GCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGA ACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGT CATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCGGCGTTGGGGATCGGGAC CCCTCACACGGGTGCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGC CTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTC CACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGT AGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA Phụ lục Bảng đường kính nấm bệnh mơi trường PDA (mm) F.oxysporum S P.capsici N dimidiatum A flavus A niger P digitatum 70 90 50 40 42 hydrophilum 50 90 ...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Hồng NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC CHỐNG MỘT SỐ NẤM GÂY BỆNH CÂY TRỒNG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07... chống nấm gây bệnh trồng .14 1.3.3.2 Tình hình nghiên cứu chế phẩm vi sinh vật phịng chống nấm gây bệnh Việt Nam 21 1.4 Ứng dụng chế phẩm sinh học dạng bột phòng chống nấm gây. .. có nghiên cứu áp dụng để sản xuất chế phẩm, thương mại hóa sử dụng rộng rãi thị trường Trên sở đó, chúng tơi lựa chọn thực đề tài: ? ?Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học chống số nấm gây bệnh trồng? ??