(Luận văn thạc sĩ) đánh giá khả năng chống oxi hóa, kháng viêm trên mô hình chuột swiss của cao chiết từ một số thực vật trong các bài thuốc trị gout cổ truyền

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN N u nT n Đ NH GI KHẢ N NG CH NG OXI H A KH NG VIÊM TRÊN M H NH CHU T SWISS CỦA CAO CHI T T M T S THỰC V T TRONG C C I THU C TR GOUT CỔ TRUY N LU N V N THẠC SĨ KHOA HỌC H N I - 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN N u nT n Đ NH GI KHẢ N NG CH NG OXI H A KH NG VIÊM TRÊN M H NH CHU T SWISS CỦA CAO CHI T T M T S THỰC V T TRONG C C I THU C TR GOUT CỔ TRUY N Chuy n ng nh: Sinh học th c nghi m Mã số: 8420101.14 LU N V N THẠC SĨ KHOA HỌC Cán ƣớn dẫn: TS Đỗ Min Hà H N I - 2020 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Đỗ Minh Hà, người thầy ln quan tâm, tận tình bảo, hướng dẫn tơi suốt q trình học tập thực khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Trịnh Hồng Thái, TS Trịnh Tất Cường giúp đỡ tạo điều kiện vật chất tinh thần suốt q trình tơi học tập làm việc phịng thí nghiệm Tơi xin gửi lời cảm ơn đến TS Lưu Thị Thu Phương BM Sinh lý học sinh học người, Th.S Nguyễn Thị Vân Khánh BM Sinh học Tế bào, CN Dương Đức Thiện giúp đỡ cho suốt trình thực luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô, anh chị bạn sinh viên làm việc học tập Phòng Proteomic Sinh học cấu trúc thuộc Phịng thí nghiệm Trọng điểm cơng nghệ Enzyme Protein Bộ môn Sinh lý học trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội giúp đỡ, hỗ trợ tơi nhiều trình học tập, làm việc thực luận văn Tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn tới Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzyme Protein, Trung tâm Khoa học Sự sống, Khoa sinh học, PTN Hóa dầu, Khoa Sinh học TT Khoa học vật liệu, Khoa Vật lý trường Đại học Khoa học Tự nhiên tạo điều kiện giúp hồn thành luận văn Tơi xin cảm ơn tồn thể anh chị bạn học viên lớp K26 cao học Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân bạn bè, người động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện cho suốt trình học tập, làm việc thực luận văn Tôi xin cảm ơn đề tài QG.18.11 tài trợ kinh phí cho nghiên cứu Hà Nội, tháng 02 năm 2020 Học viên Nguyễn Thị Ân MỤC LỤC MỞ ĐẦU Ch ng 1: T NG QUAN 1.1 nh gout 1.1.1 Khái quát chung b nh gout 1.1.2 Nguy n nhân v biểu hi n lâm s ng 1.1.2.1 Nguyên nhân 1.1.2.2 iểu hi n lâm s ng: 1.1.3 C chế sinh b nh: 1.1.3.1 C chế hình th nh acid uric 1.1.3.2 C chế gây vi m MSU b nh Gout 1.1.3.3 ROS v qu trình ho t h a th thể vi m NLRP3 10 1.1.4 C c h ớng điều trị hi n t i d a tr n c chế phân tử b nh 11 1.1.4.1 C c chất ức chế Xanthine oxidase 11 1.1.4.2 C c thuốc uricosuric – Thuốc lợi tiểu 11 1.1.4.3 C c thuốc kh ng vi m 11 1.2 Điều trị gout y học c truyền 12 1.2.1 C c b i thuốc dân gian dùng điều trị Gout 12 1.2.2 Một số lo i d ợc li u c c b i thuốc Nam đ ợc sử d ng điều trị gout 13 1.2.2.1 G m Gnetum parvifolium) 13 1.2.2.2 T a t Perilla ocymoides L) 14 1.2.2.3 Dâu tằm Morus alba) 15 1.3 C c hợp chất t nhi n điều trị gout 16 1.3.1 Alkaloid 16 1.3.2 Phenolic 18 Ch ng 2: NGUY N LI U VÀ PH NG PH P 21 2.1 Nguy n li u 21 2.1.1 V t li u nghi n cứu 21 2.1.2 H a chất 23 2.1.3 Thiết bị 24 2.2 Ph ng ph p: 25 2.2.1 T ch chiết m u d ợc li u: 25 2.2.2 S c ký mỏng Thin Layer Chromatography - TLC) 26 2.2.3 Ph ng ph p s c k lỏng ph khối l ợng Liquid chromatography - Mass spectrometry – LC - MS) 27 2.2.4 Định l ợng khả chống oxi h a t ng số ph ng ph p quét gốc t DPPH [42] 28 2.2.5 Gây b nh tr n m hình chuột Swiss v thử nghi m thuốc tr n chuột 29 2.2.6 Đ nh gi tình tr ng vi m tr n chuột th nghi m 29 2.2.7 Đ nh gi tình tr ng stress oxi h a tr n chuột th nghi m 31 2.2.7.1 Đ nh gi t nh tr ng stress oxi h a m u gan [56] 31 2.2.7.2 Đ nh gi t nh tr ng stress oxi h a m u m u [56] 32 2.2.8 Phân t ch số li u 33 Ch ng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Đ nh giá kết t ch chiết c c m u d ợc li u 34 3.1.1 X c định thành phần có dịch chiết d a vào ph hấp th 34 3.1.2 X c định thành phần có dịch chiết ph ng ph p S c ký mỏng (TLC): 36 3.1.3 X c định th nh phần c c c cao chiết ph ng ph p Thin layer chromatography (TLC): 38 3.1.4 Đ nh gi khả chống oxy h a c c m u dịch chiết 39 3.1.5 Định danh số ho t chất c cao ph ng ph p khối ph 39 3.2 Đ nh gi kết xây d ng m hình động v t bị gout 42 3.2.1 Chỉ số hình th i 42 3.2.2 Đ nh gi tình tr ng vi m m hình động v t đ ợc gây gout MSU 45 3.3 Đ nh gi t c động cao chiết l n động v t 46 3.3.1 Chỉ số hình th i 46 3.3.2 Đ nh gi tình tr ng vi m chuột uống cao chiết 48 3.3.3.Đ nh gi t c động cao chiết c c c quan chuột 49 3.4 Đ nh gi t c động cao chiết l n m hình động v t gout 49 3.4.1 Chỉ số hình th i 50 3.4.2 Đ nh gi tình tr ng stress oxy h a m hình chuột bị gây b nh gout đ ợc thử nghi m uống cao chiết 53 3.4.2.1 Đ nh gi h m l ợng MDA m u 53 3.4.2.2 Đ nh gi h m l ợng MDA m u m gan 54 3.4.2.3 Đ nh gi h m l ợng MDA m u m c chân tr i, chân phải55 3.4.3 Đ nh gi tình tr ng vi m m hình chuột bị gây b nh gout đ ợc thử nghi m uống cao chiết 58 KẾT LUẬN 60 KIẾN NGHỊ 61 TÀI LI U THAM KHẢO 62 DANH MỤC H NH Hình C chế hình th nh acid uric Hình C chế t c động MSU Hình G m Gnetum parvifolium) [6] 14 Hình Tía tơ (Perilla ocymoides L.) [6] 15 Hình Dâu tằm Morus alba) [6] 16 Hình Ho t t nh chống vi m số lo i alkaloids [72] 18 Hình ản ch y s c ký mỏng TLC 26 Hình S đồ cấu t o đ n giản h thống khối ph 28 Hình Ph hấp th dịch chiết 35 Hình 10 S c ký đồ TLC số dịch chiết với h dung m i TEAF 37 Hình 11 S c ký đồ TLC số dịch chiết với h dung m i CEF 37 Hình 12 ản s c ký th nh phần c dịch chiết, cao chiết T a t , Dâu tằm, G m với h dung m i CEF 38 Hình 13 S c ký đồ khối ph 41 Hình 14 C c ho t chất c cao chiết 42 Hình 15 Chân chuột tr ớc v sau ti m MSU 43 Hình 16 C c c quan nội t ng chuột th nghi m 49 DANH MỤC IỂU ĐỒ iểu đồ Nồng độ IL-1β huyết chuột tr n nh m ĐC SH, ĐC Âm v ĐC D ng 45 iểu đồ 2.Nồng độ IL-1β huyết chuột uống c c cao chiết 48 iểu đồ 3.H m l ợng MDA m u chuột 54 iểu đồ 4.H m l ợng MDA m u m gan chuột 55 iểu đồ H m l ợng MDA m u m c chân chuột 56 iểu đồ H m l ợng MDA m u m c chân tr i chuột 57 iểu đồ Nồng độ IL-1β huyết c c nh m chuột 58 DANH MỤC ẢNG ảng Ký hi u c c nh m chuột đ ợc sử d ng nghi n cứu 22 ảng H a chất sử d ng nghi n cứu 23 ảng Thiết bị đ ợc sử d ng nghi n cứu 24 ảng Hi u suất chống oxy h a c c m u dịch chiết 39 ảng Chỉ số cân nặng t i c c thời điểm th nghi m Đ n vị t nh: gam) 42 ảng K ch th ớc chân chuột t i c c thời điểm th nghi m Đ n vị t nh: mm3) 44 ảng Chỉ số cân nặng t i c c thời điểm th nghi m Đ n vị t nh: gram) 46 ảng K ch th ớc chân chuột t i c c thời điểm th nghi m Đ n vị t nh: mm3) 47 ảng Chỉ số cân nặng t i c c thời điểm th nghi m Đ n vị t nh: gram) 50 ảng 10 K ch th ớc chân chuột t i c c thời th nghi m Đ n vị t nh: mm) 52 DANH MỤC T VI T TẮT MSU Natri urat (monosodium urate) UA Axit uric (uric acid) SUA Axit uric huyết XOR xanthine oxidoreductase XDH xanthine dehydrogenase XO xanthine oxydase NO nitric oxide IL-1β Interleukin beta IL-8 Interleukin TNFα Yếu tố ho t tử khối u α CXCL-1 Chemokine ligand IL-6 Interleukin NLR Th thể d ng NOD (NOD-like receptor) CPPD Calcium pyrophosphate dehydrate TLRs Họ th thể d ng Toll (Toll-like receptor) ROS Gốc t chứa oxy NSAIDs Thuốc chống viêm không steroid HPLC S c ký lỏng hi u cao TLC S c ký mỏng MAPK mitogen-activated protein kinase NF-κ Nuclear factor kappa B - Yếu tố nhân kappa B MS Mass spectrometry - Ph ng ph p ph khối l ợng Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân Cao lốt Search Spectrum 1A 7.628 min, Scan: 157, Merged 93.1 1.241e+7 100% 75% 91.1 6.833e+6 50% 77.1 3.949e+6 25% 121.1 1.395e+6 67.1 1.263e+6 0% Match Match of 44 93.0 999 100% 75% 91.0 500 50% 79.0 320 25% 41.0 79 67.0 72 94.0 151 121.0 241 0% 50 R.Match: 874, F.Match: 874 100 150 (+)-3-carene 200 250 m/z Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân Search Spectrum 1A 8.956 min, Scan: 236, Merged 101.0 119454.291 100% 75% 73.1 74181.633 50% 25% 144.1 47568.677 55.1 20638.928 0% Match of 43.0 100% 961 Match 73.0 863 101.0 999 HO O 75% 25% O 144.0 471 50% OH 45.0 156 0% 50 R.Match: 793, F.Match: 780 100 150 200 2,4-dihydroxy-2,5-dimethylfuran-3(2H)-one 250 m/z Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân Search Spectrum 1A 17.222 min, Scan: 728, Merged 104.1 2.521e+6 100% 75% 91.1 1.405e+6 50% 105.1 890313.535 25% 55.1 358021.921 164.1 506512.626 103.1 328209.632 0% Match Match of 19 104.0 999 100% O 75% 91.0 632 O 50% 105.0 382 25% 51.0 111 77.0 150 103.0 87 164.0 368 133.0 112 0% 50 R.Match: 881, F.Match: 845 100 150 methyl 3-phenylpropanoate 200 250 m/z Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân Search Spectrum 1A 19.339 min, Scan: 854, Merged 105.1 7.967e+6 100% 161.2 6.142e+6 75% 91.1 3.769e+6 50% 25% 92.1 2.103e+6 55.2 1.162e+6 95.1 425947.943 133.1 1.124e+6 204.3 746552.391 0% Match Match of 95 161.0 999 119.0 938 100% 75% 93.0 507 50% 41.0 308 25% 43.0 118 91.0 308 77.0 161 120.0 232 136.0 107 162.0 137 204.0 199 189.0 59 0% 50 R.Match: 875, F.Match: 875 100 150 Copaene 200 250 m/z Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân Search Spectrum 1A 20.128 min, Scan: 901, Merged 91.1 5.013e+6 100% 133.1 3.844e+6 75% 67.1 2.452e+6 50% 53.2 1.311e+6 25% 107.1 2.173e+6 161.2 1.295e+6 95.1 1.104e+6 52.2 266030.980 0% Match Match of 100 93.0 999 100% 41.0 769 75% 133.0 921 79.0 763 105.0 623 77.0 439 50% 106.0 342 53.0 299 95.0 216 25% 27.0 103 107.0 483 68.0 95 134.0 244 161.0 330 162.0 94 122.0 87 189.0 166 0% 50 R.Match: 934, F.Match: 934 100 150 beta-caryophyllene 200 250 m/z Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân Search Spectrum 1A 21.773 min, Scan: 999, Merged 121.1 433403.241 100% 75% 50% 134.1 98952.282 25% 91.1 50773.668 194.1 66439.379 0% Match Match of 121.0 999 100% O O 75% O 50% 25% 91.0 77 194.0 243 134.0 166 0% 50 100 R.Match: 798, F.Match: 784 150 200 methyl 3-(4-methoxyphenyl)propanoate 250 m/z Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân Search Spectrum 1A 23.586 min, Scan: 1107, Merged 208.2 4.457e+7 165.1 3.907e+7 100% 75% 137.1 2.732e+7 50% 91.1 1.793e+7 25% Match 209.2 1.539e+7 134.1 7.514e+6 63.1 5.714e+6 0% 133.1 1.776e+7 179.1 3.783e+6 S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S SS S S S S Match of 208.0 999 100% 75% 193.0 530 O 50% 15.0 338 25% 165.0 373 69.0 294 39.0 167 79.0 165 105.0 169 137.0 228 O 162.0 179 134.0 83 209.0 O 137 0% 50 R.Match: 934, F.Match: 929 100 150 200 (E)-1,2,4-trimethoxy-5-(prop-1-en-1-yl)benzene 250 m/z Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân Spectrum 1A 26.089 min, Scan: 1256, Merged 86.1 134876.857 100% 75% 50% 85.1 36374.293 25% 208.2 15429.745 71.1 11742.532 0% 50 100 150 200 250 m/z Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân Search Spectrum 1A 28.037 min, Scan: 1372, Merged 95.1 566048.204 100% 75% 71.1 319447.338 123.1 287619.195 50% 25% 111.1 129832.590 53.2 108671.602 0% Match of 100 43.0 81.0 100% 965 999 Match 41.0 811 123.0 892 OH 71.0 748 75% 83.0 467 50% 79.0 339 53.0 227 25% 27.0 89 65.0 82 109.0 263 93.0 136 278.0 113 137.0 91 0% 50 100 R.Match: 858, F.Match: 850 150 Phytol 200 250 m/z Luận văn thạc sĩ Cao Dâ Nguyễn Thị Ân ắm Search Spectrum 1A 17.556 min, Scan: 748, Merged 124.0 1.727e+7 100% 78.1 1.191e+7 75% 123.0 1.004e+7 50% 77.1 4.861e+6 25% 125.1 1.370e+6 79.1 1.359e+6 0% Match Match of 124.0 999 100% OH 75% OH 123.0 541 78.0 454 50% 25% 51.0 131 77.0 172 107.0 111 0% 50 R.Match: 881, F.Match: 864 100 Homocatechol 150 200 250 m/z Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân Search Spectrum 1A 23.568 min, Scan: 1106, Merged 87.1 8.878e+6 100% 75% 50% 85.1 2.976e+6 25% 59.1 1.149e+6 116.1 1.103e+6 0% Match Match of 73.0 999 100% OH 75% 50% HO OH HO OH OH 25% 43.0 164 87.0 231 71.0 107 116.0 68 0% 50 R.Match: 763, F.Match: 761 100 150 methyl inositol 200 250 m/z Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân Search Spectrum 1A 26.505 min, Scan: 1281, Merged 73.1 4.625e+6 100% 55.2 3.162e+6 75% 71.1 2.012e+6 50% 61.1 958975.957 25% 129.1 1.954e+6 213.3 934466.708 157.1 115.1 810354.104 845473.205 0% Match of 12 43.0 100% 949 Match 73.0 999 O 41.0 790 OH 75% 129.0 441 50% 69.0 363 25% 29.0 259 27.0 107 61.0 228 85.0 241 115.0 145 70.0 101 143.0 164 199.0 186 171.0 81 242.0 159 0% 50 R.Match: 789, F.Match: 789 100 150 Pentadecanoic acid 200 250 m/z Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân Search Spectrum 1A 70.1 100% 3.587e+6 29.039 min, Scan: 1432, Merged 75% 149.0 2.296e+6 50% 57.2 1.368e+6 112.1 1.300e+6 167.1 1.154e+6 25% 56.2 113.2 429594.891 336228.272 0% Match of 70.0 100% 999 Match O 112.0 762 75% 149.0 671 O 261.0 667 O 50% 57.0 470 O 71.0 323 25% 43.0 195 42.0 57 113.0 256 82.0 65 279.0 185 150.0 72 0% 50 100 R.Match: 724, F.Match: 724 150 200 Dioctyl isophthalate 250 300 350 m/z Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ân ... m tr n m hình chuột Swiss cao chiết th c v t t số b i thuốc trị Gout c truyền? ?? nhằm: T o cao, t ch chiết v phân t ch th nh phần c dịch chiết số d ợc li u đ ợc sử d ng điều trị gout c truyền Thử... GI KHẢ N NG CH NG OXI H A KH NG VIÊM TRÊN M H NH CHU T SWISS CỦA CAO CHI T T M T S THỰC V T TRONG C C I THU C TR GOUT CỔ TRUY N Chuy n ng nh: Sinh học th c nghi m Mã số: 8420101.14 LU N V N THẠC... số hình th i 46 3.3.2 Đ nh gi tình tr ng vi m chuột uống cao chiết 48 3.3.3.Đ nh gi t c động cao chiết c c c quan chuột 49 3.4 Đ nh gi t c động cao chiết l n m hình động v t gout