Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8683-5:2011. Tiêu chuẩn trình bày về giống vi sinh vật thú y – Phần 5: Quy trình giữ giống vi khuẩn đóng dấu lợn nhược độc, chủng VR2. Mời các bạn cùng tham khảo để nắm bắt nội dung chi tiết.
TCVN TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8683-5:2011 Xuất lần GIỐNG VI SINH VẬT THÚ Y – PHẦN 5: QUY TRÌNH GIỮ GIỐNG VI KHUẨN ĐĨNG DẤU LỢN NHƯỢC ĐỘC, CHỦNG VR2 Master seed of microorganisms for veterinary use – Part 5: The procedure for preservation of Erysipelothrix rhusiopathiae VR2 strain, attenuated HÀ NỘI 2011 TCVN 8683-5:2011 Lời nói đầu TCVN 8683-5:2011 chuyển đổi từ 10 TCN 229:1995 thành tiêu chuẩn quốc gia theo quy định khoản Điều 69 Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật điểm a khoản Điều Nghị định số 127/2007/NĐ-CP ngày 01/8/2007 Chính phủ quy định chi tiết thi hành số điều Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật; TCVN 8683-5:2011 Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố TCVN 8683-5:2011 TIỂU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8683-5:2011 Giống vi sinh vật thú y – Phần 5: Quy trình giữ giống vi khuẩn đóng dấu lợn nhược độc, chủng VR2 Master seed of microorganisms for veterinary use – Part 5: The procedure for preservation of Erysipelothrix rhusiopathiae VR2 strain, attenuated CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn liên quan đến vật liệu, thiết bị thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn đưa hết tất vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập thao tác an tồn sức khỏe thích hợp xác định khả áp dụng giới hạn quy định trước sử dụng tiêu chuẩn Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn áp dụng cho việc giữ giống vi khuẩn đóng dấu lợn nhược độc, chủng VR2 dùng để sản xuất vắc xin đóng dấu lợn nhược độc, vắc xin Tụ - Dấu - 2 Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm cơng bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 8684:2011, Vắc xin chế phẩm sinh học dùng thú y – Phép thử độ khiết Yêu cầu giống vi sinh vật 3.1 Nhận dạng 3.1.1 Chuẩn bị động vật TCVN 8683-5:2011 Chuẩn bị thỏ mẫn cảm, khỏe mạnh, có khối lượng từ 1,5 kg đến 2,0 kg 3.1.2 Chuẩn bị giống vi khuẩn Chọn khuẩn lạc, cấy vào môi trường BHI có bổ sung % huyết ngựa, ủ 37 0C 24 h Kháng nguyên, kháng huyết chuẩn bị sau: – Chuẩn bị kháng huyết thanh: Canh khuẩn cấy thạch BAB có bổ sung % huyết ngựa, ủ 37 0C 18 h đến 20 h Rửa mặt thạch nước sinh lý có bổ sung 0,3 % formalin (PBS), thu hoạch huyễn dịch Đếm số tế bào cho huyễn dịch đạt mật độ khoảng x 10 CFU/ml đến x 109 CFU/ml Thỏ tiêm vào da với liều ml Sau tuần, thỏ tiêm tiếp với liều 0,5 ml; ml; 1,5 ml; ml; 2.5 ml; ml kháng nguyên chết vào tĩnh mạch tai thỏ, lần cách ngày đến ngày Một tuần sau mũi tiêm canh khuẩn chết cuối cùng, thỏ tiêm vào tĩnh mạch tai với liều 0,5 ml kháng nguyên sống tương ứng Thỏ lấy máu, chắt huyết kiểm tra hiệu giá kháng thể 10 ngày sau tiêm mũi cuối Hiệu giá phải lớn 1/512 lấy tồn máu Huyết bảo quản – 20 0C, lượng nhỏ bảo quản nhiệt độ 0C Huyết bổ sung 1/10000 merthiolat – Chuẩn bị kháng nguyên: Canh khuẩn cấy thạch BAB có bổ sung huyết ngựa % ủ 37 0C qua đêm Thu hoạch nước muối sinh lý (PBS) Huyễn dịch diệt 0,3 % formol, sau ly tâm từ 1000 vòng đến 2000 vòng 15 0C làm sạch, hút bỏ nước bảo quản – 20 0C Kháng nguyên sử dụng kháng nguyên toàn thân Cần đảm bảo mật độ vi khuẩn từ x 107 CFU/ml đến x 107 CFU/ml 3.1.3 Cách tiến hành Phản ứng tiến hành đĩa 96 giếng đáy tròn Cho 50 µl nước sinh lý vào giếng bố trí A1 - D12 Tiếp tục cho 50 µl kháng nguyên vào A1, B1 pha loãng theo số 2 dãy C1 - D12 dùng làm đối chứng hồng cầu Ủ 37 0C 24 h đọc kết Phản ứng âm tính kháng nguyên lắng xuống đáy giếng thành cục tròn, nước Phản ứng dương tính kháng nguyên ngưng kết hình mạng nhện đáy giếng, hiệu giá ngưng kết đọc giếng ngưng kết cuối 3.2 Đặc tính ni cấy TCVN 8683-5:2011 Vi khuẩn đóng dấu lợn thuộc loại vi khuẩn yếm khí tùy tiện, mọc tốt loại môi trường BHI, Martin, Hottinger, VF…, pH từ 7,4 đến 7,8 có bổ sung % huyết ngựa 3.3 Hình thái vi khuẩn Vi khuẩn nhỏ hình gậy mảnh, kích thước từ (0,3 x 0,8) µm đến (0,6 x 2,5) µm, không sinh nha bào Canh khuẩn non, vi khuẩn thường đứng rời chuỗi ngắn, bắt màu Gram dương Canh khuẩn già, vi khuẩn thường tạo thành chuỗi dài có tạo thành sợi dài vào đám tóc rối, khơng hình thành giáp mô, không sinh nha bào, không di động 3.4 Hình thái khuẩn lạc Trên thạch BAB bổ sung % huyết ngựa, ủ 37 oC 24 h, vi khuẩn tạo thành khuẩn lạc tròn, mặt lồi, rìa gọn (dạng S) đường kính khoảng 0,2 mm, suốt giọt sương Trên thạch máu, khuẩn lạc có dạng trên, khơng gây dung huyết 3.5 Kiểm tra tính độc 3.5.1 Chuẩn bị động vật – lợn mẫn cảm, khỏe mạnh, có khối lượng từ 15 kg đến 20 kg – thỏ mẫn cảm, khỏe mạnh, có khối lượng từ 1,5 kg đến 2,0 kg – chuột nhắt trắng khỏe mạnh, có khối lượng từ 18 g đến 20 g 3.5.2 Chuẩn bị giống vi khuẩn Chọn khuẩn lạc, cấy vào mơi trường BHI có bổ sung % huyết ngựa, ủ 37 0C 24 h 3.5.3 Cách tiến hành Tiêm cho lợn với liều 20 ml canh khuẩn theo đường tĩnh mạch Lợn sốt nhẹ (nhiệt độ thể khơng vượt 41 0C) không làm lợn phát bệnh đóng dấu Tiêm cho thỏ với liều ml/con theo đường tĩnh mạch Thỏ khỏe mạnh bình thường Tiêm cho chuột nhắt trắng với liều 0,2 ml/con theo đường da Chuột có phản ứng nặng tỷ lệ chết khơng vượt q 50 % 3.6 Kiểm tra tính gây miễn dịch 3.6.1 Chuẩn bị động vật TCVN 8683-5:2011 Chuẩn bị 26 chuột nhắt trắng khỏe mạnh, có khối lượng từ 18 g đến 20 g 3.6.2 Chuẩn bị giống vi khuẩn Chọn khuẩn lạc, cấy vào mơi trường BHI có bổ sung % huyết ngựa, ủ 37 0C 24 h 3.6.3 Cách tiến hành Tiêm cho 20 chuột nhắt trắng, liều 0,2 ml canh khuẩn theo đường da Sau từ 14 ngày đến 21 ngày, 12 chuột miễn dịch chuột đối chứng công cường độc với hỗn hợp chủng đóng dấu lợn cường độc E37 E80 liều 1000 MLD cho chuột miễn dịch, 10 MLD cho chuột đối chứng 3.6.4 Phương pháp xác định liều ImD 50 chuột nhắt trắng theo công thức ReeMuench Asmarin 3.6.4.1 Chuẩn bị động vật Chuẩn bị 70 chuột nhắt trắng khỏe mạnh, có khối lượng từ 18 g đến 20 g 3.6.4.2 Chuẩn bị giống vi khuẩn Chọn khuẩn lạc, cấy vào mơi trường BHI có bổ sung % huyết ngựa, ủ 37 0C 24 h Đếm số xác định mật độ vi khuẩn tiến hành pha loãng nồng độ cần dùng 3.6.4.3 Cách tiến hành – Tiêm cho chuột nhắt trắng canh khuẩn VR2 với liều vi khuẩn khác 10, 20, 40, 80, 160 vi khuẩn, theo đường da cho năm nhóm chuột, nhóm từ 10 - 14 chuột – Sau 14 - 20 ngày đem chuột sống liều thử thách với 1.000 MLD hỗn hợp chủng đóng dấu lợn cường độc E37 E80 – Theo dõi 10 ngày, tính liều bảo hộ 50 % chuột (ImD 50) theo công thức Reed – Muench Asmarin Liều ImD50 phải đạt 40 ± 30 vi khuẩn 3.6.4.4 Cách tính kết * Phương pháp xác định liều ImD50 chuột nhắt trắng tính theo cơng thức Reed – Muench Lg ImD50 = lgA + a – 50 x d a–b TCVN 8683-5:2011 Trong đó: – A: Liều sát 50 % – a: Tỉ lệ chết (%) liều A – b: Tỉ lệ chết (%) liều B (liều B liều sát 50 %) – d: logarits độ pha loãng (Nếu pha theo bậc mười – 1) * Phương pháp xác định liều ImD50 chuột nhắt trắng tính theo công thức Asmarin lg ImD50 = 0,5 x [(lg DN+lgDN ) – ∑( lg Di+1 –lg Di – 1)] x Li –1 Trong đó: - DN : liều đậm đặc (ở liều 160) - DN - 1: liều tiếp sát với liều DN ( liều 80) - Di+1: liều sát liều i - Di - 1: liều sát liều i - Li : tỷ lệ thập phân số chuột bảo hộ so với chuột đem công liều i - Liều i liều tính tốn - ImD50= anti lg ImD50 - ImD50 nằm khoảng từ 10 - 70 đạt tiêu chuẩn Phương pháp truyền giống 4.1 Chuẩn bị mơi trường – Mơi trường BHI có bổ sung % huyết ngựa – Môi trường thạch BAB có bổ sung % huyết ngựa – Thạch BAB bổ sung % máu cừu 4.2 Chuẩn bị giống vi khuẩn Giống hoàn nguyên trở lại dung tích ban đầu mơi trường BHI, ủ 37 0C 24 h Ria cấy vi khuẩn từ canh khuẩn lên môi trường thạch BAB, ủ 37 0C 24 h TCVN 8683-5:2011 4.3 Cách tiến hành – Chọn khuẩn lạc, ria cấy vào môi trường thạch máu cừu, ủ 37 0C 24 h – Thu hoạch vi khuẩn huyết ngựa, kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn nấm mốc theo TCVN 8684:2011 – Đơng khơ 4.4 Kiểm tra tính an tồn sau đơng khơ 4.4.1 Chuẩn bị động vật – thỏ mẫn cảm, khỏe mạnh, có khối lượng từ 1,5 kg đến 2,0 kg – chuột nhắt trắng khỏe mạnh, có khối lượng từ 18 g đến 20 g 3.4.2 Chuẩn bị giống vi khuẩn Chọn khuẩn lạc, cấy vào môi trường BHI có bổ sung % huyết ngựa, ủ 37 0C 24 h 3.4.3 Cách tiến hành Tiêm cho thỏ, liều ml/con theo đường tĩnh mạch Thỏ khỏe mạnh bình thường Tiêm cho chuột nhắt trắng, liều 0,2 ml/con theo đường da Chuột có phản ứng nặng tỷ lệ chết không vượt 50 % Kiểm tra giống sau đông khô 5.1 Tiêu chuẩn vật lý – Chế phẩm đóng thành bánh, xốp, màu đồng nhất, có chân khơng – Độ ẩm: khơng lớn % – Độ hòa tan: lắc nhẹ nước sinh lý, chế phẩm tan trở lại dung dịch ban đầu vòng đến 5.2 Yêu cầu kỹ thuật Giống đông khô phải đạt yêu cầu Điều Bao gói, ghi nhãn bảo quản TCVN 8683-5:2011 6.1 Bao gói Giống sau đơng khơ bao gói giấy, để túi nhựa 6.2 Ghi nhãn - Nơi sản xuất - Tên giống - Số lô…ngày…tháng…năm… sản xuất - Người thực - Điều kiện bảo quản 6.3 Bảo quản Giống giữ nhiệt độ từ đến 0C năm 10 TCVN 8683-5:2011 Thư mục tài liệu tham khảo [1] Diseases of Swine (8th edition)/Chapters 31 _ 11 .. .TCVN 8683-5:2011 Lời nói đầu TCVN 8683-5:2011 chuyển đổi từ 10 TCN 229:1995 thành tiêu chuẩn quốc gia theo quy định khoản Điều 69 Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật điểm a... chi tiết thi hành số điều Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật; TCVN 8683-5:2011 Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định,... cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố TCVN 8683-5:2011 TIỂU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8683-5:2011 Giống vi sinh vật thú y – Phần 5: Quy trình giữ giống vi khuẩn