Nghiên cứu điều kiện phân tích các sulfamit bằng phương pháp sắc ký (luận án thạc sĩ)

Nghiên cứu điều kiện phân tích các sulfamit bằng phương pháp sắc ký (luận án thạc sĩ)Nghiên cứu điều kiện phân tích các sulfamit bằng phương pháp sắc ký (luận án thạc sĩ)Nghiên cứu điều kiện phân tích các sulfamit bằng phương pháp sắc ký (luận án thạc sĩ)Nghiên cứu điều kiện phân tích các sulfamit bằng phương pháp sắc ký (luận án thạc sĩ)Nghiên cứu điều kiện phân tích các sulfamit bằng phương pháp sắc ký (luận án thạc sĩ)Nghiên cứu điều kiện phân tích các sulfamit bằng phương pháp sắc ký (luận án thạc sĩ)Nghiên cứu điều kiện phân tích các sulfamit bằng phương pháp sắc ký (luận án thạc sĩ)Nghiên cứu điều kiện phân tích các sulfamit bằng phương pháp sắc ký (luận án thạc sĩ)Nghiên cứu điều kiện phân tích các sulfamit bằng phương pháp sắc ký (luận án thạc sĩ)Nghiên cứu điều kiện phân tích các sulfamit bằng phương pháp sắc ký (luận án thạc sĩ)Nghiên cứu điều kiện phân tích các sulfamit bằng phương pháp sắc ký (luận án thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - Bùi Minh Thái NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH CÁC SULFAMIT BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2011 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Quá trình sinh máu 1.1.1 Cơ quan sinh máu 1.1.2 Quá trình sinh máu 1.2 Bệnh bạch cầu cấp 1.2.1 Khái niệm chung 1.2.2 Dịch tễ học 1.2.3 Các nguyên nhân gây bệnh 1.2.4 Cơ chế bệnh sinh 1.2.5 Phân loại 1.2.6 Đặc điểm lâm sàng 1.2.7 Đặc điểm xét nghiệm 1.3 Tình hình nghiên cứu giới nhuộm hóa học tế bào 1.3.1 Kỹ thuật nhuộm Periodic-Axit Schiff (PAS) 1.3.2 Kỹ thuật nhuộm peroxidaza (PER) 10 1.3.3 Kỹ thuật nhuộm sudan B 11 1.3.4 Kỹ thuật nhuộm esteraza 11 1.3.5 Kỹ thuật nhuộm photphataza 13 1.4 Ứng dụng phương pháp nhuộm hóa học tế bào y học 14 1.5 Nghiên cứu nước nhuộm hóa học tế bào 23 CHƢƠNG PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tượng nghiên cứu 28 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 28 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 28 2.2 Phương pháp nghiên cứu 28 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 28 2.2.2 Phương pháp thu thập mẫu số liệu 28 2.2.3 Kỹ thuật nghiên cứu 29 2.2.4 Xử lý số liệu 30 2.2.5 Biện pháp hạn chế sai số 30 2.2.6 Thời gian địa điểm nghiên cứu 30 2.3 Thực nghiệm 30 2.3.1 Bệnh phẩm, dụng cụ, máy móc hóa chất nghiên cứu 30 2.3.2 Quy trình nhuộm hóa học tế bào 32 2.3.3 Đánh giá kết 35 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 37 3.1 Đặc điểm chung nhóm bệnh nhân nghiên cứu 37 3.2 Nhóm bạch cầu cấp dòng lympho 39 3.2.1 Đặc điểm chung nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng Lympho 39 3.2.2 Phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho sử dụng kit nhuộm HICYTEC 41 3.2.3 Kết nhuộm photphataza axit bạch cầu xác định loại lympho T bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho 47 3.3 Nhóm bạch cầu cấp dòng tủy 48 3.3.1 Phân nhóm bạch cầu cấp dòng tủy theo giới tính tuổi 48 3.3.2 Kết phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tủy theo kết chẩn đoán Viện Huyết học-Truyền máu trung ương 50 3.3.3 Kết phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ kit nhuộm HICYTEC 51 3.3.4 Mức độ phù hợp chẩn đoán thể bệnh bạch cầu cấp dòng tủy kít HICYTEC kết luận viện Huyết học-Truyền máu TW 53 3.4 Phân loại dòng tế bào bạch cầu cấp thể lai lympho - tủy (Lai L-T) 62 3.5 Kết nhuộm photphataza kiềm bạch cầu 67 3.6 Kết nhuộm sắt mẫu tủy bệnh nhân bạch cầu cấp Viện HHTM trung ương 69 KẾT LUẬN 69 KIẾN NGHỊ 70 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 MỞ ĐẦU Bệnh bạch cầu cấp nhóm bệnh máu ác tính hệ thống tạo máu với đặc trưng tăng sinh tích tụ tế bào non máu tủy xương Bạch cầu cấp chia thành nhóm bạch cầu cấp dòng tủy bạch cầu cấp dòng lympho Bạch cầu cấp dòng tủy kết tích lũy tế bào non bất thường tủy xương Bạch cầu cấp dòng lympho bệnh tăng sinh ác tính trình tạo máu dòng lympho Những tế bào lấn át sinh máu bình thường tủy xương, chúng thoát máu ngoại vi thâm nhiễm vào quan nội tạng [23] Bệnh có hội chứng: Thiếu máu, xuất huyết, nhiễm trùng dẫn tới tử vong không phát điều trị kịp thời Vì vậy, việc xác định xác thể bệnh dòng tế bào bị ung thư có vai trò định điều trị Hiện nay, việc phân loại dòng tế bào thể bệnh bạch cầu cấp dựa hai tiêu chuẩn FAB WHO Tiêu chuẩn FAB nhà Huyết học Pháp-Anh-Mỹ đưa năm 1976 tổng hợp kết hình thái học hóa học tế bào, năm 1986 tiêu chuẩn bổ sung thêm kết miễn dịch di truyền [15, 17] Nhuộm hóa học tế bào gồm kỹ thuật: Periodic-Acid Schiff (PAS), sudan black (SD), peroxidaza (PER), esteraza đặc hiệu, esteraza không đặc hiệu ức chế NaF không ức chế, photphataza kiềm axit Ưu điểm phương pháp nhuộm hóa học tế bào: Rẻ tiền, giá thành 1/4 so với phương pháp miễn dịch 1/10 so với phương pháp di truyền, không cần máy móc đại, dễ triển khai Hiện nay, kít nhuộm có bán thị trường kít đơn, giá thành cao có nhược điểm: kỹ thuật nhuộm nằm nên có nhiều cặn, quy trình nhuộm khác thời gian, số bước nhuộm, hóa chất cố định khác nhau, bước tẩy màu kỹ thuật nhuộm Sudan Periodic - Acid Schiff khó đồng nhất, nhuộm thiếu tương phản, chất màu dễ hòa tan dầu soi kính nên khó hội chẩn tiêu nhiều lần Tại Việt Nam, thuốc thử hầu hết tự pha kết hợp với yếu điểm nên độ nhạy, độ đặc hiệu thấp Theo Trần Ngọc Vũ cộng (2014) tỷ lệ phù hợp chẩn đoán hình thái học-hóa học tế bào miễn dịch 89,1%, giá trị dự báo bệnh bạch cầu cấp dòng lympho 88,88% độ đặc hiệu 73,77% [25] Theo tác giả Nguyễn Hữu Toàn việc phân loại dòng tế bào theo tiêu chuẩn FAB dựa phương pháp nhuộm hóa học cần phải có điều chỉnh tới 29,7% nhờ vào kỹ thuật miễn dịch di truyền [19 Hiện nay, tác giả Trần Văn Tính, Trung tâm Huyết học- Truyền máu, Bộ Công an nghiên cứu chế tạo thành công kít nhuộm hóa học tế bào đồng HICYTEC gồm 10 kỹ thuật: Giemsa, Periodic-Axit Schiff (PAS), Peroxidaza, Sudan B, Esteraza đặc hiệu, Esteraza không đặc hiệu, Esteraza không đặc hiệu ức chế NaF, Photphataza kiềm, Photphataza axit, Perls Bộ kít khắc phục yếu điểm Nhằm đánh giá giá trị sử dụng kít, tiến tới thay hàng nhập ngoại, đề tài “Ứng dụng kít nhuộm hóa học tế bào để phân loại bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB” đề tài có ý nghĩa khoa học, thực tiễn, kinh tế - xã hội cấp thiết Mục tiêu đề tài là: Đánh giá phù hợp kít nhuộm hóa học tế bào phân loại dòng tế bào so với phương pháp hình thái học, miễn dịch học di truyền bệnh nhân bạch cầu cấp chẩn đoán thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB (1986) Nội dung nghiên cứu:  Thống kê đặc điểm bệnh bạch cầu cấp bệnh nhân chọc tủy lần đầu Viện Huyết học-Truyền máu trung ương  Đánh giá tính phù hợp phương pháp nhuộm hóa học tế bào đồng HICYTEC 10 kỹ thuật so với phương pháp hình thái học, miễn dịch di truyền bệnh nhân chẩn đoán thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB  Đánh giá giá trị kít nhuộm hóa học tế bào đồng HICYTEC, nhuộm photphataza kiềm, nhuộm photphataza axit bạch cầu, nhuộm Perls bệnh nhân bạch cầu cấp CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Quá trình sinh máu 1.1.1 Cơ quan sinh máu Cơ quan tạo máu bao gồm: tủy xương, tổ chức lympho (lách, hạch, tuyến ức) tổ chức võng mô Thời kì phôi thai, quan tạo máu gồm có gan, lách, hạch Sau sinh, trình tạo máu (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu) xảy tủy đỏ xương Đến tuổi trưởng thành, trình sinh máu diễn đầu xương dẹt, đầu xương đùi, xương cánh tay vài khu vực sinh máu tủy biệt hóa dòng lympho T B [6] 1.1.2 Quá trình sinh máu Hiện nhiều công trình chứng minh, dòng tế bào máu sinh từ tế bào gốc vạn Quá trình biệt hóa qua nhiều giai đoạn tùy theo kích thích đặc hiệu mà tế bào gốc vạn biệt hóa để tạo thành tế bào có chức cần thiết [11] Ba kích thích tố tạo máu gồm: Erythropoietin tạo hồng cầu, thrombopoietin tạo tiểu cầu colony-stimulating factors với interleukin (IL) kích thích tạo bạch cầu Quá trình sinh máu điều hòa yếu tố di truyền đặc biệt tế bào bị chết theo chương trình [13] 1.2 Bệnh bạch cầu cấp 1.2.1 Khái niệm chung Bệnh bạch cầu cấp tình trạng bệnh lý cấp tính tế bào sinh máu với đặc điểm tăng số lượng bạch cầu bất thường tủy xương máu ngoại vi, tủy xương có 30% tế bào non (blast) tổng số tế bào có nhân, phá hủy trình sinh máu bình thường tủy xâm nhiễm vào quan [12] 1.2.2 Dịch tễ học  Theo công bố Rebecca Siegel MPH cộng (2015) năm 2014, Mỹ ghi nhận 6.250 ca mắc bệnh bạch cầu cấp dòng lympho Tỷ lệ nam (3.100) nữ (3.150) gần nhau, số tử vong gây bệnh 1.450 người [52];  Tại Mỹ, hàng năm xuất khoảng 2,2 trường hợp bạch cầu cấp dòng tủy 100.000 dân có khoảng 3.000 trường hợp bạch cầu cấp dòng lympho toàn quốc [44];  Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu tiến hành đầy đủ dịch tễ học bệnh bạch cầu cấp toàn quốc theo tổng kết Viện Huyết học-Truyền máu, Bệnh viện Bạch Mai thấy bệnh bạch cầu cấp gặp tỷ lệ cao (32.1%) số bệnh máu đến khám điều trị Bệnh viện Bạch Mai [7] 1.2.3.Các nguyên nhân gây bệnh Cho tới nguyên nhân gây bệnh chưa sáng tỏ Tuy nhiên qua nhiều nghiên cứu cho thấy có nhiều yếu tố liên quan tới phát sinh bệnh:  Tia xạ: Những người tiếp xúc nhiều với tia ion hóa hay tia xạ thường có nguy bị bạch cầu cấp;  Hóa chất: Những người nhiễm mạn tính benzen hay sử dụng hóa chất để chữa bệnh ác tính dễ mắc bệnh bạch cầu cấp;  Virus: Human T-cell lymphotropic virus gây bạch cầu cấp dòng lympho, Epstein-Barr virus (EBV) gây ung thư vòm  Yếu tố di truyền: Những bệnh nhân bị số bệnh di truyền hội chứng Down, hội chứng Bloom, thiếu máu Fanconi có nguy cao bị bạch cầu cấp [12] 1.2.4 Cơ chế bệnh sinh  Sự hoạt động gen ung thƣ (oncogene): Các gen bình thường yếu tố tác động trở thành gen bất thường gây ung thư gọi gen ung thư Sản phẩm gen ung thư protein bất thường, có hoạt tính mạnh, gây rối loạn trình sinh sản biệt hóa tế bào;  Gen ức chế ung thƣ: Các công trình nghiên cứu gần chứng minh tế bào bình thường có gen kiểm soát tăng sinh, gen dẫn đến kiểm soát phân chia tế bào, gây u;  Hoạt hóa oncogen bệnh bạch cầu cấp: Một số gen hoạt hóa kích thích tăng sinh tế bào Khi gen giải phóng kết hợp với gen ức chế bị kìm hãm làm tăng trưởng mạnh phát triển khối u làm tế bào bình thường trở thành ác tính [2, 21, 37]  Một số biến đổi gen thường gặp bạch cầu cấp dòng lympho thể Bảng 1.1 [10] Bảng 1.1 Biến đổi di truyền tiên lượng bạch cầu cấp dòng lympho Tiên lƣợng Tốt Loại bất thƣờng Trên lưỡng bội: >50 NST; Chuyển đoạn t(12;21) Trung bình Trên lưỡng bội từ 47-50 NST; 46XX/XY (bộ NST bình thường); Chuyển đoạn t(1;19) Xấu Thiểu bội, NST; Chuyển đoạn t(9;22); Chuyển đoạn t(11q23), t(4;11); Chuyển đoạn t(5;14) 1.2.5 Phân loại  Xếp loại bạch cầu cấp dòng tủy: Trong Bảng xếp loại bạch cầu cấp dòng tủy theo FAB 1976 Bạch cầu cấp dòng tủy chia làm thể từ M1 đến M7:  Thể M1: lơ xê mi cấp nguyên tủy bào biệt hóa;  Thể M2: lơ xê mi cấp nguyên tủy bào biệt hóa;  Thể M3: lơ xê mi cấp tiền tủy bào tăng hạt đặc hiệu chia làm nhóm:  M3h: chứa hạt đặc hiệu lớn;  M3v: chứa hạt đặc hiệu nhỏ  Thể M4: lơ xê mi cấp hỗn hợp chia làm nhóm:  M4: lơ xê mi cấp tủy - mono;  M4eo: lơ xê mi cấp tủy - mono có tăng bạch cầu toan  Thể M5: lơ xê mi cấp dòng mono:  M5a: ≥80% tế bào mono monoblast;  M5b: