Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới để sàng lọc rối loạn 24 nhiễm sắc thể trước làm tổ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ SIM NGHI£N CøU ứNG DụNG Kỹ THUậT GIảI TRìNH Tự GEN THế Hệ MớI Để SàNG LọC RốI LOạN 24 NHIễM SắC THể TRƯớC LàM Tổ LUN N TIN S Y HC H NỘI - 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ SIM NGHIÊN CứU ứNG DụNG Kỹ THUậT GIảI TRìNH Tự GEN THế Hệ MớI Để SàNG LọC RốI LOạN 24 NHIễM SắC THể TRƯớC LàM Tổ Chuyờn ngnh: Y sinh học - Di truyền Mã số: 62720111 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lương Thị Lan Anh PGS.TS Nguyễn Duy Bắc HÀ NỘI - 2020 LỜI CẢM ƠN Để thực hồn thành đề tài nghiên cứu khoa học này, tơi nhận hỗ trợ, giúp đỡ quan tâm, động viên từ Nhà trường, Bệnh viện, môn, đặc biệt Thầy, Cô, bạn bè, đồng nghiệp người thân gia đình Trước hết, xin bày tỏ biết ơn đặc biệt đến Phó giáo sư, Tiến sĩ Lương Thị Lan Anh Phó giáo sư, Tiến sĩ Nguyễn Duy Bắc Cơ Thầy trực tiếp hướng dẫn, tận tình dạy bảo tôi, định hướng cho tôi, dành nhiều thời gian công sức đồng hành tơi chặng đường để tơi hồn thành luận án Và xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Phó giáo sư, Tiến sĩ Nguyễn Duy Ánh, Giám đốc Bệnh viện Phụ sản Hà Nội, người lãnh đạo, người Thầy khơi dậy, hình thành nuôi dưỡng niềm đam mê nghiên cứu khoa học tôi, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phịng Đào tạo Sau đại học Trường Đại học Y Hà Nội tồn thể Thầy Cơ hội đồng chấm đề cương, hội đồng chấm học phần, chuyên đề, tiểu luận tổng quan, hội đồng sở tạo điều kiện cho Những lời nhận xét, phản biện, đóng góp ý kiến q báu Thầy Cơ giúp luận án hoàn thiện Đặc biệt, xin gửi lời cám ơn chân thành tới Thầy Cô Bộ môn Y Sinh học - Di truyền trường Đại học Y Hà Nội Thầy Học viện Qn Y tận tình truyền đạt kiến thức quý báu, giúp đỡ trình học tập thực nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban giám đốc Bệnh viện Phụ sản Hà Nội, toàn thể phòng ban bạn đồng nghiệp Trung tâm Sàng lọc, chẩn đoán trước sinh sơ sinh, đặc biệt Tiến sĩ Nguyễn Mạnh Trí, phụ trách Trung tâm hỗ trợ thời gian học tập Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất bệnh nhân tình nguyện tham gia nghiên cứu Luận án viết niềm yêu thương, giúp đỡ động viên các thành viên gia đình tơi, đặc biệt Bố Mẹ chồng, Chồng Con tôi, người chịu thiệt thịi, ln hỗ trợ tơi ln cổ vũ tinh thần cho tơi để vượt qua khó khăn thời gian học tập Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Bố Mẹ tôi, người sinh thành nuôi dưỡng, dạy bảo tạo điều kiện tốt cho tơi để tơi có kết ngày hơm Tơi nỗ lực để hồn thành luận án chắn không tránh khỏi thiếu sót Tơi mong nhận ý kiến bảo quý báu Thầy Cô đồng nghiệp để luận án hồn thiện Tơi xin ghi lịng tạc tình cảm công ơn này! Một lần nữa, xin chân thành cám ơn! Hà nội, ngày tháng năm 2020 Nguyễn Thị Sim LỜI CAM ĐOAN Tôi Nguyễn Thị Sim, nghiên cứu sinh khóa 35, Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Y sinh học di truyền, xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực hướng dẫn Cô Lương Thị Lan Anh Thầy Nguyễn Duy Bắc Công trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Người viết cam đoan Nguyễn Thị Sim DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh aCGH Array Comparative Genomic Hybridization ADO Allele Drop-Out bp Base pair CGH Comparative Genomic Hybridization CNV Copy number variation DNA Deoxyribo Nucleic Acid FISH Fluorescent In Situ Hybridization ICM Inner Cell Mass ICSI Intra Cytoplasmic Sperm Injection IU International Unit IUI Intra Uterine Insemination IVF In Vitro Fertiliztion KL-BoBs BACs - on - Beads NST NGS Next Generation Sequencing PGD Preimplantation genetic diagnosis PGS Preimplantation genetic screening PGT-A Preimplantation genetic testing for Aneuploidies PGT-M Preimplantation genetic testing for monogenic/single gene disorders Tiếng Việt Lai so sánh hệ gen kết hợp microarray Mất alen Cặp bazơ Lai so sánh hệ gen Biến thể số lượng Lai huỳnh quang chỗ Nguyên bào phôi Tiêm tinh trùng vào bào tương noãn Đơn vị quốc tế Bơm tinh trùng vào buồng tử cung Thụ tinh ống nghiệm Phương pháp KaryoLite BoBs Nhiễm sắc thể Giải trình tự gen hệ Chẩn đoán di truyền trước làm tổ Sàng lọc di truyền trước làm tổ Xét nghiệm di truyền trước làm tổ phát lệch bội nhiễm sắc thể Xét nghiệm di truyền trước làm tổ phát rối loạn đơn gen PGT-SR RNA TE WGA WHO Preimplantation genetic testing for chromosome structural rearrangements RiboNucleic Acid Trophectoderm Whole Genome Application World Health Organization Xét nghiệm di truyền trước làm tổ phát rối loạn cấu trúc nhiễm sắc thể Nguyên bào nuôi Khuếch đại hệ gen Tổ chức Y tế Thế giới MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tình hình vô sinh giới Việt Nam 1.1.1 Khái niệm vô sinh 1.1.2 Tình hình vơ sinh Thế giới Việt Nam 1.1.3 Điều trị vô sinh 1.2 Phương pháp thụ tinh ống nghiệm (IVF) 1.2.1 Khái niệm 1.2.2 Chỉ định 1.2.3 Quy trình kỹ thuật IVF 1.2.3.1 Chuẩn bị noãn 1.2.3.2 Cho noãn thụ tinh với tinh trùng phịng thí nghiệm 1.2.3.3 Chọn lựa phơi 14 1.2.3.4 Chuyển phôi vào buồng tử cung theo dõi kết 17 1.3 Các xét nghiệm di truyền trước làm tổ 18 1.3.1 PGT-A 18 1.3.2 PGT-SR 19 1.3.3 PGT-M 20 1.4 Kỹ thuật sinh thiết phôi 21 1.4.1 Quy trình sinh thiết phơi 21 1.4.2 Thời điểm sinh thiết phôi 22 1.5 Các kỹ thuật di truyền ứng dụng xét nghiệm di truyền trước làm tổ 25 1.5.1 Kỹ thuật lai huỳnh quanh chỗ (FISH) 25 1.5.2 Kỹ thuật lai so sánh hệ gen (CGH) 26 1.5.3 Kỹ thuật lai so sánh hệ gen kết hợp microarray (aCGH) 27 1.5.3.1 Nguyên lý hoạt động 27 1.5.3.2 Quy trình hoạt động 29 1.5.3.3 Ứng dụng aCGH sàng lọc phôi 30 1.5.4 Kỹ thuật giải trình tự gen hệ (NGS) 33 1.5.4.1 Khái niệm nguyên lí hoạt động 33 1.5.4.2 Quy trình hoạt động kỹ thuật NGS 34 1.6 Tình hình ứng dụng kỹ thuật NGS PGT giới Việt Nam 35 1.7 Tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể nỗn phơi 39 1.7.1 Tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể noãn 39 1.7.2 Tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể tiền nhân 39 1.7.3 Tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể phôi ngày 40 1.7.4 Tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể phôi nang 41 1.7.5 Tỷ lệ phôi thể khảm 42 1.7.6 Hiện tượng tự sửa chữa phôi lệch bội nhiễm sắc thể ngày 43 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45 2.1 Đối tượng nghiên cứu 45 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 45 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 45 2.2 Địa điểm nghiên cứu 45 2.3 Thời gian nghiên cứu 46 2.4 Phương pháp nghiên cứu 46 2.4.1 Thiết kế nghiên cứu 46 2.4.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 46 2.4.3 Các định nghĩa dùng nghiên cứu 47 2.4.4 Các biến số nghiên cứu 48 2.4.5 Các thiết bị hóa chất sử dụng nghiên cứu 51 2.4.6 Quy trình nghiên cứu 53 2.4.7 Sơ đồ nghiên cứu 69 2.5 Phương pháp xử lí số liệu 70 2.6 Sai số khống chế sai số 72 2.7 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 72 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 73 3.1 Hoàn thiện quy trình sàng lọc rối loạn 24 NST kỹ thuật NGS tế bào phôi IVF 73 3.1.1 Kết quy trình khuếch đại hệ gen từ tế bào phôi 73 3.1.2 Kết quy trình giải trình tự gen NGS 75 3.1.3 Kết trình tối ưu quy trình giải trình tự gen kit chạy mẫu nhỏ 79 3.2 Đánh giá độ xác kỹ thuật NGS so với kỹ thuật aCGH sàng lọc rối loạn 24 nhiễm sắc thể tế bào phôi 87 3.2.1 Kết định lượng DNA 87 3.2.2 Kết xét nghiệm kỹ thuật NGS kỹ thuật aCGH 88 3.2.3 Đánh giá độ xác NGS 93 3.3 Đánh giá kết sàng lọc phôi trước làm tổ kỹ thuật NGS 97 3.3.1 Đặc điểm bệnh nhân hiến phôi 97 3.3.2 Đặc điểm bất thường NST phôi 98 3.3.3 Mối liên quan tuổi mẹ tình trạng phơi 102 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 106 4.1 Hồn thiện quy trình sàng lọc rối loạn 24 NST kỹ thuật NGS tế bào phôi 107 4.1.1 Quy trình khuếch đại hệ gen (WGA) 109 4.1.2 Quy trình giải trình tự gen 112 4.2 Đánh giá độ xác kỹ thuật NGS so với kỹ thuật aCGH sàng lọc rối loạn 24 nhiễm sắc thể tế bào phôi 115 ... thiện quy trình sàng lọc rối loạn 24 nhiễm sắc thể kỹ thuật giải trình tự gen hệ (NGS) tế bào phôi Đánh giá độ xác kỹ thuật NGS so với kỹ thuật aCGH sàng lọc rối loạn 24 nhiễm sắc thể tế bào... aCGH việc phát rối loạn NST phôi [22],[23], [24] ,[25] ì tiến hành thực đề tài: ‘? ?Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen hệ để sàng lọc rối loạn 24 nhiễm sắc thể trước làm tổ? ?? với mục tiêu... BoBs Nhiễm sắc thể Giải trình tự gen hệ Chẩn đoán di truyền trước làm tổ Sàng lọc di truyền trước làm tổ Xét nghiệm di truyền trước làm tổ phát lệch bội nhiễm sắc thể Xét nghiệm di truyền trước làm