Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8683-17:2017 quy định quy trình giữ giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica được dùng để sản xuất và kiểm nghiệm vắc xin. Mời các bạn cùng tham khảo chi tiết nội dung tiêu chuẩn.
TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8683-17:2017 GIỐNG VI SINH VẬT THÚ Y - PHẦN 17: QUY TRÌNH GIỮ GIỐNG VI KHUẨN BORDETELLA BRONCHISEPTICA Master seed of microorganisms for veterinary use - Part 17: The procedure for preservation Bordetella bronchiseptica bacteria Lời nói đầu TCVN 8683-17 : 2017 Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y TW1 - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Bộ TCVN 8683 Giống vi sinh vật thú y - Quy trình giữ giống gồm phần: - TCVN 8683-1 : 2011, Phần 1: Quy trình giữ giống vi rút dịch tả lợn qua thỏ, chủng C; - TCVN 8683-2 : 2011, Phần 2: Quy trình giữ giống vi rút cường độc dịch tả lợn, chủng Thạch môn; - TCVN 8683-3 : 2011, Phần 3: Quy trình giữ giống vi rút Newcastle, chủng hệ I; - TCVN 8683-4 : 2011, Phần 4: Quy trình giữ giống vi rút dại chủng cố định; - TCVN 8683-5 : 2011, Phần 5: Quy trình giữ giống vi khuẩn đóng dấu lợn nhược độc, chủng VR2; - TCVN 8683-6 : 2011, Phần 6: Quy trình giữ giống vi khuẩn nhiệt thán vơ độc, chủng 34 F2; - TCVN 8683-7 : 2011, Phần 7: Quy trình giữ giống vi khuẩn nhiệt thán cường độc, chủng 17JB; - TCVN 8683-8 : 2011, Phần 8: Quy trình giữ giống vi khuẩn phó thương hàn lợn, chủng SC 1; SC.2; SC.4 SC.5; - TCVN 8683-9 : 2011, Phần 9: Quy trình giữ giống vi khuẩn tụ huyết trùng trâu bò, chủng PB.1, PB.2, P.52, PBU.1 PBU.2; - TCVN 8683-10 : 2011, Phần 10: Quy trình giữ giống vi khuẩn tụ huyết trùng lợn nhược độc, chủng AVPS3; - TCVN 8683-11 : 2011, Phần 11: Quy trình giữ giống vi khuẩn tụ huyết trùng lợn, chủng PS1; - TCVN 8683-12 : 2011, Phần 12: Quy trình giữ giống vi khuẩn tụ huyết trùng gà, chủng PA 1, PA.2; - TCVN 8683-13 : 2011, Phần 13: Quy trình giữ giống vi khuẩn đóng dấu lợn, chủng E.37, E.47 E.80; - TCVN 8683-14 : 2011, Phần 14: Quy trình giữ giống vi khuẩn ung khí thán, chủng CL.C1 CL.C2; - TCVN 8683-15 : 2017, Phần 15: Quy trình giữ giống vi rút viêm gan vịt cường độc; - TCVN 8683-16 :2017, Phần 16: Quy trình giữ giống vi rút gumboro nhược độc chủng 2512; -TCVN 8683-17 : 2017, Phần 17: Quy trình giữ giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica GIỐNG VI SINH VẬT THÚ Y - PHẦN 17: QUY TRÌNH GIỮ GIỐNG VI KHUẨN BORDETELLA BRONCHISEPTICA Master seed of microorganisms for veterinary use - Part 17: The procedure for preservation Bordetella bronchiseptica bacteria CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn liên quan đến vật liệu, thiết bị thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn đưa hết tất vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập thao tác an tồn sức khỏe thích hợp xác định khả áp dụng giới hạn quy định trước sử dụng tiêu chuẩn 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định quy trình giữ giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica dùng để sản xuất kiểm nghiệm vắc xin Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn khơng ghi năm cơng bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 8684 : 2011, vắc xin chế phẩm sinh học dùng thú y - Phép thử độ khiết Nguyên tắc Lấy giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica giữ dạng đông khô để kiểm tra đặc tính sinh học giống phương pháp phân tích phịng thí nghiệm Sau giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica tăng cường qua lợn, phân lập lại vi khuẩn từ máu tim lợn chết có triệu chứng lâm sàng bệnh Ni cấy vi khuẩn mơi trường thích hợp, chọn khuẩn lạc điển hình để đơng khơ bảo quản quản nhiệt độ °C đến °C Vật liệu thuốc thử 4.1 Vật liệu 4.1.1 Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica, giống gốc, đáp ứng u cầu độ vơ trùng, tính độc, tính gây miễn dịch, nhận dạng xác định đặc tính ni cấy 4.1.2 Thỏ trọng lượng từ 1,8 kg đến kg, mẫn cảm, khỏe mạnh, khơng có kháng thể Bordetella bronchiseptica 4.1.3 Lợn trọng lượng từ kg đến 10 kg, khỏe mạnh, khơng có kháng thể Bordetella bronchiseptica 4.1.4 Chuột nhắt trắng trọng lượng từ 18 g đến 20g, khỏe mạnh 4.2 Thuốc thử 4.2.1 Kháng huyết 4.2.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Blood agar base (BAB), Brain heart Infusion (BHI) 4.2.3 A xít clohydric 1N (HCI 1N) 4.2.4 Các loại muối: Natri clorua (NaCI), Kali clorua (KCI), Natri hiđro photphat (Na2HPO4), Mono kali photphat (KH2PO4) 4.2.5 Giấy quỳ kiểm tra pH 4.2.6 Formaldehyde solution 37% (HCHO) 4.2.7 Huyết ngựa 4.2.8 Methionate 4.2.9 Dung dịch PBS pH 7,2 Thiết bị, dụng cụ 5.1 Tủ ấm CO2 trì nhiệt độ 37 °C 5.2 Tủ lạnh (có thể trì nhiệt độ từ °C đến °C), tủ lạnh sâu (có thể trì nhiệt độ âm 80 °C) 6.3 Tủ âm sâu có nhiệt độ âm sâu tới âm 20 °C 5.4 Máy lắc trộn (vortex mixer) có tốc độ lắc từ 50 rpm đến 2400 rpm 5.5 Máy ly tâm, ly tâm với gia tốc 12 000 g 5.6 Nồi cách thủy trì nhiệt độ 100 °C, 110 °C, 121 °C thời gian 10 min, 15 min, 20 5.7 Micropipet, dung tích từ 0,5 μl đến 10 μl, từ 5μl đến 50 μl, từ 50 μl đến 200 μl, từ100 μl đến 1000 μl 5.8 Micropipet đa kênh, dung tích từ μl đến 50 μl, từ 50 μl đến 200 μl 5.9 Đĩa lồng, ống nghiệm thủy tỉnh vô trùng 5.10 Đĩa nhựa 96 giếng đáy chữ U 5.11 Bình tam giác 100 ml, 200 ml vơ trùng 5.12 Dao, kéo, panh kẹp vô trùng 5.13 Bơm kim tiêm lần ml, 10 ml 5.14 Cân phân tích có dải đo từ g đến 30 g 5.15 Máy đơng khơ có nhiệt độ âm sâu tới âm 80 °C 5.16 Ống đông khô giống vô trùng Yêu cầu giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica 6.1 Yêu cầu kỹ thuật ống giống - Lọ kín, không rạn nứt, đảm bảo chân không - Hợp chất ống giống xốp, màu đồng nhất, độ ẩm 4% hịa tan hồn tồn nước sinh lý sau 6.2 Yêu cầu sinh học giống - Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica nhận dạng phương pháp ngưng kết nhanh phiến kính phương pháp ngưng kết trực tiếp ống nghiệm (kháng nguyên ngưng kết hình mạng nhện đáy giếng) - Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica xác định đặc tính ni cấy mơi trường BHI (4.2.2) có bổ sung 5% huyết ngựa, vi khuẩn làm cho môi trường nuôi cấy đục vẩn mây, không váng, không cặn - Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica xác định hình thái: Vi khuẩn có dạng trực khuẩn cầu trực khuẩn nhỏ, gram âm, kích thước 1,0 x 0,3 μm, có khả di động - Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica xác định đặc tính sinh hóa: Vi khuẩn khơng lên men đường, dương tính với phản ứng Oxidase, Catalase, Urease Trên mơi trường thạch MacConkey có bổ sung 1% đường Glucose, vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc nhỏ, gọn, bóng láng có màu xám xanh Trên mơi trường thạch máu, vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc nhỏ, bóng láng, rìa gọn - Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica kiểm tra tính độc, tính gây miễn dịch động vật thí nghiệm, giống đạt yêu cầu động vật thí nghiệm bảo hộ khơng có triệu chứng bệnh tích bệnh viêm teo mũi truyền nhiễm Cách tiến hành 7.1 Nhận dạng Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica (4.1.1) nhận dạng phương pháp sau - Ngưng kết nhanh phiến kính (kháng nguyên vi khuẩn sống) - Ngưng kết chậm đĩa 96 giếng (kháng nguyên xử lý axit) 7.1.1 Chuẩn bị giống vi khuẩn - Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica (4.1.1) đơng khơ hồn ngun 0,2 ml nước thịt Ria lên thạch BAB (4.2.2) có bổ sung 5% huyết ngựa, ủ tủ ấm (5.1) 24 h Chọn khuẩn lạc cấy vào môi trường BHI (4.2.2) có bổ sung 5% huyết ngựa, ủ tủ ấm (5.1) 24 h (canh trùng gốc) - Kháng nguyên, kháng huyết chuẩn bị sau: + Chuẩn bị kháng huyết thanh: Lấy 0,01 ml canh trùng giống gốc ria thạch BAB (4.2.2) có bổ sung 5% máu thỏ, ủ tủ ấm (5.1) 18 h đến 20 h Rửa mặt thạch BAB nước sinh lý có 0,3% formalin, thu hoạch huyễn dịch (kháng nguyên chết) Pha loãng huyễn dịch để đạt mật độ vào khoảng 10 x 109 CFU (phương pháp so màu) Tiêm huyễn dịch pha loãng theo đường tĩnh mạch cho thỏ (4.1.2) với liều 0,2 ml, 0,5 ml, ml, 1,5 ml, ml, liều tiêm cách ngày đến ngày tuần sau mũi tiêm huyễn dịch pha loãng cuối cùng, tiêm 0,5 ml kháng nguyên sống vào da bắp thịt cho thỏ 10 ngày sau tiêm kháng nguyên sống, thỏ lấy máu kiểm tra hiệu giá kháng thể Kháng huyết bảo quản tủ âm sâu (5.3), lượng nhỏ bảo quản tủ lạnh dương (5.2) Kháng huyết bổ sung 1/10000 methiolat (4.2.8) + Chuẩn bị kháng nguyên: Lấy 0,01 ml canh trùng giống gốc ria thạch BAB (4.2.2) có bổ sung 5% máu thỏ, ủ tủ ấm (5.1) 18 h đến 20 h Rửa mặt thạch BAB ml nước sinh lý có 0,3% formalin, thu huyễn dịch Sau ly tâm huyễn dịch với gia tốc 12000 rpm 20 tủ lạnh (5.2) Bỏ phần nước trong, cặn vi khuẩn hoàn nguyên 2,5 ml HCI 1N saline (0,85% nước sinh lý dung dịch HCI 1N), ủ qua đêm Huyễn dịch ly tâm lần thứ hai, loại bỏ phần nước trong, cặn tế bào rửa lần PBS (4.2.9) Hoàn nguyên cặn tế bào PBS (4.2.9) cho cuối huyễn dịch chứa 1010 CFU/ml 7.1.2 Cách tiến hành - Cho 50 μl nước sinh lý vào giếng bố trí A1 - D12 - Tiếp tục cho 50 μl kháng nguyên vào A1, B1 pha loãng theo số 2, dãy C1 - D12 dùng làm đối chứng - Ủ tủ ấm (5.1) 24 h đọc kết quả: + Phản ứng âm tính: Nếu kháng nguyên lắng xuống đáy giếng thành cục tròn, nước + Phản ứng dương tính: Nếu kháng ngun ngưng kết hình mạng nhện đáy giếng, hiệu giá ngưng kết đọc giếng ngưng kết cuối 7.2 Đặc tính ni cấy - Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica (4.1.1) đông khô hoàn nguyên 0,2 ml nước thịt - Cấy 0,01 ml vi khuẩn hoàn nguyên vào đĩa thạch chocolate bổ sung NAD 5%, ủ tủ ấm 37 °C (5.1) 24 h, sau chọn khuẩn lạc điển hình để cấy vào mơi trường nước thịt BHI (4.2.2) có bổ sung 5% huyết ngựa, pH từ 7,2 đến 7,4, yếm khí tùy tiện, ủ tủ ấm (5.1) 20 h đến 24 h - Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica (4.1.1) đạt tiêu nuôi cấy làm cho môi trường nuôi cấy đục vẩn mây, khơng váng, khơng cặn 7.3 Hình thái vi khuẩn Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica (4.1.1) hoàn nguyên 0,2 ml nước thịt Ria 0,01 ml huyễn dịch giống vi khuẩn hồn ngun lên thạch máu có bổ sung 1% đường Glucose, ủ tủ ấm (5.1) 24 h Chọn khuẩn lạc điển hình, cấy vào mơi trường BHI có bổ sung 5% huyết ngựa, ủ tủ ấm (5.1) 24 h Ria canh khuẩn lên thạch máu có bổ sung 1% đường Glucose, ủ tủ ấm (5.1) 24 h Làm tiêu nhuộm Gram để kiểm tra hình thái Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica (4.1.1) đạt tiêu hình thái có dạng trực khuẩn cầu trực khuẩn nhỏ, gram âm, kích thước 1,0 x 0,3 μm, có khả di động 7.4 Đặc tính sinh hóa Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica (4.1.1) hoàn nguyên 0,2 ml nước thịt Ria 0,01 ml huyễn dịch giống vi khuẩn hoàn ngun lên mơi trường thạch MacConkey có bổ sung 1% đường Glucosse, ủ tủ ấm (5.1) 24 h, vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc nhỏ, gọn, bóng láng có màu xám xanh Ria 0,01 ml huyễn dịch giống vi khuẩn hồn ngun lên mơi trường thạch máu, ủ tủ ấm (5.1) 24 h, vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc nhỏ, bóng láng, rìa gọn Vi khuẩn khơng lên men đường, dương tính với phản ứng Oxidase, Catalase, Urease 7.5 Kiểm tra tính độc 7.5.1 Chuẩn bị động vật - 02 lợn (4.1.3) - 02 thỏ (4.1.2) - 05 chuột nhắt trắng (4.1.4) 7.5.2 Chuẩn bị giống vi khuẩn Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica (4.1.1) hoàn nguyên 0,2 ml nước thịt Ria huyễn dịch giống vi khuẩn hoàn nguyên lên thạch máu có bổ sung 1% đường Glucose, ủ tủ ấm (5.1) 24 h Chọn khuẩn lạc điển hình, cấy vào mơi trường BHI (4.2.2) có bổ sung 5% huyết ngựa, ủ tủ ấm (5.1) 24 h Đếm số xác định mật độ vi khuẩn pha loãng đến nồng độ cần tiêm 7.5.3 Cách tiến hành - Tiêm ml (tương đương với liều 109 CFU/ml) huyễn dịch vi khuẩn pha loãng (7.5.2) cho lợn theo đường da Lợn tiêm huyễn dịch vi khuẩn chết có triệu chứng đặc trưng bệnh viêm teo mũi (thường khịt mũi chảy nước mũi từ dịch màu sang màu đục, màu vàng màu hồng tùy theo giai đoạn phát triển bệnh), sống mũi sưng hai bên Nếu lợn bị viêm bên mũi bị vẹo sang bên bị viêm teo, teo hoàn toàn mũi lợn bị ngắn lại hàm ngắn hàm dưới, có trường hợp lợn bị kèm viêm phổi, ho nhiều thời tiết thay đổi, trời rét, lợn ăn thức ăn khơ có bụi - Tiêm ml (tương đương với liều 109 CFU/ml) huyễn dịch vi khuẩn pha loãng (7.5.2) cho thỏ theo đường da Thỏ tiêm huyễn dịch chết có triệu chứng đặc trưng bệnh viêm teo mũi (chảy nước mũi, hắt hơi, khó thở) - Tiêm 0,2 ml (tương đương với liều 109 CFU/0,2 ml) huyễn dịch vi khuẩn pha loãng (7.5.2) cho chuột nhắt trắng theo đường da Chuột tiêm huyễn dịch chết có triệu chứng đặc trưng bệnh viêm teo mũi (chảy nước mũi, hắt hơi, khó thở) 7.6 Kiểm tra tính gây miễn dịch 7.6.1 Chuẩn bị động vật Chuẩn bị thỏ (4.1.2) 7.6.2 Chuẩn bị canh khuẩn vô hoạt Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica (4.1.1) hoàn nguyên 0,2 ml nước thịt Ria huyễn dịch giống vi khuẩn hoàn nguyên lên thạch máu có bổ sung 1% đường Glucose, ủ tủ ấm (5.1) 24 h Chọn khuẩn lạc điển hình, cấy vào mơi trường BHI (4.2.2) có bổ sung 5% huyết ngựa, ủ tủ ấm (5.1) 24 h Đếm số xác định mật độ vi khuẩn cho canh khuẩn đạt khoảng 1010 CFU/ml Tiến hành vô hoạt canh khuẩn formol từ 0,2% đến 0,4% Để nhiệt độ phòng ngày đến ngày 7.6.3 Cách tiến hành Tiêm 1ml (tương đương với liều 109 CFU/ml) canh khuẩn vô hoạt (7.6.2) cho thỏ (4.1.2) theo đường da thỏ đổi chứng tiêm PBS (4.2.9) với liều lượng đường tiêm tiêm canh khuẩn vô hoạt Sau 14 ngày thỏ miễn dịch thỏ đối chứng tiêm mũi thứ hai với liều lượng đường tiêm mũi thứ 21 ngày sau mũi tiêm thứ hai, thỏ miễn dịch thỏ đối chứng thử thách với x 107 CFU vi khuẩn Bordetella bronchiseptica cường độc 7.6.4 Đọc kết Giống Bordetella bronchiseptica đạt tiêu chuẩn nếu: Ít 2/3 thỏ miễn dịch sống 2/3 thỏ đối chứng chết có triệu chứng đặc trưng bệnh viêm teo mũi 7.7 Bồi dưỡng giống vi khuẩn 7.7.1 Chuẩn bị động vật Chuẩn bị 03 lợn (4.1.3) 7.7.2 Chuẩn bị giống vi khuẩn Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica (4.1.1) hoàn nguyên 0,2 ml nước thịt Ria huyễn dịch giống vi khuẩn hoàn nguyên lên thạch máu có bổ sung 1% đường Glucose, ủ tủ ấm (5.1) 24 h Chọn khuẩn lạc điển hình, cấy vào mơi trường BHI có bổ sung 5% huyết ngựa, ủ tủ ấm (5.1) 24 h 7.7.3 Cách tiến hành 7.7.3.1 Ria 0,01 ml canh khuẩn lên thạch máu có bổ sung 1% đường Glucose, ủ tủ ấm (5.1) 24 h Làm tiêu nhuộm Gram để kiểm tra hình thái 7.7.3.2 Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn nấm mốc theo TCVN 8684 : 2011 7.7.3.3 Tiêm cho - lợn (4.1.3), ml (tương đương với liều 10 10 CFU/ml) theo đường da 7.7.3.4 Thu hoạch máu tim lợn chết có triệu chứng đặc trưng bệnh viêm teo mũi, khoảng 20 h đến 96 h sau tiêm 7.7.3.5 Ria 0,01 ml máu tim lên thạch máu có bổ sung 1% đường Glucose, ủ tủ ấm (5.1) 18 h đến 24 h Chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào môi trường BHI lặp lại bước từ 7.7.3.1 đến 7.7.3.5 7.7.3.6 Cấy máu tim lên thạch thạch máu có bổ sung 1% đường Glucose, ủ tủ ấm (5.1) 18 h đến 20 h 7.7.3.7 Chọn khuẩn lạc điển hình cấy lên thạch máu có bổ sung 1% đường Glucose, ủ tủ ấm (5.1) 24 h 7.7.3.8 Rửa mặt thạch 5ml huyết ngựa, thu huyễn dịch, chia ống đông khô giống (5.16), ống 0,2 ml, đông khô 7.7.3.9 Chạy đơng khơ theo quy trình máy đơng khơ (5.15) Kiểm tra ống giống vi khuẩn sau đông khơ 8.1 Kiểm tra đặc tính kỹ thuật ống giống - Cảm quan: Quan sát mắt thường, ống giống vi khuẩn coi đạt yêu cầu lọ kín, khơng rạn nứt, chế phẩm xốp, màu đồng - Chân không: sử dụng máy đo chân không, ống giống vi khuẩn coi đạt yêu cầu phát huỳnh quang màu ánh tím - Độ ẩm: Sử dụng máy đo độ ẩm, ống giống vi khuẩn coi đạt yêu cầu độ ẩm 4% - Độ hòa tan: ống giống vi khuẩn coi đạt u cầu hịa tan hồn tồn nước sinh lý sau có lắc nhẹ 8.2 Kiểm tra đặc tính sinh học giống vi khuẩn Đạt tiêu mục Bao gói, bảo quản ống giống vi khuẩn sau đơng khơ Chọn ống giống đạt tiêu mục để dán nhãn, bao gói bảo quản: 9.1 Dán nhãn - Các ống giống vi khuẩn phải dán nhãn - Nhãn phải có thơng tin sau: + Nơi sản xuất + Tên giống + Số lô ngày tháng năm sản xuất + Người thực + Điều kiện bảo quản 9.2 Bao gói bảo quản Ống giống bao gói giấy, để túi Polyeste giữ nhiệt độ °C đến °C năm Thư mục tài liệu tham khảo [1] OIE Terrestrial Manual 2012 (Version adopted in May 2012): Chapter 2.8.2 Atrophic rhinitis of swine (Version adopted in May 2012) [2] ASEAN Standards for Animal Vaccines (Second Edition): Requirements for Bordetella bronchiseptica Bacterin ... dụng Tiêu chuẩn quy định quy trình giữ giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica dùng để sản xuất kiểm nghiệm vắc xin Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. .. bronchiseptica đạt tiêu chuẩn nếu: Ít 2/3 thỏ miễn dịch sống 2/3 thỏ đối chứng chết có triệu chứng đặc trưng bệnh viêm teo mũi 7.7 Bồi dưỡng giống vi khuẩn 7.7.1 Chuẩn bị động vật Chuẩn bị 03 lợn... mũi (chảy nước mũi, hắt hơi, khó thở) 7.6 Kiểm tra tính gây miễn dịch 7.6.1 Chuẩn bị động vật Chuẩn bị thỏ (4.1.2) 7.6.2 Chuẩn bị canh khuẩn vô hoạt Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica (4.1.1)