(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu điều kiện phân tích các sulfamit bằng phương pháp sắc ký

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TƢ̣ NHIÊN - BÙI MINH THÁI NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH CÁC SULFAMIT BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI – 2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TƢ̣ NHIÊN - Bùi Minh Thái NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH CÁC SULFAMIT BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ Chun ngành: Hóa Phân Tích Mã số: 60 44 29 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Văn Ri HÀ NỘI – 2011 MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH VẼ MỞ ĐẦU ………………………………………………………………… Chƣơng - TỔNG QUAN ……………………………………………… 1.1 Giới thiệu chung sulfamit (SAs), metronidazole (MTD)……… 1.1.1 Cấu trúc phân tử ………………………………………………… 1.1.2 Tính chất vật lý hố học Sulfamit, Metronidazole ………… 1.1.3 Tính chất dược lý phổ tác dụng Sulfamit, Metronidazole 1.1.4 Cơ chế tác dụng kháng khuẩn Sulfamit, Metronidazole 1.1.5 Một số chế phẩm Sulfamit tiêu biểu ……… ……………… 1.2 Phƣơng pháp xác định……………………………………………… 1.2.1 Một số cơng trình nghiên cứu xác định Sas phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) …………………………………………… 1.2.2 Một số cơng trình nghiên cứu xác định Metronidazole phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) …………………………………… 1.2.3 Một số công trình nghiên cứu xác định đồng thời sulfamit metronidazole phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC ……… Chƣơng - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …… Đối tƣợng, mục tiêu nhiệm vụ nghiên cứu………………… 2.1 13 14 16 16 2.1.1 Đối tượng mục tiêu nghiên cứu ………………………………… 16 2.1.2 Nhiệm vụ nghiên cứu …………………………………………… 16 Phƣơng pháp nghiên cứu………………………………………… 17 2.2.1 Nguyên tắc chung trang bị phương pháp HPLC …… 17 2.2 Phân tích định lượng HPLC ………………………… 19 Giới thiệu chung phƣơng pháp chiết pha rắn ….………… 20 2.2.2 2.3 2.4 Hóa chất dụng cụ…………………………………………… 21 2.4.1 Hoá chất ………………………………………………… 21 2.4.2 Dụng cụ ……………………………………………………… 22 Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……………………………… 23 3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký ……………………………………… 23 3.1.1 Chọn bước sóng detector …………………………………… 23 3.1.2 Thăm dò khả tách Sulfamit cột RP-C18 ……… 26 3.2 Chọn pha tĩnh …………………………………………………… 28 3.3 Tối ƣu hóa pha động ………………………………………………… 28 3.3.1 Nồng độ đệm axetat pha động ……………………………… 28 3.3.2 Độ pH cho dung dịch đệm axetat ………………………………… 30 3.3.3 Tỉ lệ thành phần pha động ……………………………………… 33 3.3.4 Tốc độ pha động 35 3.4 Đánh giá phƣơng pháp phân tích ………………………………… 38 3.4.1 Khảo sát lập đường chuẩn khoảng nồng độ 0,05 – 1,000ppm 38 3.4.2 Giới hạn phát (LOD); Giới hạn định lượng (LOQ) 42 3.4.3 Độ đúng, độ lặp lại phép đo ………………………………… 44 3.5 Mẫu thực, quy trình xử lý kết phân tích ………………… 48 3.5.1 Quy trình xử lý mẫu, xác định hiệu suất thu hồi ………………… 48 3.5.2 Phân tích mẫu thực ……………………………………………………… 51 KẾT LUẬN ……………………………………………………………… TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT STT Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ACN Acetonitrin Axetonitrin Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn BNNPTNT CV Coeficient Variation Hệ số biến thiên HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao RP Reversed phase Hấp phụ pha đảo LOD Limit of Detection Giới hạn phát LOQ Limit of Quantity Giới hạn định lượng Thông tư TT UV - Vis Untraviolet - Visibet Tử ngoại – Khả kiến DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1: Diện tích pic phụ thuộc vào bước sóng detector………………… 25 Bảng 3.2: Thời gian lưu thứ tự pic chất phân tích……………… 27 Bảng 3.3: Sự phụ thuộc k’ vào nồng độ đệm axetat pha động…………… 29 Bảng 3.4: Hệ số dung tích giá trị pH khác nhau………………………… 31 Bảng 3.5: Hệ số dung tích phụ thuộc vào %ACN pha động…………… 33-34 Bảng 3.6: Diện tích pic chất phân tích phụ thuộc vào tốc độ pha động 36 Bảng 3.7: Diện tích pic sắc ký phụ thuộc vào nồng độ chất phân tích……… 38-39 Bảng 3.8: Bảng giá trị Ftính chất phân tích 42 Bảng 3.9: LOD, LOQ tính theo phương trình hồi quy 43 Bảng 3.10: Khảo sát độ đúng, độ lặp lại phương pháp phân tích (nồng độ 0,08ppm) 45 Bảng 3.11: Khảo sát độ đúng, độ lặp lại phương pháp phân tích (nồng độ 0,4ppm) 46 Bảng 3.12: Khảo sát độ đúng, độ lặp lại phương pháp phân tích (nồng độ 0,8ppm) 47-48 Bảng 3.13: Chiều cao píc sắc ký mẫu tôm nồng độ thêm chuẩn khác 50 Bảng 3.14: Kết xác định hiệu suất thu hồi chất phân tích……………… 51 Bảng 3.15: Kết phân tích chất mẫu tơm rảo…………………… 52 Bảng 3.16: Hàm lượng chất phân tích mẫu tôm rảo………………… 53 Bảng 3.17: Kết phân tích chất mẫu tơm chân trắng…………… 54 Bảng 3.18: Hàm lượng chất phân tích mẫu tơm chân trắng……………… 54 Bảng 3.19: Kết phân tích chất mẫu tôm sú…………………… 55 Bảng 3.20: Hàm lượng chất phân tích mẫu tơm sú…………………… 55 Bảng 3.21: Kết phân tích chất mẫu tôm lớt…………………… 56 Bảng 3.22: Hàm lượng chất phân tích mẫu tơm lớt……………………… 57 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1: Sơ đồ chuyển hố axít folic thành nucle protein………………… Hình 2.1: Sơ đồ khối hệ thống HPLC đầy đủ……………………………… 19 Hình 3.1: Phổ hấp thụ vùng tử ngoại khả kiến Sas…………… 23-24 Hình 3.2: Diện tích pic phụ thuộc vào bước sóng detector……………… 25 Hình 3.3: Thời gian lưu sulfamit…………………………………… 26-27 Hình 3.4: Sự phụ thuộc k’ vào nồng độ đệm axetat pha động…… 29 Hình 3.5: Píc sắc ký giá trị nồng độ đệm khác 29-30 Hình 3.6: Sự phụ thuộc K’ vào pH pha động 31 Hình 3.7: Sắc đồ sắc ký pH khác 32 Hình 3.8: Sự phụ thuộc k’ vào tỉ lệ % ACN pha động 34 Hình 3.9: Sắc đồ píc sắc ký tỉ lệ thành phần pha động khác 34-35 Hình 3.10: Sự phụ thuộc diện tích píc sắc ký vào tốc độ pha động 36 Hình 3.11: Sắc đồ tốc độ khác pha động 37 Hình 3.12: Đường chuẩn chất phân tích khoảng nồng độ 0,05-1,00ppm… 39-40 Hình 3.13: Sắc đồ chất phân tích nồng độ khác bước sóng 270nm… 40 Hình 3.14: Sắc đồ chất phân tích nồng độ khác bước sóng 320nm… 41 Hình 3.15: Sắc đồ chất phân tích với nồng độ 0,01ppm………………… 43 Hình 3.16: Sắc đồ chất phân tích sau lần bơm mẫu nồng độ 0,08ppm … 45 Hình 3.17: Sắc đồ chất phân tích sau lần bơm mẫu nồng độ 0,4ppm …… 47 Hình 3.18: Sắc đồ chất phân tích sau lần bơm mẫu nồng độ 0,8ppm …… 48 Hình 3.19: Sơ đồ xử lý mẫu Tôm 49 Hình 3.20: Sắc đồ hiệu suất thu hồi theo quy trình xử lý mẫu tơm 50 Hình 3.21: Đường chuẩn SGU mẫu tơm rảo phân tích thêm chuẩn… 53 Hình 3.22: Sắc đồ pic sắc ký thêm chuẩn SGU mẫu tơm rảo……… 53 Hình 3.23: Đường chuẩn SGU mẫu tôm chân trắng phân tích thêm chuẩn 54 Hình 3.24: Sắc đồ pic sắc ký thêm chuẩn SGU mẫu tôm chân trắng 54 Hình 3.25: Đường chuẩn SGU, SMP mẫu tơm sú phân tích thêm chuẩn 55 Hình 3.26: Sắc đồ pic sắc ký thêm chuẩn SGU, SMP tơm sú……… 56 Hình 3.27: Đường chuẩn SGU mẫu tơm lớt phân tích thêm chuẩn… 57 Hình 3.28: Sắc đồ pic sắc ký thêm chuẩn SGU tôm lớt…………… 57 MỞ ĐẦU Dư lượng kháng sinh thực phẩm vấn đề quan ngại hầu hết quan kiểm soát thực phẩm giới Một số loại kháng sinh thông thường (chloramphenicol, malachite green, metronidazole…) thân gây tác động có hại cho sức khoẻ người tiêu dùng, số loại khác kháng sinh nhóm nitrofurans qua trình trao đổi chất thể động vật sinh hợp chất có độc tính cao thể sống Họ thuốc kháng khuẩn Sulfamit (SAs) nhóm kháng khuẩn có hoạt phổ rộng, sử dụng nhiều trong nuôi trồng, chế biến nông thủy sản, v.v Việc sử dụng chất cách tùy tiện dẫn đến tồn dư lượng lớn giới hạn cho phép thể động vật Khi người tiêu dùng sử dụng thực phẩm có dư lượng lớn sulfamit hay chất kháng sinh thời gian dài gây loạt phản ứng rối loạn đường tiết niệu, rối loạn tạo máu, rối loạn chuyển hóa porphyrin Cho nên việc xác định xác lượng sulfamit, chất kháng sinh thức ăn chăn nuôi lượng tồn dư sản phẩm từ động vật quan trọng Dựa thực tế đó, luận văn này, tiến hành nghiên cứu điều kiện tách xác định đồng thời chất kháng sinh metronidazole sulfamit sulfaguanidine, sulfamethoxazone, sulfamethoxypiridazine, sulfadoxin phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) ghép nối detector UV – Vis, phương pháp có độ chọn lọc, độ nhạy tốt trang bị nhiều sở kiểm nghiệm nước ta, có tính khả thi ứng dụng vào thực tế cao Chƣơng - TỔNG QUAN 1.2 Giới thiệu chung sulfamit (SAs), metronidazole(MTD) 1.1.1 Cấu trúc phân tử [3,6] Họ SAs có cấu trúc phân tử tổng quát: R2 N SO NH R1 Khi thay nhóm R1, R2 gốc khác nhau, có SAs khác nhau.Vì có họ SAs Khi R2 = H sulfamit có hoạt tính kháng khuẩn Khi R2 # H, chất tiền thuốc R1 mạch thẳng, dị vịng Tuy nhiên R1 dị vịng hiệu lực kháng khuẩn mạnh hơn, thơng thường dị vịng 2-3 dị tố Cấu trúc Metronidazole(MTD): Là thuốc kháng sinh thuộc họ nitroimidazole sử dụng đặc biệt vi khuẩn kỵ khí động vật nguyên sinh MTD thành phần có mặt thức ăn chăn ni, thuốc kháng sinh nuôi trồng thủy sản (với tên thương mại Enro DC) 1.1.3 Tính chất vật lý hố học Sulfamit, Metronidazole [3] 1.1.2.1 Tính chất vật lý SAs dạng tinh thể màu trắng vàng nhạt, khơng mùi, thường tan nước, tan dung dịch axít, tan dung dịch kiềm (trừ sulfagu-anidin) Li tâm 10 phút Cặn Dung dịch Làm cột chiết pha rắn C18 Loại bỏ Bão hoà cột: 10ml MeOH, 10 ml H2O Nạp mẫu Rửa: 10ml H2O Rửa giải: 10ml MeOH 10ml dung dịch SAs MeOH Cô cạn dung dịch dịng khí N2 50oC Định mức thành ml pha động chạy HPLC Lọc qua cartridge 0,2 m Bơm vào hệ thống HPLC Hình 3.19: Sơ đồ xử lý mẫu tơm Với quy trình xử lý mẫu thêm lượng xác chất phân tích vào mẫu tơm xử lý Với nồng độ chất thêm vào mẫu xử lý ba lần, phân tích lặp lại ba lần lấy giá trị trung bình Các kết nghiên cứu trình bày hình 3.20, bảng 3.13 bảng 3.14: 5.0 5.0 4.0 4.0 3.0 3.0 2.0 2.0 4/8.956 5/9.743 0.0 0.0 0.0 3/6.149 1.0 2/4.201 1.0 1/3.493 mV 6.0 Detector A Ch1:270nm 1/3.460 mV 6.0 Detector A Ch1:270nm 2.5 5.0 (a) 7.5 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 (b) Hình 3.20 Sắc đồ hiệu suất thu hồi theo quy trình xử lý mẫu tơm (a) chưa thêm chuẩn, (b) thêm chuẩn (trong đó: (1) SGU; (2) MTD; (3) SMP ;(4)SDO; (5) SMX) Bảng 3.13: Diện tích pic sắc ký mẫu tơm nồng độ thêm chuẩn khác Ct(ppm) 0,2 0,4 SGU 9610 30104 51859 MTD 24056 43824 SMP 25742 50795 SDO 23144 49734 SMX 21975 48753 S pic(mm) Từ kết trên, hiệu suất thu hồi chất nồng độ bảng 3.13 Hiệu suất thu hồi xác định sau: H = (Cx/Ct)* 100% Trong đó: Ct - lượng chất biết trước thêm vào Cx - lượng chất xác định phương pháp thêm Với Cx  (S x  So )  A B Sx – Diện tích pic thêm lượng Cx vào mẫu So – Diện tích pic thêm mẫu chưa thêm chất phân tích A, B - hệ số phương trình đường chuẩn chất phân tích Bảng 3.14: Kết xác định hiệu suất thu hồi chất phân tích Các Sas SGU MTD SMP Ct (ppm) Cx(ppm) H% 0,200 0,165 82,50 0,400 0,200 0,400 0,349 0,151 0,31 87,3 75,5 77,7 0,200 0,167 83,5 0,400 0,361 90,3 SDO SMX 0,200 0,146 72,9 0,400 0,343 85,8 0,200 0,142 71,0 0,400 0,352 88,1 Như khoảng nồng độ 0,2 – 0,4ppm, hiệu suất thu hồi metronidazole chất kháng khuẩn SAs đạt từ 71 – 90 %, hiệu suất thu hồi đạt yêu cầu 3.5.2 Phân tích mẫu thực Các mẫu tôm (bỏ đầu, vỏ, chân, đuôi) lấy phần thịt, sau đơng khơ xử lý theo sơ đồ 3.19 Sau dung dịch cuối tiến hành phân tích theo phương pháp thêm chuẩn Xây dựng đồ thị biểu diễn diện tích pic theo nồng độ chất thêm  Nồng độ chất phân tích mẫu Cx tính theo cơng thức: Cx = A/B (với A, B - hệ số phương trình hồi quy đồ thị thêm chuẩn)  Khoảng tin cậy nồng độ chất phân tích mẫu là: S S Sx  ( a )2  ( b )2 Cx a b Trong đó: Cx : Nồng độ chất phân tích có dung dịch bơm vào cột tách a,b hệ số phương trình hồi qui Sa, Sb : sai số hệ số phương trình hồi qui Sx sai số nồng độ xác định theo phương pháp thêm chuẩn Khối lượng chất phân tích có a(g) mẫu cân đơng khơ ban đầu : mcpt = V*Cx*F*10-3(mg) Trong mcpt : Khối lượng chất phân tích a (g) mẫu (mg) V : Thể tích dung dịch pha từ a(g) (ml) F : Hệ số pha loãng Cx : Nồng độ chất phân tích xác định từ phương trình hồi quy 10-3 : Hế số chuyển từ µg sang mg 3.5.2.1 Mẫu tôm rảo Khối lượng mẫu thịt tôm tươi : 142,8g Khối lượng mẫu sau đông khơ : 32,9g Lượng nước có mẫu : 77% Với mẫu xử lý ba lần, phân tích lặp lại ba lần lấy giá trị trung bình Kết phân tích sau: Bảng 3.15: Kết phân tích chất mẫu tơm rảo Chất phân tích SGU Diện tích píc sắc ký (mAu.s) Mẫu thêm chuẩn Mẫu thêm chuẩn 0,1ppm chất phân tích 0,2ppm chất phân tích 45766 75734 Mẫu tơm Rảo 22151 Ta có phương trình hồi quy: 80000 Spic(mAu.s) 70000 60000 50000 40000 Y=A+B*X He so Gia tri Sai so -A 21092.16667 2367.62331 B 267915 18339.5313 30000 20000 R SD N P -0.99767 2593.60139 0.04351 10000 -0,15 -0,10 -0,05 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 CSGU(ppm) Hình 3.21: Đường chuẩn SGU mẫu tơm rảo phân tích thêm chuẩn Bảng 3.16: Hàm lượng chất phân tích mẫu tơm rảo Chất phân tích CSAs từ đường chuẩn (ppm) Hàm lượng chất mẫu đông khô (ppm) Hàm lượng chất mẫu tươi (ppm) SGU 0,079 ± 0,010 0,53 ± 0,07 0,12 ± 0,02 mV 7.0 Detector A Ch1:270nm mV 7.0 Detector A Ch1:270nm 6.0 6.0 5.0 5.0 4.0 4.0 3.0 3.0 mV Detector A Ch1:270nm 7.0 1/3.407 6.0 4.0 3.0 1/3.441 2.0 1/3.363 5.0 2.0 2.0 1.0 1.0 1.0 0.0 0.0 0.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 Mẫu chưa thêm 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Mẫu thêm chuẩn 0,1ppm 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Mẫu thêm chuẩn 0,2ppm Hình 3.22: Sắc đồ pic sắc ký thêm chuẩn SGU mẫu tôm rảo 3.5.2.2 Mẫu tôm chân trắng Khối lượng mẫu thịt tươi : 150,1g Khối lượng mẫu sau đơng khơ : 30,5g Lượng nước có mẫu :79,7% Bảng 3.17: Kết phân tích chất mẫu tơm chân trắng Chất phân tích SGU Diện tích píc sắc ký (mAu.s) Mẫu tơm Mẫu thêm chuẩn Mẫu thêm chuẩn 0,2ppm chân trắng 0,1ppm chất phân tích chất phân tích 30407 59365 74137 Ta có phương trình hồi quy: 6000 90000 Spic(mAu.s) 80000 5000 70000 4000 60000 3000 50000 40000 30000 20000 10000 -0.20 -0.15 -0.10 -0.05 0.00 Y=A+B*X 2000 He so Gia tri Sai so -A 31104.66667 1560.03009 B 268650 12083.94113 1000 R SD N P -0.99899 1708.92734 0.02862 0.05 0.10 0.15 0.20 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 CSGU(ppm) Hình 3.23: Đường chuẩn SGU mẫu Hình 3.24: Sắc đồ pic sắc ký thêm tơm chân trắng phân tích thêm chuẩn chuẩn SGU mẫu tôm chân trắng Bảng 3.18: Hàm lượng chất phân tích mẫu tơm chân trắng Chất phân tích CSAs từ đường chuẩn (ppm) SGU 0,115 ± 0,008 Hàm lượng chất Hàm lượng chất mẫu đông khô(ppm) mẫu tươi(ppm) 0,16 ± 0,01 0,77 ± 0,05 3.5.2.3 Mẫu tôm Sú Khối lượng mẫu thịt tôm tươi : 123,6g Khối lượng mẫu sau đơng khơ: 37,4g Lượng nước có mẫu : 69,7% Với mẫu xử lý ba lần, phân tích lặp lại ba lần lấy giá trị trung bình Kết phân tích sau: Bảng 3.19: Kết phân tích chất mẫu tơm sú Diện tích píc sắc ký (mAu.s) Chất phân Mẫu thêm chuẩn Mẫu thêm chuẩn 0,1ppm chất phân tích 0,2ppm chất phân tích 18451 30532 45849 7010 20175 35745 tích Mẫu tơm sú SGU SMP Ta có phương trình hồi quy: 50000 40000 45000 Spic(mAu.s) 35000 Spic(mAu.s) 40000 30000 35000 25000 30000 25000 20000 Y=A+B*X 20000 15000 10000 -0,15 -0,10 -0,05 15000 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 C SGU He so Gia tri Sai so -A 6609.16667 896.29058 B 143675 6942.63699 10000 R SD N P -0.99768 1321.09147 0.04334 5000 -0,20 Y=A+B*X He so Gia tri Sai so -A 17911.66667 1205.986 B 136990 9341.52736 5000 (ppm) -0.10 R SD N P -0.99883 981.83714 0.03074 0.00 -0.05 0.05 0.10 0.15 0.20 CSMP(ppm) Hình 3.25: Đường chuẩn SGU, SMP mẫu tơm sú phân tích thêm chuẩn Bảng 3.20: Hàm lượng chất phân tích mẫu tôm sú Chất phân CSAs từ đường Hàm lượng chất Hàm lượng chất tích chuẩn (ppm) mẫu đông khô (ppm) mẫu tươi (ppm) SGU 0,130 ± 0,012 0,87 ± 0,08 0,26 ± 0,02 SMP 0,046 ± 0,007 0,30 ± 0,04 0,09 ± 0,01 mV 5.0 Detector A Ch1:270nm mV 5.0 Detector A Ch1:270nm 4.0 4.0 4.0 3.0 3.0 1/3.308 1/3.358 3.0 2.0 1.0 2/4.476 1.0 1.0 0.0 0.0 0.0 2/4.675 2.0 2/4.877 2.0 1/3.340 mV 5.0 Detector A Ch1:270nm 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 Mẫu chưa thêm 7.0 8.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 Mẫu thêm chuẩn 0,1ppm 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 Mẫu thêm chuẩn 0,2ppm Hình 3.26: Sắc đồ pic sắc ký thêm chuẩn SGU, SMP tôm sú 3.5.2.4 Mẫu tôm lớt 6.0 Khối lượng mẫu tôm tươi : 132,5g Khối lượng mẫu sau đơng khơ: 28,4g Lượng nước có mẫu : 78,6% Với mẫu xử lý ba lần, phân tích lặp lại ba lần lấy giá trị trung bình Kết phân tích sau: Bảng 3.21: Kết phân tích chất mẫu tơm lớt Diện tích píc sắc ký (mAu.s) Chất phân tích SGU Mẫu tôm lớt Mẫu thêm chuẩn Mẫu thêm chuẩn 0,2ppm 0,1ppm chất phân tích chất phân tích 26845 40548 60849 Ta có phương trình hồi quy: 65000 60000 Spic(mAu.s) 55000 50000 45000 40000 35000 30000 Y=A+B*X 25000 He so Gia tri Sai so -A 25745.3333 2458.929 B 170020 19046.78538 20000 15000 10000 5000 -0,20 -0,15 -0,10 -0,05 0,00 R SD N P -0.99883 2693.62222 0.07102 0,05 0,10 0,15 0,20C SGU (ppm) Hình 3.27: Đường chuẩn SGU mẫu tơm lớt phân tích thêm chuẩn Bảng 3.22: Hàm lượng chất phân tích mẫu tơm lớt Chất phân CSAs từ đường tích chuẩn (ppm) SGU 0,151 ± 0,022 Hàm lượng chất mẫu đông khô(ppm) Hàm lượng chất mẫu tươi(ppm) 1,00 ± 0,15 0,21 ± 0,03 9.0 9.0 9.0 8.0 8.0 8.0 7.0 7.0 7.0 6.0 6.0 6.0 5.0 5.0 4.0 4.0 4.0 3.0 3.0 2.0 2.0 2.0 1.0 1.0 1.0 0.0 0.0 0.0 3.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 Mẫu chưa thêm 0.0 1.0 2.0 3.0 1/3.485 mV 10.0 Detector A Ch1:270nm 1/3.395 mV 10.0 Detector A Ch1:270nm 1/3.427 mV 10.0 Detector A Ch1:270nm 5.0 4.0 5.0 Mẫu thêm chuẩn 0,1ppm 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Mẫu thêm chuẩn 0,2ppm Hình 3.28: Sắc đồ pic sắc ký thêm chuẩn SGU tôm lớt Nhận xét: Với kết xác định cho thấy mẫu tôm xuất chất dư lượng kháng khuẩn SGU Với giới hạn dư lượng sulfamit thịt thủy sản cho phép 0,1ppm( theo thơng tư số:29/2010/TT-BNNPTNT) mẫu tơm mà chúng tơi phân tích vượt mức giới hạn Với mẫu tôm sú, tôm lớt dư lượng gấp lần lượng cho phép Không phát thấy MTD, SMX, SDO, SMP( trừ tôm sú) mẫu tôm KẾT LUẬN Trên sở nghiên cứu điều kiện thực nghiệm, nhằm ứng dụng kỹ thuật phân tích HPLC – UV-Vis để tách, xác định đồng thời metronidazole số sulfamit (SGU, SMP, SDO, SMX) số loại tôm, thu số kết sau đây: Đã chọn điều kiện tối ưu cho trình sắc ký:  Cột tách RP - C18: 25 cm × 4,6 mm; 5m  Detector UV-VIS: kênh  = 270 nm;  =320nm.Rise time = 0,1 s; Range = 0,01 AUFS  Máy ghi: tốc độ giấy = mm/phút; ghi = 10 mV  Thành phần pha động: dung dịch đệm axetat (pH = 4,5) 10mM /aceto-nitril: 80/20 (v/v)  Tốc độ pha động: ml/phút Đã đánh giá phương pháp phân tích:  Khoảng tuyến tính sulfamit: 0,05 – 1,00ppm  Giới hạn phát hiện: 0,012 – 0,029 ppm  Giới hạn định lượng: 0,040 - 0,096 ppm  Hệ số biến thiên: 0,2% – 5% khoảng nồng độ 0,08- 0,8ppm Khảo sát mẫu thực  Chọn quy trình xử lý mẫu thích hợp, hiệu suất thu hồi chất phân tích mẫu tơm đạt từ 71 -90%  Xác định dư lượng SGU mẫu tôm chân trắng: 0,16 ± 0,01ppm, tôm lớt: 0,21±0,03ppm, tôm rảo:0,12±0,02ppm, tôm sú :0,26±0,02ppm, dư lượng SMP tôm sú 0,09 ± 0,01ppm  Không phát thấy MTD, SDO, SMX, SMP( trừ tôm sú) mẫu tôm Từ kết thu được, chúng tơi thấy phương pháp HPLC – Detector UV-Vis có độ nhạy cao, thích hợp cho phân tích đồng thời metronidazole chất kháng khuẩn SGU, SMP, SDO SMX tôm Chúng hy vọng nghiên cứu góp phần vào việc ứng dụng kỹ thuật HPLC – UV-Vis nói riêng kỹ thuật HPLC nói chung để xác định metronidazole hợp chất thuộc họ sulfamit thực phẩm, nhằm phục vụ đắc lực cho ngành khoa học đặc biệt lĩnh vực vệ sinh an toàn thực phẩm, giúp bảo vệ sức khoẻ cho người TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Chu Đình Bính, Phạm Luận, Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Nguyễn Phương Thanh (2007), “Xác định dư lượng chất kháng khuẩn họ sulfamit thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 45(1B), tr 33 – 41 Nguyễn Thị Kim Dung (2004), Xác định sulfonamide thuốc phương pháp hấp thụ nguyên tử, Luận văn Thạc sĩ khoa học, Đại học Quốc gia Hà Nội Trần Đức Hậu, Nguyễn Đình Hiển, Thái Duy Thìn, Huỳnh Kim Thoa, Nguyễn Văn Thục (2006), Hoá dược tập 2, Bộ mơn hố dược, Đại học Dược, Hà Nội Nguyễn Thị Phương Linh (2006), Xác định gián tiếp hàm lượng sulfamethoxazole thuốc phép đo F-AAS, Luận văn thạc sĩ khoa học, Đại học Quốc gia Hà Nội Phạm Luận (1998), Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu nâng cao, Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Thị Ánh Nguyệt (2007), Nghiên cứu tách xác định đồng thời số sulfamit thức ăn chăn nuôi thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC), Luận văn thạc sĩ khoa học, Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung, Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi(2003), Hóa học phân tích- Phần 2(Các phương pháp phân tích cơng cụ), Đại học Quốc Gia Hà Nội Tạ Thị Thảo (2005), Thống kê hoá phân tích, Đại học Quốc gia Hà Nội Tiêu chuẩn ngành (2004), Sulfonamit sản phẩm thuỷ sản-Phương pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu cao, 28 TCN 196:2004 10 Vũ Cẩm Tú (2009), Xác định sulfamit mẫu Dược phẩm thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao(HPLC), Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Khoa học Tự nhiên Tiếng Anh 11 A V Pereira, Q B Cass(2005), “High- performance liquid chromatography method for the simultaneous determination of sulfamethoxazole and trimethoprim in bovine milk using an on-line clean-up column”, Journal of chromatography B, 826, pp 139- 146 12 Cheong, C.K., Hajeb, P.Jinap, S and Ismail-Fitry, M.R(2010), “Sulfonamides determination in chicken meat products from Malaysia’’, International Food Research Journal,17, pp 885-892 13 Craig D.C Salisbury, Jason C Sweet, Roger Munro(2004), “ Determination of sulfonamide residues in the Tissues of food animals using automated precolumn derivatization and liquid chromatography with fluorescence detection”, Journal of AOAC international, 87( 5), pp.1264-1268 14 D.G Kennedy, R.J.McCracken, A.Cannavan, S.A.Hewitt (1998),“Use of liquid chromatography-mass spectrometry in the analysis of residues of antibiotics on meat and milk” Journal of chromatography A, 812, pp.77-98 15 Gertraud Suhren and W Heeschen(1993) “Detection of eight sulphonamides and dapsone in milk by a liquid chromatographic method”, Analytica Chimica Acta, 275, pp 329-333 16 Hadir M Maher, Rasha M Youssef, Riad H Khalil and Sabry M ElBahr(2008), “ Simultaneous multiresidue determination of metronidazole and spiramycin in fish muscle using high performance liquid chromatography with UV detection ’’, Journal of Chromatography B, 876(2), pp.175-181 17 Han-Wen Sun, Feng-Chi Wang and Lian-Feng Ai(2007), “ Simultaneous determination of seven nitroimidazole residues in meat by using HPLC-UV detection with solid-phase extraction”, Journal of Chromatography B, 857(2), pp 296-300 18 Ivan Pecorelli, Rita Bibi, Laura Fioroni, Roberta Galarini (2004) ,“Validation of a confirmatory method for the determination of sulphonamides in muscle according to the European Union regulation 2002/657/EC”, Journal of chromatography A, 1032(1-2),pp 23-29 19 M Brandtner, W Hela, R Widek, R Suhuh (2003), “Determination of sulfonamides in animal tissues using cation exchange reversed phase sorbent for sample cleanup and HPLC-DAD for detection”, Food Chemistry, 83, pp 601-608 20 Naser Tavakoli, Jaleh Varshosaz, Farid Dorkoosh and Mohammad R Zargarzadeh (2007), “Development and validation of a simple HPLC method for simultaneous in vitro determination of amoxicillin and metronidazole at single wavelength’’, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 43(1), pp.325- 329 21 Naoto Furusawa(2000), “Simplified determining procedure for routine residue monitoring of sulphamethazine and sulphadimethoxine in milk” Journal of chromatography A, 898, pp.185 – 191 22 PVinas, C.Lopez Erroz,N.Campillo, M.Hernandez(1996), “ Determination of sulphonamides in foods by liquid chromatography with postcolumn fluorescence derivatization”, Journal of Chromatography A, 726(1-2), pp.125131 23 Qiong-Hui Zou, Xiang-Feng Wang,Yuan Liu, Jin Wang, Jia Song, Hui Gao, Jie Han(2007), “ Determination of sulphonamides in animal tissues by high performance liquid chromatography with pre-column derivatization of 9-fluorenylmethyl chloroformate”, Journal of Separation Science ,30(16), pp 2647–2655 24 Richard Lindberg, Per-Åke Jarnheimer, Björn Olsen, Magnus Johansson and Mats Tysklind (2004), “Determination of antibiotic substances in hospital sewage water using solid phase extraction and liquid chromatography/mass spectrometry and group analogue internal standards”, Chemosphere,57(10) ,pp.1479 -1488 25 Rodrigo H.M.M Granja, Alfredo M Montes Niño, Fernanda Rabone and Alessandro Gonzalez Salerno(2008), “A reliable high-performance liquid chromatograph with ultraviolet detection for the determination of sulfonamides in honey” , Analytica Chimica Acta , 613(1), pp 116-119 26 Ticiano Gomes Nascimento, Eduardo de Jesus Oliveira and Rui Oliveira Macêdo(2005),’’ Simultaneous determination of ranitidine and metronidazole in human plasma using high performance liquid chromatography with diode array detection’’, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 37( 4), pp 777-783 27 Theresa A Gehring, Bill Griffinb, Rod Williams , Charles Geiseker ,Larry G Rushing , Paul H Siitonen(2006), “ Multiresidue determination of sulfonamides in edible catfish, shrimp and salmon tissues by high-performance liquid chromatography with postcolumn derivatization and fluorescence detection”, Journal of Chromatography B, 840,pp.132–138 28 W.M.A Niessen(1998), “Analysis of antibiotics by liquid chromatography – mass spectrometry” Journal of chromatography A, 812, pp 53 – 75 29 W Hela, , M Brandtner, R Widek and R Schuh(2003), “ Determination of sulfonamides in animal tissues using cation exchange reversed phase sorbent for sample cleanup and HPLC–DAD for detection”, Food Chemistry,83(4), pp.601-608 30 Xiaojia Huang, Dongxing Yuan, Benli Huang (2007) ,“Simple and rapid determination of sulfonamides in milk using Ether- type column liquid chromatography”, Talanta ,72 ,pp.1298 -1301 31 Wang P, Li J, Zheng H.(2007), “ Simultaneous determination of seven sulfonamides and metronidazole and chloramphenicol in cosmetics by high performance liquid chromatography’’, Chineses journal of chromatography, 25(5), pp.743-746 32 Wikipedia, “the free encyclopedia (2005), sulfonamide (medicine)” Http://en.wikipedia.org/wiki/Sulfonamide (medicin) 33 Http://www.uptodate.com/contents/metronidazole-an-overview ... Thái NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH CÁC SULFAMIT BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ Chun ngành: Hóa Phân Tích Mã số: 60 44 29 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Văn. .. hoá điều kiện xử lý mẫu phân tích:  Chọn phương pháp xử lý mẫu xác định hiệu suất thu hồi Xây dựng quy trình phân tích ứng dụng quy trình nghiên cứu để phân tích số mẫu tơm 2.6 Phƣơng pháp nghiên. .. trình nghiên cứu xác định Metronidazole phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) …………………………………… 1.2.3 Một số cơng trình nghiên cứu xác định đồng thời sulfamit metronidazole phương pháp sắc ký lỏng